Rozwój układu nerwowego
(WBNZ  818)
Jolanta Górska-Andrzejak
Neuron hipokampa szczura w hodowli komórkowej. Czerwony  tubulina, Zielony- synapsyna.
Podsumowanie:
Podsumowanie:
Badania z zakresu embriologii
klasycznej wykazały, że układ
nerwowy wykształca się w
czasie rozwoju embrionalnego
z ektodermy na skutek
indukcji ze strony tkanki
budującej tzw. organizator
Spemann a. Dalsze badania
pozwoliły poznać także
molekularny mechanizm
indukcji układu nerwowego,
polegający na inhibicji ścieżki
sygnałowej BMP (zależnej od
BMP represji) przez induktory
neuronalne.
" Zarówno u Drosophila jak i u Xenopus do wykształcenia się w
embrionie regionu neurogenicznego konieczny jest antagonizm
czynników TGF-beta, takich jak dpp/BMP, przez substancje będące
induktorami neuronalnymi, które są wytwarzane przez organizator.
dpp, Sog BMP2/4,Chordina
BMP zapobiega
dpp zapobiega
różnicowaniu
różnicowaniu
w neuroektodermę
w neuroektodermę
Chordina promuje
różnicowanie
w neuroektodermę
Sog promuje
różnicowanie
w neuroektodermę
Wytwarzane przez organizator
noggina, chordina czy follistatyna
noggina, chordina czy follistatyna
zapobiegają łączeniu się BMP do ektodermy i mezodermy w
pobliżu organizatora  > zapobiegają indukcji/powstaniu
w tym rejonie epidermy - zezwalają na powstanie tkanki
nerwowej.
 Antagonizm BMP jest konieczny i wystarczający do indukcji
układu nerwowego, jednakże u Drosophila proces delaminacji
neuroblastów z regionu neurogenicznego (neuroektodermy)
zachodzi dzięki drugiej ścieżce sygnałowej  > Notch/Delta,
która reguluje ekspresję i funkcję białek proneuralnych
będących czynnikami transkrypcji bHLH.
Proneuronalny system
Notch/Delta jest konserwatywny i
występuje również u kręgowców
Wykład 3
Segmentacja układu nerwowego
Różnicowanie zależne od pozycji
Układ nerwowy D. melanogaster
Różnicowanie zależne od pozycji
Model Flagi Francuskiej
(Wolpert, 1969, 1978)
Kształtowaniem się zróżnicowanej budowy ciała
wzdłuż osi przednio-tylnej
u Drosophila zawiaduje hierarchiczny układ
genów regulatorowych.
Plan budowy ciała zostaje zdeterminowany już w
stadium blastodermy
-> uaktywnienie genów wyznaczających pozycję i
organizację przyszłych segmentów ciała.
" 5 grup genów tworzy hierarchiczny
układ regulacyjny.
" Geny wyższej kategorii decydują o
aktywności genów podrzędnych.
" Geny w obrębie tej samej kategorii
mogą nawzajem wpływać na swoją
aktywność.
geny polarności jaja
polarności
(decydują o orientacji przedniej i tylnej części ciała;
pozycja nadrzędna)
geny segmentacji
geny segmentacji
(3 kategorie; wyznaczają podział ciała na segmenty)
geny homeotyczne
geny homeotyczne
(decydują o prawidłowym zróżnicowaniu budowy każdego
segmentu zgodnie z jego pozycją wzdłuż osi przednio-
tylnej)
Geny te kodują białka typu regulatorowego, których struktura
wskazuje na to, że mogą wiązać się ze specyficznymi
sekwencjami DNA i jako czynniki transkrypcji wpływać na
aktywność innych i własnych genów.
Geny polarności jaja
Geny polarności jaja
(ang. egg polarity genes)
" Wywołują tzw. efekt mateczny, gdyż ich
produkty zostają zdeponowane w oocycie, są
więc pod kontrola genotypu matki
(pod kontrolą genów matczynych; ang. maternal genes)
Bicoid (bcd)
Bicoid (bcd)
wyznacza przedni koniec ciała
" cząsteczki mRNA genu
bicoid są syntetyzowane
w organizmie matki, w
komórkach odżywczych
jajnika, skąd przechodzą
do oocytu i gdzie od razu
zostają zakotwiczone
" po zapłodnieniu jaja na
matrycach tego mRNA
syntetyzowane jest
białko, które
rozprzestrzenia się i
tworzy gradient stężenia,
malejący ku tyłowi.
