DIAGNOSTYKA

DIAGNOSTYKA

ENZYMATYCZNA

ENZYMATYCZNA

OZNACZNIE AKTYWNOŚCI

OZNACZNIE AKTYWNOŚCI

ALT i AST

ALT i AST

Podział enzymów

Podział enzymów

I

I

– wg na pochodzenie

– wg na pochodzenie

II – wg na rodzaj katalizowanej reakcji

II – wg na rodzaj katalizowanej reakcji

III – podział kliniczny

III – podział kliniczny

Podział enzymów ze

Podział enzymów ze

wg na

wg na

pochodzenie

pochodzenie



e

e

nzymy komórkowe

nzymy komórkowe

dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

aminotransferazy

aminotransferazy



enzymy pozakomórkowe

enzymy pozakomórkowe

-

-

enzymy osoczowe

enzymy osoczowe

trombina, plazmina

trombina, plazmina

-

-

enzymy trawienne

enzymy trawienne

pepsyna, trypsyna, amylaza

pepsyna, trypsyna, amylaza

Podział enzymów ze

Podział enzymów ze

wg na

wg na

rodzaj

rodzaj

katalizowanej reakcji

katalizowanej reakcji



oksydoreduktazy

oksydoreduktazy



reduktazy

reduktazy



transferazy

transferazy



hydrolazy

hydrolazy



liazy

liazy



izomerazy

izomerazy



ligazy

ligazy

P

P

odział kliniczny

odział kliniczny



E

E

nzymy

nzymy

wskaźnikowe (indykatorowe)

wskaźnikowe (indykatorowe)

-

-

narządowo swoiste

narządowo swoiste

dla wątroby – dehydrogenaza alkoholowa

dla wątroby – dehydrogenaza alkoholowa

dehydrogenaza

dehydrogenaza

sorbitolowa

sorbitolowa

dla mięśni poprzecznie prążkowanych –

dla mięśni poprzecznie prążkowanych –

aldolaza

aldolaza

fruktaz

fruktaz

a

a

1,6 dwufosfor

1,6 dwufosfor

ano

ano

wa

wa

-

-

narządowo nieswoiste

narządowo nieswoiste

enzymy

enzymy

cyklu Krebsa

cyklu Krebsa

cyklu glikolitycznego

cyklu glikolitycznego

cyklu mocznikowego

cyklu mocznikowego

P

P

odział kliniczny

odział kliniczny



Enzymy

Enzymy

wydzielnicze (sekrecyjne)

wydzielnicze (sekrecyjne)

esteraza cho

esteraza cho

l

l

inowa

inowa

ceruloplazmina

ceruloplazmina

lipaza lipoproteinowa

lipaza lipoproteinowa

enzymy krzepnięcia krwi

enzymy krzepnięcia krwi

i fibrynolizy

i fibrynolizy

- fibrynogen

- fibrynogen

- protrombina

- protrombina

- trombina

- trombina

P

P

odział kliniczny

odział kliniczny



Enzymy wydalnicze (ekskrecyjne)

Enzymy wydalnicze (ekskrecyjne)

-

-

żółci – GGTP

żółci – GGTP

LAP – aminopeptydaza leucy

LAP – aminopeptydaza leucy

n

n

owa

owa

fosfataza zasadowa

fosfataza zasadowa

-

-

soku trzustkowego – amylaza

soku trzustkowego – amylaza

lipaza

lipaza

DNA-za

DNA-za

RNA-za

RNA-za

- gruczołów wydzielniczych

- gruczołów wydzielniczych

ż

ż

oł

oł

ą

ą

dka –

dka –

pepsynogen

pepsynogen

- ślinianek przyusznych – amylaza

- ślinianek przyusznych – amylaza

M

M

etod

etod

y

y

enzymologiczn

enzymologiczn

e

e



c

c

elem badania w metodach

elem badania w metodach

enzymologicznych

enzymologicznych

jest

jest

ilościowe określenie zmian w zawartości

ilościowe określenie zmian w zawartości

poszczególnych enzymów w surowicy

poszczególnych enzymów w surowicy



właściwości biologiczne – katalityczne

właściwości biologiczne – katalityczne

enzymu są

enzymu są

jedyną cechą nadającą się do pomiaru analitycznego

jedyną cechą nadającą się do pomiaru analitycznego

(pomiar aktywności)

