585

Nr 7–8

R. Zych i wsp.

Dorota M. Olszewska-Słonina, Tomasz A. Drewa

HODOWLA KOMÓREK, INŻYNIERIA TKANKOWA

I MEDYCYNA REGENERACYJNA. CZĘŚĆ I

Z Katedry i Zakładu Biologii Medycznej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy

Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu

G. Gajer i wsp.

A. Warchala i wsp.

Wpływ penicyliny na procesy enzymatyczne

Wpływ penicyliny na procesy enzymatyczne

Choroba Gravesa i Basedowa

Biopsja wątroby

Nowotworowa niedrożność jelita grubego

WIADOMOŚCI LEKARSKIE 2006, LIX, 7–8

Inżyniera tkankowa jest interdyscyplinarną dziedziną, która przystosowała zasady rządzące inżynierią oraz hodowlą komórek w celu

wytworzenia biologicznych materiałów zastępczych, mogących odbudować, utrzymać bądź poprawić funkcje tkanek. Połączeniem inżynierii

z medycyną naukowcy interesują się już od co najmniej 2 stuleci. W jakim celu hodowano komórki? Pierwotnie dla postępu w zakresie badań

podstawowych, a następnie w badaniach toksykologicznych i wirusologicznych. Prowadzenie badań in vitro podyktowane jest m.in. proble-

mami z przeprowadzaniem doświadczeń na zwierzętach. W niniejszej pracy przybliżono starania lekarzy, anatomopatologów, embriologów

i biologów, które przyczyniły się do szybkiego rozwoju inżynierii tkankowej. [Wiad Lek 2006; 59(7–8): 585–589]

Słowa kluczowe: hodowla tkankowa, hodowla komórkowa, inżynieria tkankowa.

Inżynieria tkankowa staje się głównym motorem

rozwoju medycyny regeneracyjnej. Prace w tym zakre-

sie skupiały się na możliwościach połączenia komórek

otrzymywanych w hodowli in vitro z biodegradowalnymi

matrycami przestrzennymi [1,2]. Do produkcji matryc

stosuje się różne polimery, np. kwas polimlekowy czy

poliglikolowy. Matryce przestrzenne ułatwiają wzrost

i namnażanie komórek, które swoją budową imitują

tkankę. Dotychczasowe doświadczenia w inżynierii

tkankowej prowadzono przede wszystkim z użyciem

zróżnicowanych komórek diploidalnych, mają one jed-

nak ograniczone zdolności podziału.

Medycyna regeneracyjna jest dyscypliną nową,

wywodzącą się z prac doświadczalnych prowadzonych

pod koniec lat 90. ubiegłego wieku na bazie inżynierii

tkankowej. Jej zadaniem jest szeroko pojęte wspo-

maganie procesów gojenia i naprawy tkanek poprzez

stosowanie czynników wzrostu, terapii genetycznej oraz

przeszczepów komórek [3,4,5]. Medycyna regeneracyjna

jest dziedziną interdyscyplinarną, obecny jej rozwój

wskazuje, iż w niedługim czasie stanie się odrębną spe-

cjalnością medyczną.

Komórka to najmniejsza jednostka strukturalna

żywego organizmu zwierzęcego lub roślinnego, stano-

wiąca podstawę budowy wszystkich roślin i zwierząt.

Zbudowana jest z zamkniętej błoną komórkową masy

cytoplazmatycznej, zawierającej jądro komórkowe [6].

Tkanka jest zbiorem podobnych komórek wraz z sub-

stancją międzykomórkową je otaczającą [7]. Termin

„hodowla tkankowa” ma charakter uniwersalny i odnosi

się zarówno do hodowli komórkowej, jak i hodowli

eksplantu tkanki.

Zagadnieniami budowy świata organicznego zaj-

mowali się już starożytni atomiści, m.in. Anaksagoras

z Kladzomen (ok. 500–428 p.n.e.), grecki filozof, którego

poglądy podjął i rozwinął później Lukrecjusz. Zdaniem

Anaksagorasa, rzeczywistość jest zbudowana z materii

złożonej z nieskończonych i niezmiennych „nasion”

rzeczy (gr.

homojomerie) oraz nieskończonego, wiecz-

nego, jedynego, wszystkowiedzącego i samowładnego

rozumu (gr. nous), wprawiającego w ruch elementy

Ryc. 1. Mikrografia tkanki roślinnej – korka, uzyskana przez

Roberta Hooke’a (1665 r).