Zarodki mutantów bcd pozbawione są
głowy i struktur tułowiowych
bicoid zachowuje się jak
typowy morfogen, (tzn.
substancja wywołująca
specyficzną indukcję);
cytoplazma zawierająca
białko kodowane przez ten
gen po wprowadzeniu w
dowolną okolicę mutanta
bicoid indukuje w tym miejscu
powstanie struktur
charakterystycznych dla
przedniej części ciała.
Nanos (nos)
Nanos (nos)
gen wyznaczający tylny koniec jaja, niezbędny do powstania
segmentów odwłokowych.
cząsteczki mRNA tego genu są
syntetyzowane w organizmie
matki.
ulega translacji w tym samym
czasie co bicoid.
" Syncytialna blastoderma zawiera przynajmniej
dwa przeciwstawne gradienty produktów
kodowanych przez geny polarności jaja, takich
jak bicoid i nanos.
" Białka Bicoid i Nanos dostarczają wstępnych
sygnałów pozycyjnych, które wpływają na
aktywność genów niższej kategorii (genów
segmentacji) zawężając ich ekspresję do
konkretnych regionów ciała.
hunchback i caudal
hunchback i caudal
W jaju występują także matczyne transkrypty genów
hunchback i caudal.
" hunchback, tak jak bicoid wyznacza przedni
koniec ciała
" caudal, tak jak nanos, wyznacza tylny koniec
ciała.
Zależności pomiędzy genami
Zależności pomiędzy genami
" Bicoid zapobiega translacji
caudal w przedniej części jaja.
" Nanos powoduje inhibicję
translacji hunchback w tylnej
części jaja.
" Gradient hunchback jest
dodatkowo wzmocniony dzięki
zachodzącej transkrypcji tego
genu w przedniej części jaja=>
białko Bicoid jest czynnikiem
transkrypcji hunchback.
(pierwsza kategoria genów segmentacji)
Geny Luki
(ang. GAP genes)
-pierwsze geny zygotyczne, które ulegają ekspreji wzdłuż osi
przednio-tylnej
Geny segmentacji, których mutacje
wywołują utratę dużych partii ciała (ang.
gap genes) i wczesną letalność embrionu.
Białka Bicoid,
Hunchback i Caudal
są czynnkami
transkrypcyjnymi, które
aktywują geny luki
Np. Kr�
ppel 
ekspresja tego genu
zachodzi tylko w
środkowej części
embrionu
(zarówno w części
przedniej jak i w
tylnej jego
transkrypcja jest
hamowana przez
białka genów
polarności jaja).
(druga kategoria genów segmentacji)
Geny reguły
Geny reguły
parzystej
parzystej
(geny parzystości segmentów,
ang.pair-rule genes)
" geny segmentacji o bardziej lokalnym działaniu, wyznaczające
regiony tzw. parasegmentów (zaczątków segmentacji, które
są przesunięte w stosunku do ostatecznych segmentów; 1/3
tylnej części segmentu + 2/3 segmentu następnego )
" ich mutacje wywołują brak co drugiego parasegmentu, np.
mutanty fushi tarazu (po japońsku: mało segmentów, ftz) nie
mają parasegmentów nieparzystych (brązowy), natomiast
mutanty even-skipped (eve) parzystych (fioletowy).
" Ich ekspresja zbiega się w czasie z celularyzacją;
przekształcenie blastodermy syncytialnej w komórkową.
(trzecia kategoria genów segmentacji)
Geny polarności segmentów
(ang. segment polarity genes)
(trzecia kategoria genów segmentacji)
Wyznaczają określoną część każdego
segmentu. Ich mRNA wykrywane jest w
formie prążków, często o szerokości jednej
komórki.
