Oznaczanie niebiaowych składników organicznych krwi
Oznaczanie mocznika
Mocznik powstaje w wtrobie z amoniaku (silnie toksycznego metabolitu) i dwutlenku wgla, jako kocowy produkt przemiany biakowej w organizmach ureotelicznych, i jest wydalany przez nerki.
Wartoci prawidowe dla krwi cakowitej (osocza lub surowicy) wynosz 15 - 40 g/l (2,49 - 6,66 mmol/l), a dla moczu 20 - 35 g/24 h.
Dawniej mocznik w surowicy krwi oznaczano gazometryczn metod Kowarskiego -
mierzc objto uwolnionego z mocznika przez NaOH i NaBrO azotu czsteczkowego lub metod Yatzidisa - tworzc, po zaadsorbowaniu na wglu aktywnym zwizków azotowych, barwny kompleks mocznika z p-dwumetyloaminobenzaldehydem. Obecnie wikszo metod opiera sie o enzymatyczn hydroliz mocznika przez ureaz, której produktem jest zwizek amonowy. Róny jest sposób dalszego oznaczania jonów amonowych. Moe to by, po strceniu biaek, reakcja z odczynnikiem Nesslera. Moe to by reakcja z podchlorynem sodu i m-krezolem (lub fenolem) w obecnoci nitroprusydku sodu dajca bkit indokrezolowy (lub indofenolowy). Moe to by wreszcie metoda referencyjna, gdzie dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH) katalizuje redukcyjn aminacj oksoglutaranu do glutaminianu, a obnienie stenia NADH (pomiar absorbancji przy 340 nm) jest proporcjonalne do stenia mocznika.
Oznacznie kwasu moczowego
Kwas moczowy jest zwizkiem, który moe by pochodzenia egzogennego i endogennego, kiedy powstaje jako kocowy produkt przemiany purynowej w organizmach zwierzt nie utleniajcych go dalej.
Wartoci prawidowe dla surowicy wynosz 178 - 345 μ mol/l (30 - 58 mg/l), a dla moczu 1,500 - 4,750 mmol/24 h (250 - 800 mg/h).
Dawniej kwas moczowy oznaczano w odbiaczonej surowicy krwi przy pomocy metody Heimeyera, w której, w rodowisku alkalicznym, kwas moczowy redukowa kwas fosfowolframowy do niebiesko zabarwionych tlenków wolframu. Obecnie szeroko stosuje si
metod z urikaz, która w sposób wysoko specyficzny utlenia kwas moczowy do alantoiny i nadtlenku wodoru. Dalej mona uy peroksydazy, która wykorzystuje powstay nadtlenek wodoru do utlenienia 4-aminofenazonu i kwasu 3,5-dwuchloro-2-hydroxybenzenosulfonowego do N-(4-antypirylo)-3-chloro-5-sulfoniano-p-benzochinonoiminy; pomiar absorbancji przy 510 -
520 nm. Mona te wykorzysta reakcj z katalaz, która utlenia etanol do acetaldehydu wykorzystujc nadtlenek wodoru, a nastpnie z dehydrogenaz aldehydow utleniajc
acetaldehyd do octanu z wytworzeniem NADPH, który daje przyrosty absorbancji przy 340 nm.
1
Kreatyna powstaje w organizmie jako produkt transamidacji glicyny z udziaem argininy, z nastpujc potem metylacj powstaego guanidynooctanu przez S-adenozylometionin. Kreatyna we krwi prawie w caoci znajduje si w krwinkach, a jej bezwodnik czyli kreatynina podzielona jest równomiernie pomidzy osocze i krwinki. Prawie 98 % kreatyny organizmu wystpuje w miniach jako fosfagen czyli dostarczajce energii do skurczu poczenie z kwasem fosforowym.