(pomiar aktywności)



m

m

iarą aktywności jest szybkość reakcji enzymatycznej

iarą aktywności jest szybkość reakcji enzymatycznej

- w

- w

yraża się ją ilością substancji przemienionej pod

yraża się ją ilością substancji przemienionej pod

wpływem enzymu w jednostce czasu

wpływem enzymu w jednostce czasu



w

w

zględy analityczne zwykle decydują o tym czy bada

zględy analityczne zwykle decydują o tym czy bada

się szybkość znikania substratu czy szybkość

się szybkość znikania substratu czy szybkość

pojawiania się produktu reakcji.

pojawiania się produktu reakcji.

M

M

etod

etod

y

y

enzymologiczn

enzymologiczn

e

e



w

w

łaściwości biologiczne enzymów tzn. zdolność

łaściwości biologiczne enzymów tzn. zdolność

katalizowania określonej reakcji wynikają z

katalizowania określonej reakcji wynikają z

charakterystycznej budowy cząsteczek.

charakterystycznej budowy cząsteczek.



a

a

ktywność jaką wykazuje dany enzym zależy od

ktywność jaką wykazuje dany enzym zależy od

warunków środowiska, w którym się znajduje jak

warunków środowiska, w którym się znajduje jak

również od czynników denaturujących.

również od czynników denaturujących.



a

a

ktywność mierzona w warunkach

ktywność mierzona w warunkach

i

i

n vitro ma

n vitro ma

informować o jego aktywności

informować o jego aktywności

i

i

n vivo i dlatego

n vivo i dlatego

należy tak dobrać warunki pobierania i

należy tak dobrać warunki pobierania i

przechowywania materiału oraz szybkość reakcji

przechowywania materiału oraz szybkość reakcji

aby mierzona aktywność odpowiadała aktywności

aby mierzona aktywność odpowiadała aktywności

rzeczywistej lub była do niej zbliżona

rzeczywistej lub była do niej zbliżona

.

.

M

M

etod

etod

y

y

enzymologiczn

enzymologiczn

e

e



Metody badania aktywności enzymów

Metody badania aktywności enzymów

-

-

metod

metod

a

a

2-punktow

2-punktow

a

a

(porównanie substratu

(porównanie substratu

lub produktu w 2 punktach czasu – w czasie zero i

lub produktu w 2 punktach czasu – w czasie zero i

po zakończeniu inkubacji)

po zakończeniu inkubacji)

-

-

metod

metod

a

a

kinetyczn

kinetyczn

a

a

, opart

, opart

a

a

na zasadzie

na zasadzie

pomiaru substratu lub produktu reakcji w jednostce

pomiaru substratu lub produktu reakcji w jednostce

czasu - w początkowym okresie reakcji.

czasu - w początkowym okresie reakcji.



m

m

etody te wymagają ciągłej rejestracji zmian

etody te wymagają ciągłej rejestracji zmian

stężenia badanego składnika w czasie

stężenia badanego składnika w czasie



w czasie inkubacji zachodzą zmiany w środowisku

w czasie inkubacji zachodzą zmiany w środowisku

inkubacyjnym – zmniejsza się stężenie enzymu,

inkubacyjnym – zmniejsza się stężenie enzymu,

- zwiększa się stęzenie produktu,

- zwiększa się stęzenie produktu,

-

-

enzym może zostać inaktywowany

enzym może zostać inaktywowany

M

M

etod

etod

y

y

enzymologiczn

enzymologiczn

e

e



należy badać tzw

należy badać tzw

.

