WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI ŚLĄSKIEJ

W GLIWICACH

K

ATEDRA

C

HEMII

O

RGANICZNEJ

, B

IOORGANICZNEJ

I

B

IOTECHNOLOGII

Ć

WICZENIE

7

E

NZYMATYCZNA REDUKCJA

AROMATYCZNYCH ZWIĄZKÓW NITROWYCH

Opracowała: mgr inż. Agnieszka Październiok – Holewa

Prowadzący: mgr inż. Agnieszka Październiok – Holewa

Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych

2

I. CEL ĆWICZENIA:

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie katalizowanej enzymatycznie redukcji

1,2-dinitrobenzenu i 2,4-dinitroanizolu, odpowiednio, do 2-nitroaniliny i 2-metoksy-5-
nitroaniliny przy użyciu drożdży piekarskich.

I. WPROWADZENIE:

Bezpośrednia redukcja aromatycznych związków nitrowych stanowi ważną reakcję

otrzymywania amin aromatycznych, będących cennymi reagentami stosowanymi w syntezie
organicznej. Redukcję tą przeprowadza się metodą katalitycznego uwodornienia lub za
pomocą wielu odczynników, np.: metali (Zn, Sn, Fe lub nieraz inny metal) w obecności
kwasu, siarczków ( NaHS lub (NH

4

)

2

S), hydrazyny wobec katalizatora.

Selektywną redukcję 1,2-dinitrobenzenu i 2,4-dinitroanizolu odpowiednio, do 2-

nitroaniliny i 2-metoksy-5-nitroaniliny można przeprowadzić zarówno metodą katalitycznego
uwodornienia, jak również w przypadku 1,2-dinitrobenzenu używając siarczku amonu
(Schemat 1, Schemat 2).

NO

2

NO

2

NH

2

NO

2

Metoda

Wydajność

[%]

I: (NH

4

)

2

S/EtOH

-

II: Ni Raney’a, kwas octowy, 2-propanol, reflux

74

III: Ni, kwas maleinowy, kwas octowy, reflux

81

IV: Pd-C, cykloheksen, etanol, reflux

-

Schemat 1

OCH

3

NO

2

NO

2

OCH

3

NH

2

NO

2

Metoda

Wydajność

[%]

I: Pd-C, Et

3

N, kwas mrówkowy, reflux, 5 min

24

II: N

2

H

2

, Ni Raney’a, MeOH, 40-50

o

C

8

Schemat 2

Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych

3

Alternatywą w stosunku do opisanych powyżej chemicznych metod redukcji jest

redukcja aromatycznych związków nitrowych z użyciem biokatalizatora. Reakcja ta
charakteryzuje się wysoką regio- i chemoselektywnością.

Przemianę nitrobenzenu do aniliny z udziałem drożdży piekarskich zaobserwowali po

raz pierwszy Neuberg i Welde już w 1914 r. Wśród wielu mikroorganizmów drożdże
piekarskie (Saccharomyces cerevisiae, ang. bakers’ yeast) stanowią cenny biokatalizator.
Swoją popularność zawdzięczają nieograniczonej dostępności (światowa produkcja ok. 600
ton/rok), niskiej cenie oraz łatwości hodowli (nie jest konieczne doświadczenie
mikrobiologiczne, sterylne warunki ani specjalistyczne wyposażenie). Reakcje za pomocą
drożdży wykonuje się w warunkach fermentacyjnych w środowisku wodnym lub w
rozpuszczalnikach organicznych. W warunkach wodnych żywe komórki syntezują i
regenerują enzymy i kofaktory, niezbędne do prowadzenia metabolizmu, co umożliwia
zredukowanie ilości drożdży, ale często komplikuje izolację produktu lub nie daje się
zastosować do nierozpuszczalnych w wodzie substratów. W środowisku organicznym
wykorzystuje się wyłącznie zawarte w komórkach enzymy i kofaktory bez możliwości ich
regeneracji, co narzuca konieczność zwiększenia ich ilości.

Badania wykazały, że przebieg redukcji monopodstawionych nitrobenzenów silnie

zależy od charakteru podstawnika. Jeśli związek zawiera grupę elektronodonorową (np.: NH

2

,

OH, SH, OCH

3

, CH

3

, Br) to wydajność reakcji redukcji jest niska lub w ogóle ona nie

zachodzi. Jeżeli podstawnik ma charakter elektronoakceptorowy (np.: NO

2

, CN, CF

3

, COOEt)

redukcja nitrobenzenów zachodzi łatwo z dobrymi wydajnościami. Przykładem tego jest
katalizowana drożdżami redukcja 1,2-dinitrobenzenu, w rezultacie której powstaje 2-
nitoranilina z wysoką wydajnością, porównywalną z wydajnościami otrzymywanymi w
redukcji metodami chemicznymi (Schemat 3).

NO

2

NO

2

NO

2

NH

2

drozdze

woda, 30

o

C

50-70%

Schemat 3

Prowadząc w analogicznych warunkach selektywną redukcję 2,4-dinitroanizolu

otrzymać można 2-metoksy-5-nitroaniliną z wydajnością wyższą niż otrzymana metodami
chemicznymi (Schemat 4).