Wszystkie obecnie stosowane metody oznaczania kreatyniny opieraj si na reakcji Jaffe'go z roku 1886, z rónymi jej modyfikacjami. Kreatynina z kwasem pikrynowym w
rodowisku alkalicznym daje óto-pomaraczowy kompleks, którego absorbancj mierzymy przy 510 - 530 nm.
kreatynina + pikrynian sodu -rodowisko alkaliczne barwny kompleks
O
znaczanie kreatyniny kinetyczn procedur r
eakcji Jaffe'go
Zasada metody:
Metoda wykorzystuje reakcj Jaffe'go w jej wersji kinetycznej, która jest szybsza, prostsza i minimalizuje moliwe interferencje z biakami i glukoz.
Odczynniki:
a.
wzorzec kreatyniny - 177 μ mol/l (20 mg/l) roztwór kretyniny w wodzie zakwaszony dla lepszego rozpuszczenia kilkoma ml 0,1M HCl na litr
b.
20,5 nM kwas pikrynowy
c.
1,25 mM NaOH
d.
odczynnik roboczy - 9 objtoci kwasu pikrynowegp i 1 objto NaOH.
Materia badany:
Surowica lub osocze heparynowe albo z EDTA bez ladów hemolizy.
Sposób wykonania:
Do kuwet odmierzy wedug tabeli :
Próba badana
Próba wzorcowa
Próba zerowa
odczynnik
1 ml
1 ml
1 ml
próba badana
0,1 ml
-
-
wzorzec
-
0,1 ml
-
woda
-
-
0,1 ml
Wymiesza starannie. Po 20 sekundach mierzyc absorbancj próby wzorcowej i badanej wobec zerowej przy 510 nm.
2
Mierzy powtórnie absorbancj po dokadnie takim samym czasie po pierwszym pomiarze (1
lub 2 minuty).
Oblicznie wyników:
Stnie kreatyniny wyliczamy wedug wzoru :
Δ absorbancji próby badanej x 177
[μ mol/l] = ------------------------------------------------------------
Δ absorbancji próby wzorcowej
Wartoci prawidowe:
Surowica -
kobiety - 53 - 80 μ mol/l (6 - 9 mg/l)
mczyni - 62 - 110 μ mol/l (7 - 12,4 mg/l),
Krew pena - 3 - 5 mg/l,
Mocz -
kobiety - 65 -189 μ mol/kg wagi ciaa/24 h
(7,3 - 21,4 mg/ -"-
)
mczyni - 77 -217 μ mol/kg wagi ciaa/24 h
(8,7 - 24,6 mg/ -"-
).
Oznaczanie bilirubiny
Bilirubina powstaje w ukadzie siateczkowo-ródbonkowym szpiku, ledziony i wtroby, jako wynik fizjologicznego rozpadu krwinek czerwonych i hemoglobiny, a take innych hemoprotein. Bilirubina przedostaje si do krwioobiegu i jest transportowana w osoczu krwi do wtroby gównie jako poczenie z albuminami i czciowo globulinami (tzw.
bilirubina porednia, nierozpuszczalna w wodzie), ale jej cz wystpuje w surowicy w postaci rozpuszczalnych w wodzie koniugatów (tzw. bilirubina bezporednia).
Oznacznie bilirubiny z kwasem p-dwuazobenzenosulfonowym opiera si na reakcji Ehrlicha z 1884 roku, w której powstaje barwnik azowy majcy róowe zbarwienie w
rodowisku kwasnym a niebieskie w zasadowym. Bilirubin cakowit oznacza si gównie metod Jendrassik'a i Grof'a w obecnoci czynników solubilizujcych - kofeiny z benzoesanem sodu i octanem sodu, natomiast bilirubin bezporedni metod Schellong'a i Wende'go bez dodawania akceleratora. Obecnie istnieje cay szereg modyfikacji powyszych metod uywanych w analityce.
