1 10 c na 2006, 62 11)
r ryg n n r g n r
po ani zcz pó ho ococcu ui
g! bi a ninach z puj c ro o o oz
ZBiGNiEW GR
DZKi, ANNA Zi
TEK, EMiLiA HETMAN, STANiSA
AW WiNiARCZYK
Zakład EpizootioIogii i KIinika Chorób Zakaz
nych instytutu Chorób Zakaz
nych i inwazyjnych
Wydziału Medycyny Weterynaryjnej AR, uI. Głęboka 30, 20-612 LubIin
Grądzki Z., Ziętek A., Hetman E., Winiarczyk S.
r va! nc of ho ococcu ui rain in oi! a p! fro u i h rho ococco i
Summary
The aim of the study was to assess the prevalence of virulent and non-virulent R. equi strains in horse farms
with enzootic and sporadic rhodococcosis. Based on the microbiological culture, a progressive growth of the
number of bacteria in soil samples was found that was correlated with the air temperature growth and indepen-
dent of the farm epizootic status. The number of virulence strains in the soil was dependent on the time of sample
collection and type of stud. PCR is a useful method for classifying bacteria from the R. equi species and to detect
the virulence marker. Comparison of microbiological culture and PCR suggests caution in interpreting culture
results in terms of the identification of all bacterial colonies as belonging to Rhodococcus equi species.
Keywords: Rhodococcus equi, soil
Rhodococcus equi jest drobnoustrojem wywołują- Wymagają one użycia selektywnych podłoży do izola-
cym ropno-ziarniniakowate zapalenie płuc i niekiedy cji drobnoustrojów z próbek gleby oraz zastosowania
zapalenie błony śluzowej jelit u młodych z
rebiÄ…t w wie- genetycznych i/lub fenotypowych metod identyfikacji
ku do 6. miesiąca życia (2, 5). Rodokokoza występuje i różnicowania szczepów zjadliwych i niezjadliwych.
na całym świecie, także w Polsce i powoduje straty Celem badań było określenie występowania zjadli-
w przychówku, zwłaszcza u z
rebiąt nie poddawanych wych i niezjadliwych szczepów R. equi w środowisku
terapii antybiotykowej (3). W niektórych stadninach hodowlanym, w stadninach z enzootycznie i sporadycz-
koni choroba występuje enzootycznie, w innych spo- nie występującą rodokokozą z
rebiÄ…t. Do izolacji i iden-
radycznie, natomiast w wielu fermach w ogóle nie jest tyfikacji drobnoustrojów w glebie wykorzystano ba-
notowana. Czynniki wpływające na zróżnicowanie danie hodowlane z użyciem podłoża selektywnego oraz
występowania zachorowań w poszczególnych fermach metodę PCR.
nie zostały dokładnie poznane. Istotne znaczenie przy-
a ria i o
pisywane jest uwarunkowaniom środowiskowym oraz
Badania prowadzono w okresie od kwietnia do lipca
podatności osobniczej z
rebiąt (7). Do zakażenia do-
2005 r. w trzech stadninach koni (A, B, C), zlokalizowa-
chodzi najczęściej drogą inhalacyjną, a głównym z
ród-
nych w różnych regionach geograficznych Polski. W stad-
łem bakterii jest zanieczyszczona gleba oraz pył i kurz
ninie A, prowadzącej hodowlę koni pełnej krwi angielskiej
z opłaszczonymi na powierzchni cząstkami drobno-
i w stadninie B  hodujÄ…cej konie czystej krwi arabskiej
ustrojów.
rodokokoza występuje enzootycznie, a straty spowodowa-
Z przypadków zapalenia płuc z
rebiÄ…t izolowane sÄ…
ne padnięciami z
rebiąt wynosiły w ostatnich latach 5-10%
wyłącznie szczepy posiadające w strukturze plazmid
pogłowia rocznie. W stadninie C, prowadzącej hodowlę
o wielkości 85 lub 90 kpz, w obrębie którego znajduje
koni czystej krwi arabskiej, na przestrzeni ostatnich kilku-
się gen vapA kodujący białko o masie 15-17 kDa, bę-
nastu lat notowano jedynie pojedyncze przypadki zachoro-
dące głównym determinantem zjadliwości zarazka (2).