OCH

3

NO

2

NO

2

OCH

3

NH

2

NO

2

drozdze

woda, 30

o

C

59%

Schemat 4

Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych

4

III. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA:

Z

AGROŻENIA

: Nitrobenzen i anilina oraz ich pochodne są substancjami działającymi

toksycznie na organizm ludzki przez drogi oddechowe oraz skórę.

ŚRODKI OSTROŻNOŚCI: W czasie pracy należy zachować ostrożność!!! Stosuj
ubranie ochronne (fartuch), rękawice ochronne oraz okulary.

Ćwiczenie A. Redukcja 1,2-dinitrobenzenu do 2-nitroaniliny przy użyciu
drożdży piekarskich (Schemat 3)

Odczynniki:

1,2-dinitrobenzen (2,98 mmola, 0,5 g)

drożdże piekarskie (Saccharomyces cerevisiae), (50 g)

woda destylowana (200 cm

3

)

alkohol etylowy (5 – 8 cm

3

)

Celite ® lub Hyflo supercel

octan etylu

eter naftowy

2 molowy wodny roztwór wodorotlenku sodu

chlorek sodu

wata

Wykonanie:

1) W kolbie Erlenmayera o pojemności 500 cm

3

umieść 200 cm

3

wody destylowanej

oraz 50 g suchych drożdży. Następnie delikatnie zatkaj szyję kolby korkiem z waty i
umieść kolbę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30

0

C (200 obr./min.) na 2 – 3

godziny.

2) Odważ 0,5 g 1,2-dinitrobenzenu i umieść w probówce, następnie rozpuść w

minimalnej ilości alkoholu etylowego, a otrzymany roztwór wlej w sam środek
mieszaniny wyjętej z wytrząsarki.

3) Ponownie kolbę umieść w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30

0

C (200 obr./min.)

na 24 godziny.

Kontrola postępu reakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

W celu kontroli postępu reakcji pobierz próbkę mieszaniny reakcyjnej (ok. 25 – 30

cm

3

) i zmieszaj ją z celitem (2 – 3 g). Otrzymaną mieszaninę przesącz przez złoże mokrego

celitu i oddzielone drożdże przemyj octanem etylu (25 cm

3

). Uzyskane roztwory połącz.

Odczyn przesączu doprowadź do pH = 7 przy użyciu 2 molowego roztworu NaOH, a
następnie fazę wodną nasyć stałym NaCl. Całość dokładnie wymieszaj, po czym fazę
organiczną oddziel i zatęż do objętości ok. 4 – 5 cm

3

. Skład przygotowanej próbki sprawdź

metodą TLC [układ rozwijający: eter naftowy/octan etylu, 1:1 (v/v); 1,2-dinitrobenzen R

f

=

0,4 (w świetle lampy UV), 2-nitroanilina R

f

= 0,55 (jasnożółta plamka widoczna w świetle

dziennym)].

Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych

5

4) Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaj celit (25 – 30 g) i pozostaw na

30 minut od czasu do czasu mieszając. Następnie zawiesinę przesącz na lejku
Büchnera przez złoże mokrego celitu, a pozostałe na lejku drożdże przemyj wodą
destylowaną (100 cm

3

). Odczyn przesączu doprowadź do pH = 7 za pomocą 2

molowego wodnego roztworu NaOH, a następnie nasyć go stałym NaCl.

5) Oddzielone drożdże przemyj octanem etylu (2 ×100 cm

3

), a otrzymany przesącz użyj

do ekstrakcji roztworu wodnego nasyconego NaCl z pkt. 4.

6) Metodą TLC sprawdź czy w ekstahowanej fazie wodnej znajduje się jeszcze pożądany

produkt. Jeżeli faza wodna zawiera 2-nitroanilinę to należy powtórzyć ekstrakcję
jeszcze jedną porcją octanu etylu (100 cm

3

).

7) Ekstrakty organiczne połącz i wysusz bezwodnym siarczanem (VI) magnezu.

Następnie środek suszący odsącz i odparuj rozpuszczalnik na wyparce rotacyjnej.
Surowy produkt oczyść metodą chromatografii kolumnowej [eluent: eter
naftowy/octan etylu 10:1 następnie 4:1 (v/v)]. Wydajność uzyskanej 2-nitroaniliny o
temp. topnienia 72-74

o

C (pomarańczowe igły) wynosi 54% (0,22 g).

Ćwiczenie B. Redukcja 2,4-dinitroanizolu do 2-metoksy-5-nitroaniliny przy
użyciu drożdży piekarniczych (Schemat 4)

Odczynniki:

2,4-dinitroanizol (2,53 mmola, 0,5 g)

drożdże piekarskie (Saccharomyces cerevisiae), (70 g)

woda destylowana (200 cm

3

)

alkohol etylowy (5 cm

3

)

Celite ®

octan etylu

2 molowy wodny roztwór wodorotlenku sodu

chlorek sodu

wata

Wykonanie:

1) W kolbie Erlenmayera o pojemności 500 cm

3

umieść 200 cm

3

wody destylowanej

oraz 50 g suchych drożdży. Następnie delikatnie zatkaj szyję kolby korkiem z waty i
umieść kolbę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30

0

C (200 obr./min.) na 2

godziny.