Ulegają ekspresji w blastodermie komórkowej, w postaci 14 prążków
" mRNA genu engrailed (en), wykrywalny jest w formie 14 prążków,
każdy o szerokości jednej komórki, zlokalizowanych w przedniej
ćwiartce poszczególnych parasegmentów.
" mRNA genu wingless (wg)  w ćwiartce tylnej. U mutantów, ta część
każdego parasegmentu zbudowana jest jak lustrzane odbicie części
pozostałej.
" Po gastrulacji gen patched ulega ekspresji, ale tylko w tych
komórkach, w których brak jest ekspresji egrailed i hedgehog.
Ekspresja genów wspomnianych kategorii
Ekspresja genów wspomnianych kategorii
tworzy coraz to dokładniejszą mozaikę
tworzy coraz to dokładniejszą mozaikę
sygnałów pozycyjnych,
sygnałów pozycyjnych,
które dostarczają każdej z komórek
które dostarczają każdej z komórek
informacji
informacji
precyzujących jej dokładną lokalizację w
precyzujących jej dokładną lokalizację w
zarodku.
zarodku.
Geny homeotyczne
Geny homeotyczne
(ang. homeotic genes, homeotic selector genes)
(ang. homeotic genes, homeotic selector genes)
" Różnicują segmenty:
każdy segment
zdobywa własną
tożsamość, staje się
morfologicznie inny
od pozostałych.
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1995
Geny
homeotyczne
zostały odkryte
przez
Edwarda Lewisa
(1978)
 Lewis znalazł mutanta muszki owocowej
(Bithorax), który posiadał dwie pary
skrzydeł zamiast jednej pary.
Dodatkowa para wytworzyła się na
trzecim segmencie tułowiowym, ponieważ
mutacja (w genie ultrabitorax)
przekształciła trzeci segment tułowiowy
w segment drugi.
Mutacja Antennapedia
Główne geny homeotyczne występują w
Główne geny homeotyczne występują w
prawym ramieniu 3 chromosomu,
prawym ramieniu 3 chromosomu,
w postaci dwóch kompleksów genów
w postaci dwóch kompleksów genów
sprzężonych:
sprzężonych:
- Kompleks Antennapedia (ANT-C), wyznacza
różnice między segmentem głowowym a trzema
segmentami tułowia
- Kompleks bithorax (BX-C), wyznacza różnice
między segmentami tułowia a odwłoka.
 Geny obu kompleksów
ułożone są w
chromosomie w takiej
samej kolejności jak
parasegmenty, których
specjalizację
wyznaczają.
Geny homeotyczne cd.
" Ich ekspresją kierują białka (zestawy białek)
kodowane zarówno przez geny polarności jaja,
jak i przez geny segmentacji.
" Ekspresja g.h.rozpoczyna się bezpośrednio
przed celularyzacją blastodermy i początkowo
jest dość rozległa.
" W miarę jak aktywowane są kolejne grupy
genów segmentacji i przybywa kodowanych
przez te geny białek regulatorowych ekspresja
genów homeotycznych staje się coraz bardziej
precyzyjna.
" Klonowanie genów homeotycznych ANT-C i
BX-C wykazało, że wszystkie zawierają
sekwencję o bardzo wysokim stopniu homologii
(o długości 180 nukleotydów).
" Sekwencja ta, odkryta w roku 1984 i nazwana
homeoboksem (ang. homeobox), została potem
znaleziona również w genach polarności jaja, w
wielu genach segmentacji oraz w genach
kierujących rozwojem u różnych grup
zwierząt, także u ssaków.
Homeobox
Homeobox
" Homeobox koduje domenę
białkową zwaną
homeodomeną, o dł. 60
aminokwasów, złożoną z
trzech fragmentów alfa-
helikalnych, tworzących
strukturę typu  heliks-skręt-
heliks , typową dla czynników
transkrypcyjnych.
" Białka, które zawierają
homeodomenę biorą udział w
regulacji ekspresji zespołów
genów, które są ze sobą
funkcjonalnie powiązane.
Sekwencja homeoboksu występuje w
genach kierujących rozwojem u zwierząt
bezkręgowych i kręgowych.