wań z
rebiąt. We wszystkich fermach przeważa typ gleby
Odsetek szczepów z genetycznie uwarunkowaną wi-
piaszczystej, co w okresie wiosenno-letnim wiąże się z du-
rulencją w populacji środowiskowych izolatów R. equi
żym zapyleniem powietrza. Z uwagi na wieloletni okres
jest zróżnicowany i zależny od rodzaju stadniny. Po-
użytkowania, tereny wokół obiektów inwentarskich są sil-
glądy na temat zależności pomiędzy obecnością i kon-
nie zanieczyszczone nawozem końskim. Średnia tempera-
centracją zjadliwych szczepów zarazka w glebie i wy- tura powietrza w okresie prowadzenia badań wahała się od
stÄ™powaniem choroby w stadninie sÄ… zróżnicowane (4). 8-12°C w kwietniu do 20-25°C w czerwcu i lipcu. Próbki
Badania ekologiczne z zakresu rodokokozy z
rebiąt nie gleby pobierano 4-krotnie w odstępach miesięcznych
z wierzchniej warstwy (0-5 cm) w ilości około 10 g,
były dotychczas wykonywane w warunkach krajowych.
 c na 2006, 62 11) 1 11
Tab. 1. Sekwencje starterów reakcji PCR
uwzględniając miejsca najczęściej użytkowane
przez klacze ze z
rebiętami i z
rebięta. Jednora-

zowo w każdej ze stadnin pobierano próbki
z 15-20 miejsc.
Badanie hodowlane. Do izolacji drobno-
ustrojów z próbek gleby wykorzystano selektyw-
.
ne podłoże NANAT, opracowane przez Wool-
.
cock i wsp. (11). Badaną próbkę o masie 1,0 g
rozcieńczano seryjnie 10-krotnymi objętościa-
mi jałowego płynu fizjologicznego i homogeni-
zowano. Trzy kolejne rozcieńczenia (10 1, 10 2,
10 3) w objÄ™toÅ›ci po 100 µl wysiewano na staÅ‚e podÅ‚oże tów z gatunku R. equi byÅ‚ odpowiednio 4-krotnie i 2,5-
selektywne w płytkach Petriego. Posiewy inkubowano -krotnie niższy. Analiza wyników badań metodą PCR
w temp. 30°C przez 2-3 dni. Po inkubacji liczono podej- z użyciem różnych par starterów wykazaÅ‚a, że w stad-
rzane kolonie bakteryjne w każdym z rozcieńczeń i okreś-
ninach A i B, niezależnie od okresu pobierania pró-
lano liczbę drobnoustrojów w 1 g gleby. Do badań identy-
bek, większy odsetek szczepów R. equi identyfikowa-
fikacyjnych przy użyciu metody PCR wybierano od 5-10
no z użyciem starterów Rq1 i Rq2 w porównaniu do
podejrzanych kolonii bakteryjnych z każdej próbki. A
Ä…cz-
pary Rq for., Rq rev., natomiast w stadninie C stwier-
nie badaniu poddano 464 kolonie bakteryjne (tab. 3).
dzono zależność odwrotną. Wyniki badań uzyskanych
Metoda PCR. Pojedyncze kolonie bakterii, wyselekcjo-
przy wykorzystaniu starterów Vp1 i Vp2, służących
nowane w oparciu o cechy morfologiczne oraz barwienie
do identyfikacji genu vapA kodującego białko deter-
metodą Grama, namnażano w płynnym podłożu LB w ob-
minujące zjadliwość R. equi, wykazały wyraz
nÄ… za-
jÄ™toÅ›ci 5,0 ml w hodowli rotacyjnej w temp. 30°C przez
leżność pomiędzy liczbą szczepów zjadliwych w da-
24 godz. Reakcję PCR wykonywano w dwóch wariantach,
nym środowisku oraz okresem pobierania próbek do
w celu identyfikacji chromosomalnego DNA kodujÄ…cego
badań i typem stadniny (tab. 3). Najwięcej szczepów
podjednostkÄ™ 16S rybosomalnego RNA (rRNA) R. equi 
o genetycznie zaprogramowanej zjadliwości stwier-
do określenia przynależności drobnoustroju do gatunku
R. equi oraz identyfikacji genu vapA w obrębie plazmido-
Tab. 2. Åšrednia liczba bakterii w 1 g gleby, wyliczona w opar-
wego DNA bakterii, kodującego białko powierzchniowe
ciu o liczbę kolonii na podłożu NANAT
VapA, determinujące zjadliwość zarazka. Do ekstrakcji
DNA wykorzystano metodę z użyciem proteinazy K, lizo-
zymu i detergentu kationowego  CTAB (6). Wyizolowany
kwas nukleinowy poddawano amplifikacji z użyciem trzech
l
par starterów, Rq1 i Rq2 oraz Rq for. i Rq rev., komple-
mentarnych do fragmentów DNA kodującego rRNA R. equi
oraz Vp1 i Vp2, komplementarnych do fragmentu genu
l
vapA (tab. 1). Starterów Rq for, Rq rev. oraz Vp1, Vp2
ll
użyto do reakcji PCR-multiplex, służącej do równoczesne-
go potwierdzania przynależności gatunkowej oraz wykry-
wania markera zjadliwości R. equi. Reakcję PCR wykony-
Tab. 3. Identyfikacja gatunkowa oraz markera zjadliwości
wano zgodnie z procedurÄ… podanÄ… przez Bell i wsp. (1)
R. equi metodÄ… PCR
oraz Sellon i wsp. (6).
