O projekcie
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Cel projektu
Utworzenie konstruktu (plazmid + gen badany) zawierającego gen
ludzkiego białka w fuzji z genem białka fluorescencyjnego.
Dobrze zaplanowany i wykonany konstrukt powinien umożliwić nam obserwację
w komórce :

lokalizacji naszego genu badanego i jej zmian pod wpływem różnych czynników
(np.. przemieszczanie się jądro-cytoplazma)

oddziaływania z innymi białkami przy wykorzystaniu w techniki FRET
Gen badany  dowolnie wybrany przez Państwa gen białka ludzkiego
Białko fuzyjne (chimeryczne)  białko, które ma na jednym łańcuchu polipeptydowym dwa
lub więcej odrębnych białek; powstaje w wyniku translacji genu fuzyjnego utworzonego
przez wcześniejsze odpowiednie połączenie sekwencji kodujących tych białek.
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Lokalizacja fragmentów syntetazy
glutaminianowej w fuzji z EGFP
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Eksperyment FRET  tworzenie
kompleksów OAS-TL i SAT
OAS-TL  liaza tiolowa O-acetyloseryny SAT  acetylotransferaza seryny
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Etapy realizacji projektu

Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen
białka fluorescencyjnego

Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji
sekwencji kodującej badany gen

Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację
badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych
starterów

Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego
badanego genu i plazmidu

Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia
sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Etapy realizacji projektu

Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen
białka fluorescencyjnego

Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji
sekwencji kodującej badany gen

Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację
badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych
starterów

Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego
badanego genu i plazmidu

Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia
sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Informacje o wybranym genie
Co powinno się znalez
ć w projekcie:

Nazwa genu i numer dostępu do bazy wraz z
nazwą bazy danych

Sekwencja kodująca genu

Ilość i długość intronów, eksonów oraz
sekwencji UTR (sewkwencje 3' i 5'
nietranslatowane)

Położenie intronów w sekwencji kodującej
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Etapy realizacji projektu

Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen
białka fluorescencyjnego

Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji
sekwencji kodującej badany gen

Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację
badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych
starterów

Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego
badanego genu i plazmidu

Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia
sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Wektory zawierające gen białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Wektory zawierające gen białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Wektory zawierające gen białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Etapy realizacji projektu

Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen
białka fluorescencyjnego

Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji
sekwencji kodującej badany gen

Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację
badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych
starterów

Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego
badanego genu i plazmidu

Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia
sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Planowanie starterów do sekwencji
kodującej
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Planowanie starterów do sekwencji
kodującej
Dobór miejsc restrykcyjnych
uwaga na ramkę odczyt
badanego genu-wektory typu C
cDNA ATG CAC GCA.........................................................................GAC TCT Stop
uwaga na ramkę odczytu genu fluorescencyjnego i
kodon Stop genu badanego-wektory typu N
dodatkowe nukleotydy za miejscem restrykcyjnym
miejsce restrykcyjne
sekwencja parująca z kodującą
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Planowanie starterów do sekwencji
kodującej

Kontrola temperatury stapiania z primerów matrycą (wzór
prosty + wzory bardziej złożone dostępne on-line w postaci
kalkulatorów temperatury)

Kontrola dimeryzacji primerów i tworzenia struktur
II-rzędowych typu  spinki (obliczanie energii parowania
zasad między homo- i heterodimerami oraz w spinkach)
http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Etapy realizacji projektu

Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen
białka fluorescencyjnego

Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji
sekwencji kodującej badany gen

Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację
badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych
starterów

Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego
badanego genu i plazmidu

Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia
sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Reakcja PCR i jej planowanie

dobór odpowiedniej polimerazy w zależności od długości
oczekiwanego produktu

dobór zestawu/producenta polimerazy

zaplanowanie programu PCR, długości trwania
poszczególnych cykli zgodnie z wytycznym producenta

obliczenie ilości reagentów potrzebnych do reakcji
Założenia:

stężenie matrycy - 0,05mg/ml

stężenie mieszaniny dNTP - 10mM

standardowe stężenie starterów
w głównym stoku - 100źM
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Po reakcji PCR
dodatkowe nukleotydy za
miejscem restrykcyjnym
sekwencja kodująca
miejsce restrykcyjne
Czas na cięcie
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Etapy realizacji projektu

Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen
białka fluorescencyjnego

Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji
sekwencji kodującej badany gen

Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację
badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych
starterów

Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego
badanego genu i plazmidu

Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia
sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Trawienie restrykcyjne
dodatkowe nukleotydy za
miejscem restrykcyjnym
miejsce restrykcyjne
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Sugestie dotyczące trawienia
restrykcyjnego

Sprawdzenie czy enzymy restrykcyjne tną nasz
badany gen w obszarze sekwencji kodującej
http://tools.neb.com/NEBcutter2/

Dobranie pary enzymów, które mogą być użyte
w jednej reakcji (działają w jednym buforze)

Wycięcie stosunkowo dużego fragmentu MCS

Kontrola ramki odczytu i kodonu STOP!
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
I po trawieniu
plazmid badany gen
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Etapy realizacji projektu

Wybór sekwencji genu ludzkiego (gen badany)

Wybór plazmidu do klonowania zawierającego gen
białka fluorescencyjnego

Zaplanowanie odpowiednich starterów do amplifikacji
sekwencji kodującej badany gen

Zaplanowanie reakcji PCR umożliwiającej amplifikację
badanego genu przy pomocy wcześniej utworzonych
starterów

Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego
badanego genu i plazmidu

Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia
sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka
fluorescencyjnego
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Reakcja ligacji
ligaza
l
i
g
a
c
j
a
 Obliczenia w biochemii i biologii molekularnej
Sugestie dotyczące reakcja ligacji

Dobór odpowiedniego stosunku ilości plazmidu
do insertu

Ustalenie ilości jednostek ligazy na reakcję w
zależności od rodzaju końców pozostawionych
po trawieniu restrykcyjnym