VARIA

586

Nr 7–8

Inżynieria tkankowa

materii i powodującego ich łączenie i rozłączanie.

Dzieło Anaksagorasa O przyrodzie znane jest tylko we

fragmentach. Rzymianin Titus Lucretius Carus był kon-

tynuatorem filozofii Epikura. Napisał poemat O naturze

wszechrzeczy, w którym wszystkie zjawiska tłumaczył

za pomocą teorii atomistycznych [8].

W 1665 r. Robert Hooke obserwował obecność

w tkankach kompartmentów (łac. cellula). Swoje bada-

nia opublikował w dziele Mikrografia (ryc. 1) [9,10].

Po raz pierwszy komórkę obserwowano w mikroskopie

dopiero 170 lat później (1830 r.). Matthias Schleiden

i Theodor Schwann (ryc. 2, 3) rozwinęli teorię komór-

kową. Przyjęto, że wszystkie organizmy zbudowane są

z komórek. Rudolf Virchow (ryc. 4) jest autorem słów

„Omnis cellula a cellula” (wszystkie komórki pochodzą

z komórek).

Na funkcjonowanie komórki mogą wpływać zabu-

rzenia w budowie i funkcji jednego z jej licznych orga-

nelli (ryc. 5). Jądro komórkowe zawiera chromosomy

z informacją genetyczną w postaci DNA – prawdziwą

„pamięć” komórki reprezentowaną przez około 25 000

genów (genom). Informacja genetyczna pozwala na iden-

tyczny przebieg podziałów komórek i ich prawidłowe

funkcjonowanie; DNA zawiaduje syntezą białek i wszel-

kich innych substancji niezbędnych do życia komórce.

Może on podlegać modyfikacjom czy mutacjom. Główną

konsekwencją mutacji jest nabycie przez komórkę cech

„nieśmiertelności”, co oznacza, że może ona namnażać

się w hodowli in vitro w sposób nieskończony, w przeci-

wieństwie do komórek prawidłowych, umierających po

określonej liczbie podziałów, co zaobserwował Alexis

Carrel. Z nieprawidłowej komórki posiadającej liczne

mutacje mogą powstać komórki nowotworowe.

Ryc. 4. Rudolf Virchow (1821–1902).

Ryc. 2. Matthias Schleiden (1804–1881).

Ryc. 3. Theodor Schwann (1810–1882).

Ryc. 5. Komórka i organella komórkowe.

587

Nr 7–8

Rozwój biologii komórki, biologii molekularnej, in-

żynierii tkankowej i wielu dziedzin pokrewnych pozwala

poznać strukturę i funkcję komórek oraz ich organelli,

a także określić wpływ wielu substancji na morfologię

komórek, ich ultrastrukturę, aktywność wielu enzymów,

zdolność do podziałów, czyli tzw. aktywność mitotyczną

oraz zdolność do przemieszczania się komórek.

Próbę hodowli komórek zwierzęcych pierwszy podjął

Alfred Vulpian (1826–1887; ryc. 6). Prowadził on prace

kliniczne z dziedziny neurofizjologii (m.in. odkrył me-

chanizm działania kurrary na komórki nerwowe). Jego

prace poprzedziły doświadczenia Carla F.W. Ludwiga

(1816–1895), który opracował techniki perfuzji narzą-

dów po ich usunięciu z ciała (1856). Pobrane narządy

były utrzymywane ex vivo dzięki przepompowywaniu

przez nie krwi. W 1859 r. Vulpian wyizolował fragmenty

ogona kijanki i próbował hodować je w wodzie. Mimo iż

komórki przeżyły, nie namnażały się. Doświadczenie to

dostarczyło jedynie informacji o możliwości przeżycia

komórek poza organizmem [11].

wprowadzał dodatkowe substancje (np. krew i albumi-

nę), obserwując ich wpływ na bijące serce. Wykazano, że

przedłużający się rozkurcz komór, indukowany czystym

roztworem chlorku sodu, jest odwracalny po dodaniu

krwi i albuminy. Ringer zademonstrował także, że do

utrzymania normalnej akcji serca ex vivo konieczne jest

dodanie małych ilości wapnia do płynu, w którym jest

ono zanurzone. Badacz udowodnił, iż funkcjonowanie

izolowanych narządów przez długi okres czasu jest

możliwe dzięki niewielkim ilościom potasu dodanym do

normalnego roztworu chlorku sodu [12,13].