ni i i o ó i ni
Średnią koncentrację żywych drobnoustrojów w 1 g
gleby wyliczoną dla każdej fermy w poszczególnych
miesiącach analizy próbek przedstawiono w tab. 2. We l
wszystkich fermach największą liczbę drobnoustrojów
w glebie stwierdzono w czerwcu i lipcu. Spośród ba-
danych stadnin najwięcej drobnoustrojów wykazano
w lipcu w fermie A.
Wyniki identyfikacji gatunkowej bakterii oraz mar-
kera zjadliwości przy użyciu metody PCR ilustruje
tab. 3. Dane zawarte w tabeli wskazują, że w bada-
l
nych stadninach odsetek szczepów należących do ga-
tunku R. equi, izolowanych z próbek gleby, był zróż-
nicowany i zależny od okresu pobierania materiału.
Największą liczbę bakterii stwierdzono we wszystkich
ll
stadninach w czerwcu i lipcu. We wcześniejszych okre-
sach pobierania próbek (kwiecień, maj) odsetek izola-
1 12 c na 2006, 62 11)
dzono w miesiącach letnich (czerwiec, lipiec) w stad- szczepami zjadliwymi oraz narażenia z
rebiÄ…t na zaka-
ninach A i B, w których rodokokoza występuje en- żenie. Dodatkową zaletą techniki PCR jest, w odróż-
zootycznie. W stadninie C, w której choroba wystę- nieniu od standardowych metod analizy profilu plaz-
puje sporadycznie, w poszczególnych okresach badań midowego i białkowego, prostota i szybkość wykona-
stwierdzono znacznie mniejszą liczbę szczepów zjad- nia, a także niezależność uzyskiwanych wyników od
liwych. czynników oddziałujących na plazmidy oraz ekspre-
Określenie stopnia zanieczyszczenia środowiska sję białka w komórkach bakteryjnych, jak np. warunki
hodowlanego zjadliwymi szczepami R. equi ma istot- hodowli.
ne znaczenie dla oceny skali zagrożenia młodych z
re- W pojedynczych próbkach gleby, pochodzących z te-
biąt rodokokozą oraz pozwala na podjęcie we właści- renu tej samej stadniny, znajdować się mogą różne
wym czasie działań, zmierzających do ograniczenia szczepy tego samego gatunku R. equi (4). Analogicz-
ekspozycji na zakażenie (9, 10). Rhodococcus equi nie materiał do badań, pochodzący z ferm zlokalizo-
zawsze uważany był za mikroorganizm glebowy, ale wanych w różnych regionach geograficznych może
jego izolacja z próbek pochodzących ze środowiska zawierać drobnoustroje różniące się między sobą
była znacznie utrudniona z uwagi na zanieczyszcze- cechami fenotypowymi oraz strukturą materiału ge-
nie badanego materiału konkurencyjną florą bakteryj- netycznego. Ten fakt tłumaczy stwierdzaną niekiedy
ną i grzybiczą (4). Opracowanie przez Woolcock i wsp. rozbieżność wyników badań diagnostycznych uzyski-
(11) selektywnego podłoża do izolacji R. equi z gleby wanych w różnych laboratoriach oraz przy wykorzy-
stworzyło podstawy do przeprowadzenia szerzej za- staniu różnych technik badawczych (4). Analiza wy-
krojonych badań ekologicznych i epidemiologicznych ników badań własnych, dotyczących zastosowania me-
dotyczących tego zarazka oraz umożliwiło wykazanie tody PCR z użyciem różnych par starterów do identy-
związku pomiędzy obecnością drobnoustrojów w gle- fikacji DNA kodującego rRNA R. equi wskazuje na
bie i przewodzie pokarmowym z
rebiąt i koni dorosłych zróżnicowanie genetyczne szczepów pochodzących ze
a występowaniem rodokokozy (4, 8, 10). W badaniach stadnin A, B i C. Zastosowanie starterów reakcji kom-
tych wykazano, że R. equi aktywnie namnaża się w gle- plementarnych do różnych fragmentów chromosomal-
bie i kale z
rebiąt, co umożliwia, zwłaszcza w okresie nego DNA zarazka pozwala zatem na identyfikację
wiosenno-letnim, szerokie rozprzestrzenienie zarazka w badanym materiale większej liczby szczepów nale-
w populacji koni i w środowisku hodowlanym. Pro- żących do gatunku R. equi oraz znacznie podnosi wia-
gresywny wzrost koncentracji żywych drobnoustrojów rygodność wyników. Uzyskane w badaniach własnych
w glebie w miesiącach letnich, wykazany w badaniach wyniki pośrednio wskazują także na możliwość za-
własnych, stanowi potwierdzenie wyników badań eko- stosowania pojedynczej reakcji PCR lub PCR-multi-
logicznych uzyskiwanych przez innych autorów. Po- plex do typowania molekularnego szczepów R. equi.
