Akademia Górniczo-Hutnicza
Kierunek:
Nazwisko i Imię
Temat ćwiczenia:
Data wykonania ćwiczenia:
12.06.2015

Transformacja kompetentnych komórek E.coli.

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia była transformacja kompetentnych komórek E.coli z wykorzystaniem plazmidowym konstruktów genetycznych oraz sprawdzenie odporności bakterii z plazmidami na antybiotyki.

1. Odczynniki chemiczne

- kompetentne komórki Escherichia coli

- konstrukt plazmidowy peT15c

- ampicylina 100 μg/ml

- sterylna woda destylowana

- agar odżywczy

- bulion odżywczy

1. Sprzęt laboratoryjny

- szalki Petriego

- łaźnia parowa

- termometr

-pipeta automatyczna

- ezy jednorazowe

- falkony

1. Przebieg doświadczenia

1. Przygotowanie sprzętu i pożywek

1. Przygotowano 30 ml bulionu odżywczego oraz dwie porcje po 50 ml agaru spożywczego.

2. Przygotowane pożywki wysterylizowano w autoklawie.

3. Przygotowano falkon o pojemności 15 ml i 4 plastikowych szalek Petriego.

1. Transformacja bakterii

1. Rozmrożono bakterie w łaźni wodno – lądowej.

2. Przygotowano 2 próbki plastikowe (typu eppendorf) na bakterie.

3. Dodano 10 µl plazmidu do jednej z próbek zawierającej bakterię.

4. Wykonano próbę kontrolną polegającą na dodaniu 10 µl wody do drugiej próbki zawierającej bakterię.

5. Przeprowadzono inkubację w lodzie trwającą ok. 15 – 45 minut.

6. Przeprowadzono inkubację w 42 ^oC trwającą 30 sekund.

7. Przeprowadzono kolejną inkubację w lodzie trwającą 2 minuty.

8. Przeniesiono bakterie z plazmidem do falkonu o pojemności 15 ml i dodano 1 ml bulionu spożywczego.

9. Przeprowadzono inkubację w 37 ^oC trwającą 20 minut.

10. Zwirowano bakterie w wirówce przez 2 minuty przy obrotach 10 000RPM.

11. Przygotowano pożywki na szalkach Petriego.

• 2 szalki z pożywką w formie agaru odżywczego.

• 2 szalki z pożywką w formie agaru odżywczego z ampicyliną.

1. Wysiano bakterie z plazmidem oraz bakterie z wodą (kontrolna transformacja) na oba typy pożywek.

2. Tak przygotowane podłoża umieszczono w cieplarce w temperaturze ok. 37 ^oC na 24 godziny.

1. Wnioski