2) Odważ 0,5 g 2,4-dinitroanizolu i umieść w probówce, następnie rozpuść w minimalnej

ilości alkoholu etylowego, a otrzymany roztwór wlej w sam środek mieszaniny
wyjętej z wytrząsarki.

3) Ponownie kolbę umieść w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30

0

C (200 obr./min.)

na 60 godzin.

Kontrola postępu reakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

W celu kontroli postępu reakcji pobierz próbkę mieszaniny reakcyjnej (ok. 25 – 30

cm

3

) i zmieszaj ją z celitem (2 – 3 g). Otrzymaną mieszaninę przesącz przez złoże mokrego

celitu i oddzielone drożdże przemyj octanem etylu (25 cm

3

). Połącz ze sobą uzyskane

roztwory. W razie konieczności odczyn przesączu doprowadź do pH = 7 przy użyciu 2

Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych

6

molowego roztworu NaOH i nasyć fazę wodna NaCl. Całość dokładnie wymieszaj, po czym
fazę organiczną oddziel i zatęż do objętości ok. 4 – 5 cm

3

. Skład przygotowanej próbki

sprawdź metodą TLC [układ rozwijający: eter naftowy/octan etylu, 2:1 (v/v); 2-metoksy-5-
nitroanilina R

f

= 0,42 (w świetle lampy UV i jasno żółta plamka widoczna w świetle

dziennym), 2,4-dinitrobenzen R

f

= 0,35 (w świetle lampy UV), 4-metoksy-5-nitroanilina R

f

=

0,21 (w świetle lampy UV i jasno żółta plamka widoczna w świetle dziennym)].

4) Do mieszaniny dodaj kolejną porcję drożdży (10 g) i inkubację mieszaniny prowadź w

temperaturze 30

0

C w wytrząsarce orbitalnej (200 obr./min.) przez kolejne 24 godziny.

5) Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodaj celit (10 g) i pozostaw na 30

minut od czasu do czasu mieszając. Następnie zawiesinę przesącz na lejku Büchnera
przez 10 cm złoże mokrego celitu z dwoma sączkami. W razie konieczności odczyn
przesączu doprowadź do pH = 7 za pomocą 2 molowego wodnego roztworu NaOH, a
następnie nasycić go NaCl.

6) Oddzielone drożdże przemyj porcjami octanu etylu (całość ok. 300 cm

3

), a otrzymany

przesącz użyj do ekstrakcji roztworu wodnego nasyconego NaCl z pkt. 5.

7) Fazę wodną poddaj ponownie ekstrakcji świeżą porcją octanu etylu (200 cm

3

).

8) Ekstrakty organiczne połącz i wysusz bezwodnym siarczanem (VI) magnezu. Środek

suszący odsącz i rozpuszczalnik odparuj na wyparce rotacyjnej. Surowy produkt
oczyszczaj metodą chromatografii kolumnowej [eluent: eter naftowy/octan etylu 4:1
(v/v)]. Wydajność uzyskanej 2-metoksy-5-nitroaniliny (pomarańczowe igły) wynosi
39% (0,12 g) o temperaturze topnienia 114.5 – 115

0

C.

IV. PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ:

1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki
laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej.
2. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: katalizator, enzym, kataliza enzymatyczna,
utlenienie, redukcja, selektywność, regioselektywność.
3. Zastanów się czy wiesz:

a) jakie są chemiczne metody redukcji aromatycznych związków nitrowych,
b) na czym polega specyficzność katalizy enzymatycznej.

4. Porównaj reakcję redukcji wybranego przez siebie aromatycznego związku nitrowego
przeprowadzoną metodą chemiczną z reakcją z użyciem biokatalizatora - opisaną w
instrukcji. Jakie wady i zalety dostrzegasz w obu metodach redukcji? (Przepis na reakcję
redukcji aromatycznych zw. nitrowych metodą chemiczną znajdziesz w podręcznikach do
preparatyki organicznej).

IV. WARUNKI ZALICZENIA :

1. Poprawne napisanie kartkówki.
2. Staranne wykonanie części eksperymentalnej.
3. Napisanie i oddanie sprawozdania do 2 tygodni (forma sprawozdania zostanie podana

przez prowadzącego w czasie trwania zajęć).

V. LITERATURA :

[1]

J. March, „Chemia organiczna. Reakcje, mechanizmy, budowa.” WNT, W-wa 1975

[2]

Roberts S.M.(ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and Isolated enzymes in

Organic Synthesis, 1992, Wiley, London.

Enzymatyczna redukcja aromatycznych związków nitrowych

7

[3] J. Gawroński, K. Gawrońska, K. Kacprzak, M. Kwit, „Współczesna synteza organiczna.

Wybór eksperymentów.” PWN, W-wa 2004

[4] P. Karlson „Zarys biochemii” PWN, W-wa 1987
[5] S. Servi, Synthesis, 1-25 (1990)