Klasyfikacja pierwotnych niedoborów odporności
(PID)
Pęknięcia DNA i epigenetyczne zmiany DNA
Defekty wrodzonej odporości.
Receptory i cząsteczki sygnałowania
Defekty funkcji fagocyów
Niedobory składników dopełniacza
Inne dobrze
zdefiniowane niedobory
Defekty alternatywnych szlaków
immunologiczne
dopełniacza
Białka regulatorowe komplementu
Defekty apoptozy limfocytów
Periodic fever syndromes
Złożone niedobory B i T
Niedobory humoralne
komórkowe
Proces diagnostyczny u pacjentów z podejrzeniem PID
1. Kliniczna i immunologiczna ocena pacjenta
miedzynarodowy protokól (ESID) u dzieci z podejrzeniem PID
2. Ocena ilościowa i jakościowa (immunofenotyp) oraz tesy
funkcjonalne komórek układu odpornościowego we krwi lub szpiku:
-czy poziom komórek jest prawidłowy (subpopulacje krążących
limfocytów),
-czy komórki mają ekspresję odpowiednich białek,
-czy ich funkcja jest prawidłowa?
3. Molekularna diagnostyka wytypowanych genów (candidate genes)
Ocena mutacji genu (selekcja podejrzanego genu na podstawie badań
immunofenotypu i funkcji komórek)
4. Poradnictwo genetyczne i diagnoza pranatalna
Współpraca z genetykami klicznymi
Subpopulacje krążących limfocytów
Dojrzewanie limfocytów T
Dojrzewanie limfocytów B w szpiku
Dojrzewanie
limfocytów B na
obwodzie
Immunofenotyp dojrzewających limfocytów
Dojrzewanie komórek B i T versus wybrane defekty
Agammaglobulinemie
Agammaglobulinemia sprzężona z chromosomem X
(choroba Brutona):
vð
mutacja genu btk zlokalizowanego na długim ramieniu
chromosomu X (Xq22)
vð
zatrzymanie różnicowania limfocytów B na etapie pre-B,
w fazie rearanżacji łańcucha ciężkiego z powodu braku
kinazy tyrozynowej.
AR agammaglobulinemia
vð
rzadka forma
vð
5-10% dziewczynki
vð
mutacje genów kodujących łańcuch ź, IgGą, czy mutacje
białka Blnk
BTK w PID: gen, mRNA oraz białko
Dotychczas odkryto ponad 500 mutacji Btk, ale żadna z
nich nie występuje częściej niż u 3% chorych
X-linked agammaglobulinemia
IgM
Bone marrow Periphery
BTK
IgG
IgM IgM
IgD
CD19 CD19+ CyIg µ+
IgA
Pro-B Pre-B-I Pre-B-II immature mature
IgE
Ig gene rearrangements
class switch recombination
SHM
Cytometryczna analiza ekspresji białka BTK
CD79A (kompleks BCR) w PID: gen, mRNA i białko
Agammaglobulinemia AR  niedobór CD79a
IgM
Bone marrow Periphery
CD79A
BTK
IgG
IgM IgM
IgD
µ+
CD19 CD19+ CyIg
IgA
Pro-B Pre-B-I Pre-B-II immature mature
IgE
Ig gene rearrangements
class switch recombination
SHM
BLNK w PID: gen, mRNA oraz białko
Agammaglobulinemia AR  niedobór BLNK
CD19 w PID: gen, mRNA i białko
M. van Zelm et al., N Eng J Med 2006(354)354:1901-12.
Mutacja CD19