W 1885 r. embriologowi niemieckiemu, Wilhelmowi

Roux (1850–1924), udało się utrzymać w ogrzewanym

roztworze soli płytkę nerwową uzyskaną z zarodka

kurczaka.

Próby hodowli komórek in vitro

zostały uwieńczone

sukcesem w 1903 r. Francuz Justin Jolly

(1870–1953)

wykorzystując prace botanika niemieckiego Gotlieba

Haberlanda (które zakończyły się porażką w hodowli

komórek roślinnych – Haberland opracował pożywkę

hodowlaną, dzięki której uzyskał zwiększenie rozmiarów

komórek, lecz nie ich namnażanie) prowadził hodowlę

jądrzastych krwinek czerwonych trytona. Krwinki in vitro

ulegały podziałom przez 15 dni, po czym rytm podziałów

komórkowych stopniowo ulegał zwolnieniu, a po kilku

miesiącach zatrzymaniu [14].

Trzy lata później Charles William Beebe (1877–1962)

wraz z Jamesem Ewingiem (1866–1943) zdołali utrzymać

in vitro komórki chłoniakomięsaka pochodzące od psa.

Pożywką dla komórek było osocze [15,16]. Największym

problemem był dobór podłoża odpowiedniego do wzrostu

danej linii komórkowej. Opracowana w 1910 r. przez

Maurice Vejux Tyrode (1878–1930) receptura roztworu

soli nieorganicznych, mniej specyficznego niż roztwór

Ringera, znalazła zastosowanie w pierwotnej hodowli

komórek ssaków [17]. Roztwór ten służył do rozcieńczania

białkowych składników podłoży do hodowli pochodzenia

naturalnego i jest do dziś używany jako płyn nawadniają-

cy, służący do transportowania i rozcieńczania zawiesin

komórkowych z zachowaniem wewnątrz- i zewnątrzko-

mórkowej równowagi osmotycznej.

W 1907 r. w Stanach Zjednoczonych Ross G. Har-

rison uzyskał in vitro zróżnicowane komórki nerwowe

nerwu promieniowego embrionów płazów. Pierwsze

obserwacje Harissona dotyczyły żaby, której komórki

nie są „wymagające” w hodowli. Badacz wykorzystał

komórki żaby, zwierzęcia zmiennocieplnego, ponieważ

nie wymagały one inkubacji. Zademonstrował wzrost

żyjącej tkanki zwierzęcej poza organizmem, izolując

fragment struny nerwowej kijanki i umieszczając go

w kropli limfy. Wykazał, że komórki nerwowe charak-

teryzują się własnym wzrostem i wydłużają się zależnie

od potrzeb [18,19]. Opracował technikę hodowli komó-

rek „w kropli wiszącej”, a wraz z Montrose T. Burrows

technikę hodowania komórek w kropli zakrzepłego na

mikroskopowym szkiełku podstawowym osocza. Har-

Ryc. 6. Alfred Vulpian (1826–1887).

W latach 1880–1882 angielski lekarz Sydney Rin-

ger (1835–1910; ryc. 7) prowadził doświadczenia nad

wpływem składników krwi na pracę mięśnia sercowego

zwierząt. Opracował skład roztworu soli nieorganicz-

nych, który pozwolił na uzyskanie regularnych skurczów

zanurzonego w nim serca żaby. Początkowo stosowano

0,75% roztwór NaCl, do którego stopniowo Ringer

Ryc. 7. Sydney Ringer (1835–1910).