.

szybkość początkową reakcji

szybkość początkową reakcji

-

-

r

r

ozumie się przez to początkowy okres inkubacji gdy

ozumie się przez to początkowy okres inkubacji gdy

szybkość reakcji (mierzona w jednostce czasu) jest

szybkość reakcji (mierzona w jednostce czasu) jest

stała i zależy od stężenia enzymu w środowisku

stała i zależy od stężenia enzymu w środowisku

inkubacyjnym Tylko szybkość początkowa reakcji (a

inkubacyjnym Tylko szybkość początkowa reakcji (a

wiec stała liniowa w czasie) jest właściwą miarą

wiec stała liniowa w czasie) jest właściwą miarą

aktywności enzymu.

aktywności enzymu.



c

c

zynnikiem niezbędnym do utrzymania stałej

zynnikiem niezbędnym do utrzymania stałej

szybkości reakcji jest wysycenie enzymu substratem,

szybkości reakcji jest wysycenie enzymu substratem,

zwiększa się

zwiększa się

ona

ona

wraz za

wraz za

zwiększeniem stężenia

zwiększeniem stężenia

substratu. Przy pewnym określonym stężeniu zostaje

substratu. Przy pewnym określonym stężeniu zostaje

osiągnięte całkowite wysycenie enzymu substratem i

osiągnięte całkowite wysycenie enzymu substratem i

dalsze zwiększanie stężenia substratu nie wpływa już

dalsze zwiększanie stężenia substratu nie wpływa już

na szybkość reakcji.

na szybkość reakcji.

M

M

etod

etod

y

y

enzymologiczn

enzymologiczn

e

e



p

p

rzy doborze stężenia substratu w danej metodzie

rzy doborze stężenia substratu w danej metodzie

pomocna jest znajomość tzw.

pomocna jest znajomość tzw.

stałej Michaeli

stałej Michaeli

s

s

a

a

,

,



l

l

iczbowo wartość stałej Michaeli

iczbowo wartość stałej Michaeli

s

s

a odpowiada

a odpowiada

takiemu stężeniu substratu, przy którym szybkość

takiemu stężeniu substratu, przy którym szybkość

reakcji równa jest połowie szybkości maksymalnej.

reakcji równa jest połowie szybkości maksymalnej.



w

w

każdej metodzie tak należy dobrać stężenie

każdej metodzie tak należy dobrać stężenie

substratu aby było ono co najmniej 100-krotnie

substratu aby było ono co najmniej 100-krotnie

większe od wartości stałej Michaeli

większe od wartości stałej Michaeli

s

s

a.

a.



a

a

ktywność

enzymu

wyraża

się

w

ktywność

enzymu

wyraża

się

w

tzw.

tzw.

m

m

iędzynarodow

iędzynarodow

ych

ych

jednostka

jednostka

ch

ch

aktywności

aktywności

(j.m., IU – International Unit) odpowiada

(j.m., IU – International Unit) odpowiada

przemianie 1 mikromola substratu w ciągu 1 min

przemianie 1 mikromola substratu w ciągu 1 min

w odniesieniu do 1 litra.

w odniesieniu do 1 litra.

Aminotransferaza alaninowa

Aminotransferaza alaninowa

(transferaza glutaminowo-pirogronowa)

(transferaza glutaminowo-pirogronowa)

- ALAT, ALT, GPT

- ALAT, ALT, GPT



enzym wewnątrzkomórkowy

enzym wewnątrzkomórkowy

,

,

cytoplazmatyczny

cytoplazmatyczny



występuj

występuj

e

e

w wielu narządach jak wątroba, serce,

w wielu narządach jak wątroba, serce,

mięśni

mięśni

e

e

i nerki

i nerki



j

j

est uznawany za specyficzny enzym wątrobowy u

est uznawany za specyficzny enzym wątrobowy u

psów i kotów

psów i kotów



o

o

kres półtrwania ALT w surowicy kota wynosi około 24

kres półtrwania ALT w surowicy kota wynosi około 24

godz. a u psa 4 dni

godz. a u psa 4 dni



wzrost aktywności w surowicy odzwierciedla ilość

wzrost aktywności w surowicy odzwierciedla ilość

uszkodzonych hepatocytów

uszkodzonych hepatocytów

a nie

a nie

stopień

stopień

zaawansowanych zmian

zaawansowanych zmian



w

w

zrost aktywności ALT w surowicy następuje w ciągu

zrost aktywności ALT w surowicy następuje w ciągu

12 godz

12 godz

.