Zdrowy
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
100 101 102 103 104
CD19 PE CD19 FITC
CD19 APC
CD19 (SJ25C1) CD19 (4G7) CD19 (HIB19)
Pacjent
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
CD19 APC CD19 PE CD19 FITC
CD19 (SJ25C1) CD19 (4G7) CD19 (HIB19)
Dept. of Immunology, Erasmus MC, Rotterdam
02 DC 02 DC
Mutacja CD19
ZESPÓA
HIPER IgM (HIM)
PATOGENEZA
vð
70% dziedziczony z chromosomem X (HIGM1)
vð
mutacja genu kodujÄ…cego ligand dla receptora CD40
(upośledzenie interakcji pomiędzy CD40L na aktywowanych
limfocytach T z CD40 na limfocytach B).
vð
brak różnicowania izotypowego z IgM do IgG, IgA, IgE
vð
zahamowanie rozwoju centrów rozrodczych w narządach
limfatycznych i indukcji pamięciowych limfocytów B
vð
typ niezwiÄ…zany z chromosomem X (HIGM2)
CD154 (CD40L) w PID: gen, mRNA oraz białko
C D 1 g5 e4 ( X e q 2 6 . 3 - 2 7 . 1 ; 1 2 k b )
n
U T R U T R
C 7 8 2 T
m R N A
( 1 8 0 0 b p
T 2 5 4 M
p r o t e i n
( 2 6 0 a a ;
3 3 k D a )
H o t l o T o Mp s T N F
C D 1 5 4
HIM
CI
ŻKIE ZA
OŻONE NIEDOBORY ODPORNOŚCI -
SCID
(Severe Combined Immunodeficiencies)
1. T- B+ (brak limfocytów T, obecne B) NK+/- defekt:
a) sprzężony z chromosomem X (common gamma chain)
b) JAK3
c) IL7RÄ…
d) CD45
e) CD3´/CD3µ/CD3¾
2. T- B- (we krwi obwodowej brak limfocytów T i B) NK +/- defekt:
a) niedobór RAG1 lub RAG2
b) Artemis
c) niedobór dezaminazy adenozyny (ADA)
d) dyzgenezja siateczki
CD132 (common gamma chain) w PID:
gen, mRNA oraz białko
C D 1 g 3 e 2 n e ( X q 1 3 . 1 ; 4 . 1 k b )
U T R U T R
9 8 i n s A
C D C2 5D 1 2 2 C D 1 2 7
m R N A
C D 1 3 2 C D 1 3 2
( 1 4 5 1 b
7 9 s t o p c o d o n
p r o t e i n
( 3 6 9 a a
6 4 k D a
I L - 2 R I L - 7 R s i g n a l F N 3 M H o t l o o p s
T
p e p t i d e
a l s o p r e s e n t i n I L - 4 R ,
I L - 9 R a n d I L - 1 4 R
Rearanżacja genów IGH
Funkcja RAG, Artemis, Ligazy IV oraz TdT
Vº Vº Jº
RAG1/RAG2 complex binds
1
to RSS DNA cleavage
hairpin blunt
coding ends signal ends
DNA-PKcs, Ku70/Ku80
and Artemis
hairpin cleavage
2
opened
hairpins
ligation by
TdT activity
DNA Ligase IV
and XRCC4
signal joint
coding joint
Genetyczna diagnoza pierwotnych
niedoborów odporności (PID)
" Genetyczna diagnoza jest możliwa dla
wszystkich niedoborów odporności,
w których zidentyfikowano mutację
" Przydatność kliniczna - definitywna
diagnoza
PID genetyka
" Opisano ponad 200 PIDs
" znanych jest ponad 150 genów zaangażowanych PIDs
X
22 1
21
19
17 2
16
4
15
12 5
11
6
10
7
9 8
Diagnoza definitywna
" diagnoza na poziomie białka
 Test stwierdzające brak produktu białkowego mogą być
użyte do diagnozy

