OZNACZANIE NIEORGANICZNEGO FOSFORANU
METODĄ FISKE-SUBBAROWA
Część doświadczalna obejmuje:
− przygotowanie rozcieńczonych roztworów KH2PO4
− wykonanie oznaczeń
− wykreślenie krzywej kalibracyjnej i wyliczenie średniego współczynnika kierunkowego WPROWADZENIE
Ilościowe oznaczanie fosforanów metodą Fiske-Subbarowa oparte jest na reakcji jonów or-tofosforanowych (V) z molibdenianem (VI) amonu w środowisku kwaśnym. Powstającą w wyniku reakcji sól amonową kwasu czterotrójmolibdenianofosforowego poddaje się redukcji kwasem 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowym (eikonogen). W wyniku tej reakcji, molibdenian (VI) związany w soli kompleksowej ulega redukcji do niższych tlenków molibdenu dając tzw. błękit molibdenowy (maksimum absorpcji przy 660nm).
odczynnik redukujący
(NH
(eikonogen)
4)2MoO4
PO -3
4 (NH4)3 P(Mo3O10)4 (Mo2O5 · MoO3) błękit molibdenowy
Po wykonaniu reakcji barwnej przeprowadza się pomiar absorbancji przy długości fali λ =
660 nm. Zawartość fosforanu w badanej próbie określa się na podstawie wyznaczonej dla wzorcowych roztworów ortofosforanu (V) zależności ich absorbancji od stężenia.
WYKONANIE
Odczynniki:
1. 50mM bufor Tris-HCl, pH 8,6
2. 10% roztwór TCA
3. 5M H2SO4
1
4. 2,5% roztwór molibdenianu (VI) amonu w 0,25 M H2SO4
5. 0,25% eikonogen (kwas 1-amino-2-naftolo-4-sulfonowy). Rozpuścić w wodzie 7,5 g Na2S2O5 i 1 g Na2SO3 w kolbie miarowej na 100 ml, a następnie dodać 0,25 g eikonogenu. Uzupełnić wodą do 100 ml. Roztwór przechowywany w ciemnej, szczelnie zamkniętej butelce jest trwały przez kilka tygodni.
6. 40 mM roztwór KH2PO4.
Wyznaczanie krzywej standardowej:
1. W 100 ml kolbce miarowej przygotować 40 mM roztwór wyjściowy KH2PO4 w 50 mM
buforze Tris-HCl, pH 8,6, z którego następnie należy sporządzić roztwory o stężeniu: 0,4
mM, 0,8 mM, 1,2 mM, 1,6 mM, 2,0 mM, 3,2 mM i 4,0 mM, używając do rozcieńczeń 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,6. Rozcieńczenia przygotować w 50 ml kolbkach miaro-wych.
2. Do 16 oznakowanych probówek odmierzyć po 0,9 ml 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8,6.
Do każdej probówki dodać po 0,1 ml roztworu fosforanu o odpowiednim stężeniu (dla każdego stężenia wykonać dwie równoległe próby). Do prób zerowych (odniesienia) zamiast fosforanu napipetować po 0,1 ml H2O destylowanej (Uwaga! Wymienić końców-kę pipety przed pipetowaniem wody)
3. Do każdej próby dodać kolejno: 0,5 ml 10% roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA), a następnie po 0,4 ml mieszaniny zawierającej: 5M H2SO4, 2,5% molibdenian (VI) amonu, wodę dest. zmieszanych w stosunku 1 :2 :1. Próby dokładnie wytrząsnąć, a następnie napipetować po 0,1 ml eikonogenu. Próby, po wytrząśnięciu, wstawić na 10 minut do łaźni wodnej o temperaturze 300C w celu przyspieszenia reakcji powstawania błękitu molib-denowego.
4. Zmierzyć absorbancję prób wobec próby zerowej (odniesienia) przy λ = 660nm. Obliczyć wartości średnie absorbancji z dwóch powtórzeń. Wykreślić krzywą standardową, odkładając absorbancję na osi rzędnych, a stężenie ortofosforanu w badanych próbach na osi odciętych.
2
5. Obliczyć zawartość fosforanu w kolejnych próbach (ilość powinna być podana w µmo-lach). Obliczyć wartości współczynnika kierunkowego (k), a następnie średniego współ-
czynnika kierunkowego:
µmole KH2PO4 w próbie
k =
A660nm
Zagadnienia do przygotowania:
− roztwory (stężenia procentowe, roztwory molowe, rozcieńczenia, przeliczenia)
− kolorymetria
Literatura:
Ćwiczenia z biochemii – pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN Warszawa, 2005
Obliczenia biochemiczne – Zgirski A, Gondko R, PWN Warszawa, 1998
3