D. Olszewska-Słonina, T. Drewa

588

Nr 7–8

rison był dwukrotnie – w 1917 i 1933 r. – kandydatem

do nagrody Nobla, nigdy jednak jej nie otrzymał: w

1917 r. jury nie przyznało żadnej nagrody w dziedzinie

medycyny, zaś w 1933 r. wartość opracowanych pr

zez

niego metod hodowli tkankowej uznano za ograniczoną.

Ross Harrison przez wielu uważany jest za twórcę metod

stosowanych w hodowli komórkowej.

Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny

w 1912 r. otrzymał Alexis Carrel (1873–1944; ryc. 8).

Jego badania dotyczyły głównie chirurgii eksperymen-

talnej, transplantacji tkanek i całych narządów [20].

Carrel specjalizował się w chirurgii klatki piersiowej,

a zwłaszcza we wszczepianiu zastawek do serca. Współ-

pracował on z wieloma naukowcami, m.in. z Burrowsem

i Geyem. Montrose Thomas Burrows, asystent Carrela,

został przez niego wysłany do laboratorium Harrisona, aby

nauczyć się technik hodowli komórkowej, które można

by później zaadaptować do badań nad zwierzętami stało-

cieplnymi. W latach 1911–1912 Burrows i Carrel z powo-

dzeniem utrzymywali w hodowli eksplanty pochodzące

od dorosłych psów, kotów, szczurów i świnek morskich,

a także tkanki nowotworowe. Carrel starał się udoskonalić

aseptyczne techniki hodowli i wykazał, że dzięki wyko-

rzystaniu ekstraktu z zarodków, możliwe jest utrzymy-

wanie komórek ex vivo przez długie lata. Carrel uzyskał

hodowlę ciągłą przez regularne pasażowanie fibroblastów

z serca kurczaka do świeżej pożywki hodowlanej. Sukces

osiągnął dzięki użyciu pożywki podstawowej, jaką było

osocze krwi, do którego dodał wyekstrahowane z płodów

czynniki wzrostu [21].

Hodowlę linii komórkowej stworzonej przez Carrela

kontynuował przez 34 lata Albert H. Ebeling. Używał on

tej hodowli do testowania środków bakteriobójczych [22].

Dziesięć lat później Ebelingowi udało się założyć hodowlę

komórek nabłonkowych. Opracowano techniki hodowli

komórkowej w płaskich naczyniach hodowlanych, tzw.

T-flasks (1923 r.). W 1933 r. Carrel wraz z George Otto

Geyem przedstawili technikę hodowli w butelkach

w kształcie walca, tzw. roller tube. Badania te dały pod-

stawy eksperymentom wirusologicznym i stworzeniu

szczepionek, m.in. przeciwko wirusowi poliomyelitis

i odry. Dzięki osiągnięciom Alexisa Carrela możliwe stało

się hodowanie komórek na dużą skalę.

W 1916 r. Peyton Rous (ryc. 9) i S.F. Jones po raz

pierwszy użyli enzymu proteolitycznego, trypsyny,

w celu oddysocjowania pojedynczych komórek od

Ryc. 9. Peyton Rous (1879–1970).

Ryc. 8. Alexis Carrel (1873–1944).

fragmentów tkanki. Oddysocjowane komórki umiesz-

czono w pożywce hodowlanej, uzyskując zawiesinę

żywych komórek [23]. Wcześniej hodowle otrzymywano

z niewielkich eksplantów tkanki, które przytwierdzano

do ściany naczynia. Z takiego eksplantu komórki speł-

zały i pokrywały powierzchnie naczynia hodowlanego.

Komórki takie nie są w stanie odtworzyć struktury

tkankowej. Eksplant początkowy ulegał dezorganizacji

i obumierał. Były to więc hodowle komórkowe, a nie

tkankowe. Hodowle takie były możliwe, ponieważ

większość hodowanych komórek charakteryzuje się

wzrostem zależnym od zakotwiczenia.

Pierwsza połowa ubiegłego stulecia zaowocowała

wieloma sukcesami w dziedzinie rozwoju hodowli ko-

mórkowej (tab. I), lecz dopiero w latach 50. opanowanie

metod zakładania pierwotnych hodowli komórek ptaków

i ssaków (zwierzęta stałocieplne) przyczyniło się do

szybkiego rozwoju technik hodowli tkankowej.