" Posługując się sekwencją homeoboksu jako sondą do
hybrydyzacji DNA banków genomowych różnych zwierząt,
stwierdzono obecność homeoboksu w genach wielu bardzo
odległych od siebie ewolucyjnie grup:
" u nicienia C.elegans
" u pierścienic
" u jeżowców
" u prymitywnych strunowców
" u kręgowców ( żaby, kury, myszy i człowieka)
" Geny zawierające homeoboks zostały dość dobrze poznane u
człowieka i u myszy, u których nazwano je genami Hox.
Podobnie jak u
Drosophila istnieje
ścisły związek między
kolejnością ułożenia
genów w chromosomie
a miejscem ich
aktywacji w osobniku.
" Geny Hox występują w 4 grupach sprzężeń jako kompleksy HOX.
" Ułożenie genów w każdym z tych kompleksów wykazuje bardzo
duże podobieństwo do połączonych kompleksów ANT-C + BX-C u
Drosophila: Najbardziej homologiczne w stosunku do siebie geny,
tworzące tzw. podrodziny, występują w tej samej kolejności.
" przednia granica ekspresji genu
(na przednio-tylnej osi ciała) zależy od pozycji genu w
kompleksie
" geny wykazujące ekspresję w tym samym regionie
pochodzą z tej samej podrodziny
Układ nerwowy
Układ nerwowy
" Granica ekspresji poszczególnych genów Hox jest bardzo wyraz
na
w układzie nerwowym zarodka myszy i odpowiada kolejności tych
genów w chromosomie.
" Geny Hox, których ekspresja pojawia się najpierw w narządach
osiowych (system nerwowy, zawiązki kręgów), wykazują ekspresję
również w narządach obwodowych, np. kończynach. Układowi
przednio-tylnemu w narządach osiowych odpowiada układ
proksymalno-dystalny w kończynach.
=> Ten sam system regulacyjny jest stosowany wielokrotnie, w
podobny sposób na różnych etapach rozwoju
Geny Hox zachowały swoje pierwotne funkcje:
zachowały
" Po wprowadzeniu do
organizmu Drosophila genu
myszy odpowiadającego
genowi Antennapedia i
spowodowaniu jego
nadmiernej ekspresji,
uzyskano muchy z odnóżami
zamiast czułków => podobnie
jak przy nadmiernej
ekspresji własnego genu.
Eliminacja wszystkich genów Hox u Tribolium
 > wszystkie segmenty wyglądają tak samo
(Stuart i inni, 1993)
" A: normalny wygląd B: osobnik pozbawiony grupy genów Hox
 Funkcja genów Hox w różnicowaniu regionalnym układu
nerwowego kręgowców została najlepiej zbadana
w tyłomózgowiu (rhombocephalon).
Kształtowanie tyłomózgowia
Tyłomózgowie (rhombocephalon)
Tyłomózgowie (rhombocephalon)
Kontroluje automatyczne czynności organizmu
(oddychanie, krążenie) i ruchy ciała.
Mózg i rdzeń kręgowy kręgowców powstają
z cewy nerwowej.
" W pierwszym stadium rozwoju z przedniej części cewy nerwowej
tworzą się trzy pęcherzyki: przodomózgowie, śródmózgowie i
tyłomózgowie. W dalszym rozwoju następuje kolejny podział
przodomózgowia i tyłomózgowia.
Segmentacja tyłomózgowia kręgowców
-> 8 segmentów (rombomerów) a w każdym unikalny zestaw neuronów
unerwiających głowę.
nerwy czaszkowe
trójdzielny
twarzowy
odwodzący
językowo-gardłowy
błędny
Delecja genów Hox w układach eksperymentalnych:
Delecja genów Hox w układach eksperymentalnych:
Delecja genu Hoxa1 u myszy wywołuje utratę rombomeru nr 5 i redukcję
rombomeru nr 4
=> brak wielu neuronów unerwiających mięśnie głowy oraz neuronów
które budują struktury mózgowe w rejonie tyłomózgowia.
Wektory:
" Wyposażone są w tzw. markery = geny
odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy
fenotypowe, np. odporność na antybiotyk;
zdolnośc do syntezy łatwo oznaczalnego enzymu
(np. �-galaktozydazy; komórki zawierające ten
enzym zabarwiają się na niebiesko w obecności
substratu: X-gal).