O
znaczanie bilirubiny ca k owitej i bezpo r edniej
Zasada metody:
Azobilirubina powstala w czasie reakcji bilirubiny z sol dwuazow kwasu sulfonowego daje w
rodowisku kwasnym maksimum absorbancji przy 555 nm. W wypadku braku akceleratora reaguje tylko bilirubina niezwizana. W jego obecnoci tj. dwumetylosulfotlenku (DMSO), bilirubina zwizana równie uczestniczy w reakcji, tym samym okrela si poziom bilirubiny 3
Odczynniki:
a.
odczynnik 1 - 29 mmol/l kwas sulfanilowy, 145 mmol/l kwas solny i 7 mmol/l DMSO
b.
odczynnik 2 - 29 mmol/l kwas sulfanilowy i 145 mmol/l kwas solny
c.
odczynnik 3 - 17 mmol/l azotynu sodu
d.
mieszanina reagujca T - 20 obj. odczynnika 1 i 1 obj. odczynnika 3
e.
mieszanina reagujca D - 20 obj. odczynnika 2 i 1 obj. odczynnika 3
f.
wzorzec - 2 mg/100 ml roztwór bilirubiny w chloroformie.
Materia badany:
Surowica lub osocze; antykoagulanty nie maj znaczenia.
Sposób wykonania:
Do probówek odmierzy wedug tabeli :
Próba
Bilirubina cakowita
Bilirubina bezporednia
badana
zerowa
badana
zerowa
surowica (lub wzorzec)
0,1 ml
0,1 ml
0,1 ml
0,1 ml
mieszanina T
1 ml
-
-
-
mieszanina D
-
-
1 ml
-
odczynnik 1
-
1 ml
-
-
odczynnik 2
-
-
-
1 ml
Wymiesza starannie i inkubowa w temperaturze pokojowej - bilirubin cakowit 10 minut a bilirubin bezporedni - 5 minut.
Mierzy absorbancj próby badanej i wzorcowej wobec zerowej prz 555 nm (530 - 580).
Obliczanie wyników:
Stenie bilirubiny akowitej lub bezporedniej wyliczamy ze wzoru :
absorbancja próby badanej x stenie wzorca
[μ mol/l lub mg/l] = ------------------------------------------------------------------------
absorbancja próby wzorcowej
Wartoci prawidowe:
Bilirubina cakowita :
do 17 μ mol/l (10 mg/l)
4
do 3,4 μ mol/l (2 mg/l).
Oznaczanie glukozy
Glukoza jest chyba najbardziej niezbdnym skadnikiem prawidowo funkcjonujcego metabolizmu podstawowego i wtórnego; jest ródem energii, reguluje metabolizm tuszczów, uatwia metabolizm toksyn, przyspiesza regenaracj tkanek, itp., itd. Powstaje w organizmie w procesie glukoneogenezy i glikogenolizy oraz pobierana jest z pokarmem, a jej poziom regulowany jest hormonalnie.
Oznaczana moe by metodami chemicznymi lub enzymatycznymi :
-
metod Hagedorna-Jensena - miareczkowanie jodometryczne po uprzednim utlenieniu cyjanoelazianem potasu
-
metod Nelsona - reakcja barwna z odczynnikiem arsenomolibdenowym po uprzednim utlenieniu jonem miedziowym
-
metoda z o-toluidyn - barwny produkt kondensacji z o-toluidyn w rodowisku kwanym
-
metoda z dehydrogenaz glukozy - pomiar spektrofotometryczny iloci utworzonego w reakcji NADH
-
metoda z oksydaz glukozy - oksydaza utlenia glukoz wytwarzajc równoczenie nadtlenek wodoru, który oznaczany jest poprzez utlenianie chromogenu przez peroksydaz do mierzonego spektrofotometrycznie barwnika.
Zalecane jest wykonywanie oznacze w surowicy krwi wolnej od hemolizy lub w osoczu heparynowym; wane jest szybkie oddzielenie krwinek czerwonych, w obecnoci których nastpuje glikoliza i spadek stenia glukozy.