równanie wyników badania hodowlanego i metody
i i nnic o
PCR sugeruje ostrożność w interpretacji wyników
1.Bell K. S., Philp J. C., Christofi N., Aw D. W.: Identification of Rhodococcus
posiewów odnośnie do identyfikacji wszystkich kolo-
equi using the polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol. 1996, 23,
nii bakteryjnych jako należących do gatunku R. equi
72-74.
(tab. 3).
2.Giguere S., Prescott J. F.: Clinical manifestations, diagnosis, treatment, and
prevention of Rhodococcus equi infections in foals. Vet. Microbiol. 1997,
O łatwości namnażania R. equi w glebie decyduje
56, 313-334.
podwyższona temperatura zewnętrzna oraz obecność
3.Grądzki Z., Ziętek A., Boguta L., Winiarczyk S., Wołoszyn S.: Rodokokoza
dużej ilości materii organicznej (2). Wcześniejsze ba-
z
rebiÄ…t. Medycyna Wet. 2002, 58, 915-920.
4.Martens R. J., Takai S., Cohen N. D., Choffin M. K., Liu H., Sakurai K.,
dania wykazały, że w stadninach z enzootycznie wy-
Sugimoto H., Lingsweiler S. W.: Association of disease with isolation and
stępującą rodokokozą zanieczyszczenie gleby zjadli-
virulence of Rhodococcus equi from farm soil and foals with pneumonia.
wymi szczepami R. equi jest zwykle duże, natomiast
J. Am. Vet. Med. Assoc. 2000, 217, 220-225.
5.Meijer W. G., Prescott J. F.: Rhodococcus equi. Vet. Res. 2004, 35, 383-396.
w fermach, w których choroba występuje sporadycz-
6.Sellon D. C., Walker K., Suyemoto M., Altier C.: Nucleic acid amplification
nie lub wcale nie występuje  minimalne (7). Taką
for rapid detection of Rhodococcus equi in equine blood and tracheal wash
zależność jednoznacznie potwierdzają wyniki badań
fluids. Am. J. Vet. Res. 1997, 58, 1232-1237.
7.Takai S.: Epidemiology of Rhodococcus equi infections: A review. Vet.
własnych.
Microbiol. 1997, 56, 167-176.
Populacja drobnoustrojów glebowych należących do
8.Takai S., Fujimori T., Katsuzaki K., Tsubaki S.: Ecology of Rhodococcus
gatunku R. equi nie jest jednorodna. Od z
rebiÄ…t pad-
equi in horses and their environment on horse-breeding farms. Vet. Micro-
biol. 1987, 14, 233-239.
łych z objawami zapalenia płuc izolowane są natomiast
9.Takai S., Ohbushi S., Koike K., Tsubaki S., Oishi H., Kamada M.: Prevalence
wyłącznie szczepy o zaprogramowanej genetycznie
of virulent Rhodococcus equi in isolates from soil and feces of horses from
zjadliwości (2, 7). Wyniki badań izolatów własnych,
horse-breeding farms with and without endemic infections. J. Clin. Micro-
biol. 1991, 29, 2887-2889.
pochodzących z próbek gleby, na obecność genu vapA,
10.Takai S., Tsubaki S.: The incidence of Rhodcoccus (Corynebacterium) equi
warunkującego zjadliwość R. equi są zbliżone do uzys-
in domestic animals and soil. Jpn J. Vet. Sci. 1985, 47, 493-496.
kiwanych w badaniach innych autorów (9). Wskazują
11.Woolcock J. B., Farmer A. M., Mutimer M. D.: Selective medium for Cory-
one także na przydatność metody PCR do wykrywa- nebacterium equi isolation. J. Clin. Microbiol. 1979, 9, 640-642.
nia markera zjadliwości bakterii, co pozwala na ocenę
Adres autora: prof. dr hab. Zbigniew GrÄ…dzki, ul. Bursztynowa 15/109,
stopnia zanieczyszczenia środowiska hodowlanego 20-576 Lublin; e-mail: [e-mail]