" Geny reporterowe (markerowe) mogą pochodzić z
dowolnego organizmu, jednak muszą być wyposażone
w sekwencje warunkujące ich prawidłową
transkrypcję i translację w komórkach, do których
wprowadzamy dany wektor.
Ekspresja genów Hox
w tyłomózgowiu
" Przekrój przez tyłomózgowie 9.5
dniowego, transgenicznego embrionu
myszy.
" 2 wektory:
1) wektor zawierający gen Lac-Z
(kodujący enzym �-galaktozydazę) pod
kontrolą enhansera genu Hoxb2 =>
wywołuje ekspresję w rombomerach nr
3 i 5.
2) wektor zawierający gen kodujący
alkaliczną fosfatazę, pod kontrolą
enhansera genu Hoxb1 => wywołuje
ekspresję w rombomerze nr 4.
Eliminacja wszystkich genów Hox u Tribolium
 > wszystkie segmenty wyglądają tak samo
(Stuart i inni, 1993)
" A: normalny wygląd B: osobnik pozbawiony grupy genów Hox
Jak wyglądałoby tyłomózgowie
bez ekspresji genów Hox ?
 Badania na organizmach tak kręgowców jak i
Drosophila wykazały, że produkty genów Hox wpływają
znacznie bardziej specyficznie na odcinki
promotorowe genów znajdujących się niżej w ścieżce
sygnałowej, jeśli wchodzą w interakcje z białkami Pbx
i Meis (kodowane przez geny zawierające
homeodomenę).
TYP DZIKI MUTANT
-inaktywacja genów Pbx
Rybka Danio
-inaktywacja genów
Pbx
Rombomer1  podstawowy stan (default condition)
Brak rombomerów 2-6, brak neuronów z tych miejsc.
Regulacja ekspresji genów
Hox u kręgowców
Czy tak jak u Drosophila regulują ją geny luki, geny reguły
parzystej itp.?
Dotychczasowe badania wskazują na to,
że może być nieco inna niż ta, opisana
u muszki owocowej.
działanie kwasu retinowego
(pochodna witaminy A, ang. retinoic acid, RA)
Kwas retinowy to silny teratogen, który
może wywoływać wady rozwojowe.
Gradient koncentracji RA
w normalnym embrionie:
stężenie kwasu retinowego
jest około 10x większe w
tylnej części embrionu.
Embriony poddane
działaniu zwiększonego
stężęnia kwasu retinowego
nie wytwarzają struktur
głowowych, a ekspresja
genów Hox przedniej
części ciała ulega u nich
inhibicji.
bezpieczeństwo stosowania retinoidów
Od czasu wprowadzenia kwasu retinowego
do leczenia ciężkich form trądziku
(reguluje procesy metaboliczne w
naskórku) w 1982 roku, urodziło się około
tysiąc dzieci z wadami rozwojowymi
części twarzowej czaszki i mózgu.
" Kwas retinowy wnika
do wnętrza komórki
poprzez błonę
komórkową i łączy się
z receptorem
cytoplazmatycznym.
" RAR (retinoic acid
receptor) przedostaje
się do jądra
komórkowego gdzie
może regulować
ekspresję genów
poprzez interakcje z
RARE (retinoic acid
respons element).
Już Spemann i wsp. wykazali, że mogą
istnieć oddzielne organizatory głowy i
ogona.
Hipoteza Aktywatora-Transformera
" Pierwszy sygnał dochodzący z organizatora, zwany
aktywatorem, powoduje, że komórki ektodermy
nabywają cech komórek przedniej części ciała.
" Drugi sygnał, zwany transformerem, jest wymagany
do przekształcenia części tkanki nerwowej w
tyłomózgowie i rdzeń kręgowy.
(w zgodzie z tym modelem induktory neuronalne  noggina, chordina,
follistatyna- wywołują powstanie przednich struktur mózgowych, gdy są
dodane do hodowli komórek dorsalnej części embrionu; podwójny knockout
mysi noggina/chordina -> brak struktur głowowych)
Blokując sygnał BMP, induktory neuronalne
umożliwiają powstanie neuroektodermy
przedniej części ciała
Gradient RA działa jako transformer
wzmagający ekspresję genów Hox tylnej
części ciała.