Wartoci prawidowe :
krew kapilarna 0,7 - 1,0 g/l (3,9 - 5,6 mmol/l)
krew ylna
0,5 - 1,0 g/l (2,8 - 5,6 mmol/l)
surowica, osocze
0,75 - 1,15 g/l (4,2 - 6,4 mmol/l)
PMR
0,45 - 0,70 g/l (2,5 - 3,9 mmol/l)
mocz
do 0,15 g/l (do 0,83 mmol/l).
Oznaczanie cholesterolu
Cholesterol jest najwaniejszym sterydem organizmu :
-
stanowi skadnik bon komórkowych
-
bierze udzia w transporcie kwasów tuszczowych
-
jest prekursorem innych zwizków sterydowych - kwasów óciowych, hormonów sterydowych oraz witaminy D3 i jej pochodnych.
Jego synteza z acetylo-CoA zachodzi w wtrobie, a w organizmie 30 % choleterolu to cholesterol wolny (ó czy tkanki mózgu) i 70 % to jego estry z kwasami tuszczowymi.
5
Najwiksz zawarto cholesterolu wykazuj nadnercza i mózg. Jeeli chodzi o krew cholesterol w krwinkach wystpuje w stanie wolnym, a w osoczu w formie estrów.
Transportowany jest w formie kompleksów lipoproteinowych jako α- i β- lipoproteiny.
Oznaczany obecnie jest albo metodami chemicznymi - spektrofotometrycznymi, albo metodami enzymatycznymi. Metody chemiczne opieraj sie na reakcjach barwnych:
-
Liebermanna - Burcharda z bezwodnikiem kwasu octowego i stonym kwasem siarkowym (barwa zielona),
-
Lifschütza z lodowatym kwasem octowym i chlorkiem elazowym (barwa fioletowa).
Metody enzymatyczne wykorzystuj reakcje esterazy cholesterolowej i oksydazy cholesterolowej oraz nastpnie utlenienie jodku do jodu (pomiar UV przy 365 nm) lub metod
Trinder'a czyli utlenienie przez peroksydaz fenolu i 4-aminoantypiryny do chinonoiminy o czerwonym zabarwieniu (pomiar przy 500 nm). Czsto zamiast fenolu stosuje si sulfonian p-hydroksybenzenu, który nie posiada waciwoci korozyjnych (automaty kliniczne!) (pomiar przy 520 nm).
Cholesterol frakcji HDL oznaczany by dawniej w preparatywnym rozdziale po ultrawirowaniu w gradiencie (co byo czasochonne, pracochonne i wymagao drogiej aparatury). Rozdzia technik elektroforezy obarczony jest znacznymi bdami spowodowanymi trudnociami w standaryzacji i sab precyzj. Wspóczesne metody polegaj na selektywnym wytrcaniu frakcji LDL za pomoc polianionów i kationów dwuwartociowych. Stosuje si -
polietylenoglikol, siarczan dekstranu i jony magnezu, heparyn i jony magnezu lub kwas fosfotungstenowy i jony magnezu. Nastpuje ilociowe wytrcenie LDL i VLDL, a w supernatancie po odwirowniu pozostaje frakcja HDL, która stanowi próbk do oznaczenia stenia cholesterolu metod enzymatyczn. Uzyskiwane wartoci bardzo dobrze koreluj z wynikami otrzymywanymi po ultrawirowniu.
1 . Oznaczanie cholesterolu metod chemiczn
Odczynniki:
a.
odczynnik na cholesterol - 6,33 mmol/l bezwodnika octowego w 99 - 100 % kwasie
octowym
b.
kwas siarkowy 95 - 97 %
c.
wzorcowy roztwór cholesterolu 7,76 mmol/l [300 mg cholesterolu rozpuci
w
10 ml chloroformu i dodac 90 ml etanolu].
Materia badany:
Surowica lub osocze.