Piśmiennictwo

[1] Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science 1993; 260: 920–926. [2] Skalak R, Fox CF (eds.). Tissue Engineering, Alan R. Liss Inc., New York

1988, preface page xx. [3] Vacanti JP, Langer R. Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and

transplantation. Lancet 1999; 354(supl. 1): SI32–SI34. [4] Sipe JD. Tissue engineering and reparative medicine. Ann N Y Acad Sci 2002; 961: 1–9. [5] Langer R,

Vacanti JP. Artificial organs. SciAm 1995; 273(3): 130–133. [6] Stedman TL. Stedman’s Medical Dictionary. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1982, 241. [7]

Stedman TL. Stedman’s Medical Dictionary. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1982, 1456. [8] Lukrecjusz [Titus Lucretius Carus]. O naturze wszechrzeczy.

Przekł. E. Szymański, komentarz K. Leśniak. PWN. Warszawa 1957. [9] Hooke R. Micrographia: or some physiological descriptions of minute bodies made by

magnifying glasses. 1665. [10] Mulligan L. Robert Hooke’s „Memoranda”: memory and natural history. Ann Sci 1992; 49, 47–61.

Inżynieria tkankowa

589

Nr 7–8

[11] Pearce JM. Edmé Félix Alfred Vulpian (1826-1887). J Neurol 2002; 249(12): 1749–1750. [12] Zimmer HG. Sydney Ringer, serendipity and hard

work. Clin Cardiol 2005; 28: 55–56. [13] Orchard CH, Eisner DA, Allen DG. Sydney Ringer viewed in a new light. Cardiovasc Res 1994; 28: 1765–1768. [14]

Laubry C. Justin Jolly (1870–1953). Rev Hematol 1953; 8(2): 230–234. [15] Huvos AG. James Ewing: cancer man. Ann Diagn Pathol 1998; 2(2):146-148. [16]

Zantinga AR, Coppes MJ. James Ewing (1866–-1943): „the chief”. Med Pediatr Oncol 1993; 21(7): 505–510. [17] Tyrode MV. The mode of action of some

purgative salts. Arch Int Pharmacodyn Ther 1910; 20: 205–223. [18] Harrisson RG. Observations on the living developing nerve fiber. Proc Soc Exp Biol Med

1907; 4: 140–143. [19] Gahwiler BH. Nerve cells in culture: the extraordinary discovery of Ross Granville Harrison. Brain Res Bull 1999; 50(5–6): 343–344.

[20] Carrel A. On the permanent life of tissue outside the organism. J Exp Med 1912; 15: 516–528.

[21] Carrel A. The preservation of tissues and its applications in surgery. 1912. Clin Orthop 1992; 278: 2–8. [22] Ebeling, AH. The permanent life of connective

tissue outside of the organism. J Exp Med 1913; 17: 273–285. [23] Rous P, Jones FS. A method for obtaining suspensions of living cells from fixed tissues, and

for the plating out of individual cells. J Exp Med 1916; 23: 549–555.

Adres autorów: Dorota Olszewska-Słonina, Katedra i Zakład Biologii Medycznej CM UMK, ul. Karłowicza 24, 85-092 Bydgoszcz, tel. [phone],

fax [phone], e-mail: [e-mail]

D. Olszewska-Słonina, T. Drewa

CELL CULTURE, TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE.

PART I

Summary

Tissue engineering is an interdisciplinary field that applies the principles and methods of engineering and the cell culture toward the deve-

lopment of biomaterials that restore, maintain or improve tissue function. The amalgamation of engineering and medicine has interested many

scientists for at last two hundred years. What was the goal of cell culture? First, for progress in life sciences achievement and subsequent for

virology and toxicology development. In vitro studies are done because of many problems with carrying out animal experiments. In this work

the authors present the attempts of physicians, anatomopathologists, embryologists and biologists which contributed to fast development of

new area in medicine – tissue engineering.

Key words: tissue culture, cell culture, tissue engineering.

D. Olszewska-Słonina, T. Drewa