.

po uszkodzeniu komórki.

po uszkodzeniu komórki.

ALT

ALT



Wartości referencyjne

Wartości referencyjne

ALT

ALT

Psy

Psy

-

-

3-50

3-50

IU/l

IU/l

Koty

Koty

-

-

20-100

20-100

IU/l

IU/l



Materiał do badań

Materiał do badań

-    surowica pozbawiona hemolizy, gdyż ALT

-    surowica pozbawiona hemolizy, gdyż ALT

występuje w erytrocytach i hemoliza podwyższa

występuje w erytrocytach i hemoliza podwyższa

wynik. Lipemia także wyklucza surowicę

wynik. Lipemia także wyklucza surowicę

-         osocze heparynizowane

-         osocze heparynizowane

-         osocze z EDTA

-         osocze z EDTA

Wzrost aktywności ALT

Wzrost aktywności ALT



ostre uszkodzeni

ostre uszkodzeni

e

e

wątroby

wątroby

wzrost

wzrost

aktywnoś

aktywnoś

ci

ci

ALT 20-

ALT 20-

krotn

krotn

y

y



zaburzenia cholestatyczn

zaburzenia cholestatyczn

e -

e -

15, 40

15, 40

-

-

krotny

krotny



zapaleni

zapaleni

e

e

wątroby i dróg żółciowych

wątroby i dróg żółciowych

– 2, 40-krotny

– 2, 40-krotny



stłuszczen

stłuszczen

ie

ie

wątroby

wątroby

-

-

5, 10

5, 10

-

-

krotn

krotn

y

y



marskoś

marskoś

ć

ć

wątroby, zmian

wątroby, zmian

y

y

nowotworow

nowotworow

e

e

i zespoleni

i zespoleni

a

a

obocz

obocz

ne

ne



chorob

chorob

y

y

innych narządó

innych narządó

w

w

-

-

nadczynności tarczycy

nadczynności tarczycy

-

-

o

o

str

str

a

a

niedokrwistoś

niedokrwistoś

ć

ć

-

-

b

b

iałacz

iałacz

ka

ka

kotów

kotów

- p

- p

osocznic

osocznic

a

a

Wzrost aktywności ALT

Wzrost aktywności ALT



u psów ras

u psów ras

- doberman

- doberman

-

-

bedington terrier

bedington terrier

-

-

w

w

est highland white terrier podwyższon

est highland white terrier podwyższon

a

a

aktywność

ALT

może

sugerować

chorobę

aktywność

ALT

może

sugerować

chorobę

spichrzeniową miedzi

spichrzeniową miedzi



Leki

Leki

- przeciwpadaczkowe

- przeciwpadaczkowe

- glikokortykosterydy

- glikokortykosterydy

Aminotransferaza asparaginianowa

Aminotransferaza asparaginianowa

(transaminaza glutaminowo-

(transaminaza glutaminowo-

szczawiooctowa)

szczawiooctowa)

AST, AspAT, GOT

AST, AspAT, GOT



j

j

est enzymem

est enzymem

mitochondrialnym i występuje

mitochondrialnym i występuje

także w cytozolu komórkowym

także w cytozolu komórkowym



występuje w

występuje w

sercu, wątrobie, mięśniach, nerkach

sercu, wątrobie, mięśniach, nerkach



w

w

hepatocytach AspAT jest w 30% rozpuszczon

hepatocytach AspAT jest w 30% rozpuszczon

y

y

w

w

cytoplazmie, a 70% jest związan

cytoplazmie, a 70% jest związan

y

y

w strukturach

w strukturach

mitochondrialnych, co sprawia, że uwolnienie

mitochondrialnych, co sprawia, że uwolnienie

enzymu z komórki następuje dwustopniowo i jego

enzymu z komórki następuje dwustopniowo i jego

podwyższona aktywność w surowicy może być

podwyższona aktywność w surowicy może być

wydłużona.

wydłużona.