Induktory głowy
" Cerberus  inhibuje ścieżki sygnałowe BMP
i Wnt
" frzB (frizzled)- inhibitor Wnt
" Dickkopf
Ulegją ekspresji w rejonie organizatora w czasie gdy
zachodzi indukcja; wszystkie indukują powstawanie
głowy, zwłaszcza gdy działają wraz z inhibitorami BMP.
Heads vs Tails
-rola ścieżki sygnałowej
Wnt
Inhibicja ścieżki
sygnałowej
BMP i Wnt
leży u podstaw indukcji
przednich struktur
nerwowych
-> indukcji mózgu
" dickkopf- gen
zaangażowany w
indukcję głowy
tBR- skrócony receptor BMP
dnXwnt8  dominująca negatywna
forma wnt8
Dkk1 i noggina współdziałają w indukcji głowy
(delecja jednego allelu Dkk1 i Nog)
Geny otx
" Drosophila- mózg powstaje z tzw. neuromerów-
neuromer przedni wykazuje ekspresję genu
orthodenticle (otd), który jest spokrewniony z genem
bicoid.
" Delecja tego genu u muszki owocowej powoduje że nie
posiada ona czułek ani innych struktur głowowych,
które powstają z tych segmentów preantenalnych.
" Geny homologiczne do genu otd muszki znaleziono
także u ssaków. Mysz, z delecją tego genu nie
wykształciła przedniej części układu nerwowego.
Ekspresja otx2
Otx2 jest konieczne do powstania głowy w
embrionie myszy.
Wnt1, engrailed-1, fgf8
Rozwój różnych części mózgu:
Otx2 i Gbx2
- czynniki transkrypcji zawierające domenę
homeoboksu
-> podział między tyłomózgowiem a
przodomózgowiem
Już w okresie neurulacji komórki są
zróżnicowane w zależności od lokalizacji
w obrębie płytki nerwowej.
Mapa przeznaczenia
geny Pax
" Zawierają 2 domeny konserwatywne:
homeodomenę i domenę ang. paired box.
" 9 różnych genów Pax i wszystkie za wyjątkiem
Pax1 i Pax9, ulegają ekspresji w układzie
nerwowym.
" Homozygotyczna mutacja w genie Pax6
-brak oczu (u człowieka, myszy i& .muszki
owocowej)
" Drosophila Pax 6- eyeless
w dysku imaginalnym
odnóża
Model indukcji oka
Kształtowanie się
Kształtowanie się
grzbieto-brzusznej osi
grzbieto-brzusznej osi
cewy nerwowej
cewy nerwowej
Shh (sonic hedgehog
Shh (sonic hedgehog
 ssaczy homolog genu hedgehog) i BMP
 ssaczy homolog genu hedgehog
) i BMP
" Białka SHH (ang. sonic hedgehog
proteins) pochodzące ze struny
grzbietowej indukują tworzenie się
blaszki brzusznej w dolnej ścianie
cewy nerwowej. Blaszka brzuszna
także zaczyna wydzielać własne białka
struna grzbietowa ->
SHH -> sygnał do różnicowania się
neuronów ruchowych.
" Ektoderma naskórka wydziela białka
<- blaszka grzbietowa
morfogenetyczne kości (ang. bone
morphogenetic proteins, BMPs), które
są sygnałem indukującym tworzenie
się blaszki grzbietowej w górnej
ścianie cewy nerwowej. Płytka górna
również wydziela BMP, co wspomaga
<- blaszka brzuszna
różnicowanie komórek nerwowych
rogów grzbietowych.
SHH i BMP
SHH i BMP
kontrolują ekspresję genów Pax, odpowiedzialnych za grzbieto-
brzuszne różnicownie cewy nerwowej.
Podobnie jak geny Hox, geny Pax kodują białka będące czynnikami
transkrypcyjnymi.
Indukcja układu nerwowego
-podsumowanie