Sposób wykonania:
Do trzech probówek odmierzy wedug tabeli :
Próba badana
Próba wzorcowa
Próba zerowa
surowica
20 μ l
-
-
wzorzec
-
20 μ l
-
woda
-
-
20 μ l
6
1 ml
1 ml
1 ml
Wymiesza i po 10 minutach, do kadej probówki, ostronie po ciance tu nad powierzchni
pynu doda kwas siarkowy :
kwas siarkowy
0,2 ml
0,2 ml
0,2 ml
Wymiesza dokadnie wszystkie probówki i po 5 minutach mieszanie powtórzy (na ciankach nie powinno by adnego osadu). Po 10 minutach mierzy absorbancj próby badanej i wzorcowej wzgldem próby zerowej przy 610 nm.
Obliczanie wyników:
Stenie cholesterlu wyliczamy ze wzoru :
absorbancja próby badanej x 7,76
[mmol/l] = ----------------------------------------------------
absorbancja próby wzorcowej
wartoci prawidowe - do 6,5 mmol/l (do 2,5 g/l)
wartoci graniczne -
6,5 - 7,8 mmol/l (2,5 - 3,0 g/l)
wartoci patologiczne -
powyej 7,8 mmol/l (powyej 3,0 g/l).
2 . Oznaczanie cholesterolu metod enzymatyczn
Odczynniki:
a.
odczynnik - 0,6 mM 4-aminoantypiryna, 8,0 mM cholan sodu, >1500 U/l esterazy cholesterolowej, >200 U/l oksydazy cholesterolowej, 1500 U/l peroksydazy, 20 mM
sulfonian p-hydroksybenzenu (lub fenol), bufor pH 7,2, 0,01 % azydek sodu
b.
wzorzec cholesterolu 7,76 mmol/l.
Materia badany:
Surowica lub osocze wolne od hemolizy.
Sposób wykonania:
Do trzech probówek odmierzy wedug tabeli :
Próba badana
Próba wzorcowa
Próba zerowa
surowica
10 μ l
-
-
wzorzec
-
10 μ l
-
woda
-
-
10 μ l
odczynnik
1 ml
1 ml
1 ml
7
Wymiesza i inkubowa 10 minut w temperaturze pokojowej.
Mierzy absorbancj próby badanej i wzorcowej przy 520 nm wzgldem próby zerowej.
Obliczanie wyników;
Stenie cholesterolu wyliczamy wedug wzoru :
absorbancja próby badanej x 7,76
[mmol/l] = ------------------------------------------------------
absorbancja próby wzorcowej
3. Oznaczanie cholesterolu frakcji HDL
Odczynniki:
a.
odczynnik strcajcy - 13,9 mmol/l kwasu fosfowolframowego i 490 mmol/l chlorku magnezu, pH 6,15
pozostae odczynniki, jak w metodzie oznaczania cholesterolu uywanej w laboratorium.
Materia badany:
Surowica bez ladu hemolizy.
Sposób wykonania:
Do probówki wirókowej odmierzy 1 ml badanej surowicy i 0,1 ml odczynnika strcajcego.
Dobrze wymiesza i pozostawi na 10 minut w temperaturze pokojowej.
Wirowa 15 minut przy 5000 - 6000 obr./minut.
Pobra pyn z supernatantu i oznaczy cholesterol stosowan metod.
Wartoci prawidowe:
Wyniki optymalne
kobiety>1,7 mmol/l (>0,65 mg/l)
mczyni
>1,4 mmol/l (>0,55 mg/l)
Ryzyko standardowe kobiety1,2 - 1,7 mmol/l (0,45 - 0,65 mg/l)
mczyni
0,9 - 1,4 mmol/l (0,35 - 0,55 mg/l)
Ryzyko zwikszone
kobiety<1,2 mmol/l (<0,45 mg/l)
mczyni
<0,9 mmol/l (<0,35 mg/l).
8