Czas półtrwania wynosi

Czas półtrwania wynosi

17h

17h

i

i

Aminotransferaza asparaginianowa

Aminotransferaza asparaginianowa

(transaminaza glutaminowo-

(transaminaza glutaminowo-

szczawiooctowa)

szczawiooctowa)

AST, AspAT, GOT

AST, AspAT, GOT



u

u

zwierząt mięsożernych AspAT występuje w

zwierząt mięsożernych AspAT występuje w

wątrobie i sercu prawie w równych stężeniach, a o

wątrobie i sercu prawie w równych stężeniach, a o

połowę niższych w mięśniach szkieletowych. Jest

połowę niższych w mięśniach szkieletowych. Jest

zatem w równej mierze markerem uszkodzenia

zatem w równej mierze markerem uszkodzenia

komórek wątroby jak i mięśnia sercowego.

komórek wątroby jak i mięśnia sercowego.



wskaźnik de Ritisa

wskaźnik de Ritisa

, opisujący

, opisujący

stosunek AST do

stosunek AST do

ALT

ALT

, którego wartość prawidłowa mieści się w

, którego wartość prawidłowa mieści się w

granicach 1,2 do 1,8.

granicach 1,2 do 1,8.

U pacjentów z chorobami

U pacjentów z chorobami

wątroby obniża się do wartości 0,64. Przy zawale

wątroby obniża się do wartości 0,64. Przy zawale

mięśnia sercowego przekracza wartość 2.

mięśnia sercowego przekracza wartość 2.

AST

AST



Wartości referencyjne

Wartości referencyjne

Psy – 1-37 IU/l

Psy – 1-37 IU/l

Koty – 6-44 IU/l

Koty – 6-44 IU/l



Materiał do badań:

Materiał do badań:

-         surowica

-         surowica

-         osocze heparynizowane

-         osocze heparynizowane

-         osocze z EDTA

-         osocze z EDTA

AST

AST



Podwyższenie aktywności obserwuje się

Podwyższenie aktywności obserwuje się





- ostre wirusowe zapalenie wątroby może wzrosnąć

- ostre wirusowe zapalenie wątroby może wzrosnąć

do wartości 4000

do wartości 4000

IU/l

IU/l

toksyczne uszkodzenie wątroby – do 4000

toksyczne uszkodzenie wątroby – do 4000

IU/l

IU/l

postępująca dystrofia mięśni

postępująca dystrofia mięśni

miopatia

miopatia

zawał mięśnia sercowego

zawał mięśnia sercowego

intensywny wysiłek u koni sportowych

intensywny wysiłek u koni sportowych

-  

-  

     

     





- przewlakłe zapalenie wątroby – 2-3 krotny wzrost

- przewlakłe zapalenie wątroby – 2-3 krotny wzrost

do 400

do 400

IU/l

IU/l

marskość wątroby – do 200

marskość wątroby – do 200

IU/l

IU/l

cholestaza

cholestaza

niedobór selenu i witaminy E

niedobór selenu i witaminy E

     

     

AST

AST





guzy pierwotne i przerzutowe wątroby

guzy pierwotne i przerzutowe wątroby

uszkodzenie polekowe wątroby

uszkodzenie polekowe wątroby

zapalenie dróg

zapalenie dróg

żółciowych

żółciowych

zapalenie mięśnia sercowego

zapalenie mięśnia sercowego

zator płucny

zator płucny



Wzrost aktywności mogą powodować także leki:

Wzrost aktywności mogą powodować także leki:

glikokortykosteroidy, ale wzrost AST jest mniej

glikokortykosteroidy, ale wzrost AST jest mniej

zaznaczony niż aktywności ALT

zaznaczony niż aktywności ALT

-         Erytromycyna

-         Erytromycyna

-         Doustne środki antykoncepcyjne

-         Doustne środki antykoncepcyjne

-         Salicylany

-         Salicylany

-         Morfina, kodeina

-         Morfina, kodeina

AST

AST



Obniżenie aktywności występuje:

Obniżenie aktywności występuje:

    

    

Niedobór Wit. B6

Niedobór Wit. B6

  

  

Ciąży

Ciąży