Cytometria przepływowa, SDS-PAGE, Western blot

Mogą być szybkie, ale wynik może być niejednoznaczny
" analiza mutacji genetycznych

Może być użyta do zdiagnozowania pacjenta

Umożliwia jednoznaczne ustalenie nosicielstwa u
spokrewnionych kobiet

Możliwość diagnozy prenatalnej, diagnoza przed
implantacjÄ…
Badanie obecności białka:
Analiza autofosforylacji Btk  Analiza cytometryczna
metoda Westen blot obecności Btk
Metody analizy mutacji
" Duże delecje lub rearanżacje genów

analiza cytogenetyczna

Southern blot
" Mutacje punktowe, małe insercje lub delecje

Metody przesiewowe

bezpośrednie sekwencjonowanie
Techniki bezpośredniego wykrywania
mutacji
1. Analizy DNA
Ia- izloacja DNA
Ib- amplifikacja fragmentów genów, z reguły sekwencji kodujących
Ic- wstępne wykrywanie zaburzeń w produktach amplifikacji
technikami przesiewowymi
Id- sekwencjonowanie
Ie- wykrywanie dużych przemieszczeń (metoda Southerna, RFLP)
1a. Izolacja DNA
- Usunięcie białek z lizatu komórkowego poprzez
trawienie proteinazÄ… K i ekstrakcji w mieszaninie fenolu i
chloroformu.
- Z odbiałczonych próbek kwasy nukleinowe wytrąca się
alkoholami: etylowym lub izopropylowym.
1b. Amplifikacja fragmentów
genów
Powielanie fragmentów badanego DNA za
pomocą reakcji (PCR). W skład mieszaniny
reakcyjnej wchodzÄ…: matryca DNA (zwykle
genomowe DNA), polimeraza DNA, para
specyficznych starterów ( primers ),
trójfosforany deoksyrybonukleotydów oraz
bufor reakcyjny.
1c. Techniki przesiewowe
1) SSCP (single stranded conformational polymorphism)
zmian konformacji jednoniciowego DNA
2) HA (heteroduplex analysis) analiza heterodupleksów
i jej  odmiana DHPLC (Denaturing High-performance Liquid
Chromatography)
SSCP (badanie zmian konformacji
jednoniciowego DNA)
Jednoniciowe DNA w roztworze wykazuje określoną
strukturę drugorzędową zależną od sekwencji DNA.
Mutacje punktowe, delecje i insercje powodujÄ…
zmiany struktury drugorzędowej, która wpływa na
szybkość poruszania się nici w trakcie elektroforezy
na niedenaturujących żelach poliakrylamidowych.
Nici normalne i zmutowane wykazujÄ… odmiennÄ…
ruchliwość elekroforetyczną.
HA - analiza heterodupleksów
Mix sekwencji prawidłowej (WT) i sekwencji z mutacją w
reakcji PCR (jako matryce) - produkty tej reakcji to cztery
różne dwuniciowe fragmenty DNA.
Dwa z nich to homodupleksy, czyli struktury dwuniciowe w
pełni komplementarne. Dwa inne to heterodupleksy
zawierajÄ…ce miejsca niesparowane (mismatch).
Heterodupleksy ze zmianÄ… nawet jednej zasady mogÄ…
wykazywać inną niż homodupleksy ruchliwość podczas
elektroforezy na żelu poliakrylamidowym . HA można
czasem wykryć zaburzenia genów, które nie są wykrywane
przez SSCP
Heteroduplex
A
WT
Homo
T
A
A
WT
A:C
T
Mix, denature
Het
& reanneal
C
G
G
MUT
C
G:T
Het
T
MUT
G
Homo
C
Eg. Homozygous A>G substitution
The Scientist 1999, 13(19):15
1d. Sekwencjonowanie
1) amplifikacja wybranego fragmentu genu przy użyciu pary
specyficznych starterów
2) asymetryczny PCR - dla każdej próbki amplifikacja osobno z każdym
ze starterów z zastasowanie nukleotydów standardowych i
znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi
3) elekroforeza na denaturującym żelu poliakrylamidowym z
równoczesną detekcją przepływających produktów
Powstają różniące się długością oligonukleotydy komplementarne do
matrycy i zawierające na 3 -końcu fluorochrom. Zostają one
rozdzielone podczas elektroforezy od najkrótszego po najdłuższy, a
kolejność kolorowych nukleotydów odczytana jako sekwencja
komplementarna do matrycy. Porównanie otrzymanej sekwencji z
sekwencją prawidłową z dostępnych baz danych takich jak GenBank i
Ensemble
1d. Sekwencjonowanie (1)
1d.
Sekwencjonowanie (2)
1e. Wykrywanie dużych przemieszczeń
(Southern blotting, RFLP)
-Genomowe DNA trawi siÄ™ enzymami restrykcyjnymi.
-Powstałe fragmenty rozdziela się elektroforetycznie na żelu
agarozowym.
-Fragmenty poddaje siÄ™ denaturacji i przenosi na filtr
nitrocelulozowy lub nylonowy.
-ZwiÄ…zany z filtrem jednoniciowy DNA hybrydyzuje z DNA
wyznakowanym i komplementarnym do analizowanego
fragmentu (z sondÄ…).
-Wywołuje się obraz prążków w celu zidentyfikowania pozycji
prążków zajętych przez sondę. Duże delecje, insercje, inwersje
bÄ…dz
translokacje zwykle zmieniają pozycje i intensywność
prążków (bo zmieniają się odległości pomiędzy miejscami
restrykcyjnymi, a więc i długości analizowanych fragmentów).
1e. Southern blotting, RFLP
metoda Southern blot
Analiza RNA
2a) izolacja RNA
2b) amplifikacja części kodujących genów
2c) wykrywanie zaburzeń w produktach
amplifikacji
2a. Izolacja RNA
IzolacjÄ™ RNA przeprowadza siÄ™ w podobny
sposób jak izolację DNA. Jednak ze względu
na wszechobecność termostabilnych RNaz w
tkankach, izolacja RNA wymaga użycia
inhibitora RNaz.
2b. RT/PCR - reverse transcription
PCR
- Przepisanie RNA na cDNA (komplementarne DNA)
za pomocÄ… odwrotnej transkryptazy
- Amplifikacja cDNA - RNA nie zawiera intronów więc
do powielenia kodującej części wybranego genu
wystarcza zwykle kilka par starterów
-Oceniając cDNA na żelach agarozowych można
wykryć delecje lub insercje fragmentów o długości
powyżej kilkudziesięciu par zasad.
Techniki przesiewowe
Metoda Zalety Wady
Prosta i tania, startery
SSCP
Czułość zależna od warunków
zsyntetyzowane do SSCP mogą być
elektroforezy, długości
równocześnie stosowane do
fragmentów (200-300pz)
sekwencjonowania, HA oraz CMC
Bardzo prosta i tania, wymaga Wpływ rodzaju niesparowania
HA
niewielkiej optymalizacji dla na możliwość detekcji,
różnych fragmentów, Specyficzne optymalna długość fragmentów
zmiany sekwencji tworzÄ… rozpoznawalne
<700bp
paterny