Techniki molekularne
Wykład 4
26.10.2010
Metody badania białek wiążących DNA
-metody identyfikacji w cząsteczce DNA rejonu (rejonów), z którymi(i) wiąże się białko,
-metody oczyszczania białek wiążących DNA,
-metody badania struktury III-rzędowej białek wiążących DNA, w tym również kompleksów
tworzących przez białko związane z DNA,
Białka wiążące RNA mają również specyficzne domeny:
-domena rybonukleoproteinowa  RNO  występuje najczęściej w białkach wiążących RNA,
zidentyfikowano ponad 250 przypadków występowania tej domeny w białkach,
-domena wiążąca dwuniciowe RNA (dsRBD)- w białkach wiążących dwuniciowe RNA,
-domena Åš
-homologiczna  występuje b. rzadko,
Identyfikacja w genomie miejsc wiążących białko.
Opracowano wiele metod, dzięki którym można zidentyfikować miejsca wiążące białko w obrębie
fragmentów DNA długości kilku tys. Par zasad.
Spowolnienie migracji żelu  wykorzystuje różnicę w tempie migracji podczas elektroforezy samego
DNA oraz DNA w kompleksie ze związanym z nim białkiem.
W praktyce doświadczenie tego typu wykonuje się z mieszaniną fragmentów restrykcyjnych,
obejmujących przypuszczalne miejsce wiązania białka. Mieszaninę DNA łączy się z ekstraktem białek
jądrowych. Spowolnione fragmenty identyfikuje się poprzez porównanie ze wzorem prążków
otrzymanych po elektroforezie samej mieszaniny fragmentów restrykcyjnych. Jeśli znamy białko
oddziałujące z DNA to możemy oczyszczonym białkiem zastąpić ekstrakt białek jądrowych.
Spowolnienie migracji w żelu jest ogólną wskazówką, gdzie w sekwencji DNA znajduje się miejsce
wiązania białka. Badanie spowolnienia migracji w żelu jest więc etapem początkowym i potrzebne są
inne techniki, aby otrzymywać dokładniejsze informacje.
Testy ochrony przed modyfikacją  precyzyjniej określają położenie miejsc wiążących białko. Jeśli
cząsteczka DNA jest związana z białkiem, to wówczas część sekwencji nukleotydowej będzie
chroniona przed modyfikacjami.
IstniejÄ… dwa sposoby wprowadzania takich modyfikacji:
-działanie nukleazą  rozszczepia wszystkie wiązania fosfodiestrowe z wyjątkiem tych chronionych
przez białko.
-podanie działaniu czynnika metylującego, takiego jak siarczan dimetylu, który przyłącza grupy
metylowe do G-guaniny. Wówczas żadna G chroniona przez dołączone białko nie będzie metylowana.
Obydwie metody opierają się na analizie śladów  footprinting.
W doświadczenia Z nukleazą DNA jest znakowany izotopem na jednym końcu i łączony z białkiem
wiążącym DNA dodawanym w ekstrakcie jądrowym lub jako oczyszczone białko. Powstały kompleks
poddaje się następnie działaniu DNazy1. W roztworze pozostaje tylko fragment DNA który był
chroniony przez związane białko. Nie jest to najlepsze rozwiązanie ponieważ trudne jest
sekwencjonowanie tak małego fragmentu.
Lepiej jest prowadzić częściowe trawienie nukleazą, tak by pojedynczy fragment DNA ulegał cięciu
tylko w jednym miejscu. Po reakcji mamy mieszaninę fragmentów, przeciętych losowo w każdym
możliwym miejscu za wyjątkiem tego gdzie przyłączyło się białko.
Po usunięciu białka z roztworu i rozdzieleniu DNA na żelu widzimy  drabinkę fragmentów
różniących się o 1 nukleotyd. Przerwa w drabince odpowiada miejscu na DNA, które było związane z
białkiem.
Test z użyciem DMS opiera się na podobnej zasadzie jak test z DNazą. Fragmenty DNA poddawane są
na działaniu DMS o małym stężeniu dobranym tak, aby w pojedynczym fragmencie DNA
zmetylowana została tylko jedna guanina. Guaniny chronione przez białko nie ulegają metylacji. Po
usunięciu białka na DNA działa się piperydyną, która przecina cząsteczkę w miejscu gdzie znajdują się
zmodyfikowane nukleotydy (jedna nić). Próbki poddaje się elektroforezie w warunkach
denaturujących. Wzór prążków odpowiadający pozycjom wszystkich G porównujemy z wzorem
prążków otrzymanych dla kontrolnego DNA, który nie był inkubowany z ekstraktem jądrowym. Ślad
widoczny we wzorze prążków testowanego DNA pokazuje, które G było chronione.
Test zakłócenia modyfikacji  pozwala zidentyfikować nukleotydy bezpośrednio oddziałujące z
białkiem  opiera się na założeniu, że jeśli zmienimy nukleotydy istotne dla wiązania białka, na
przykład przez dodanie grupy metylowej to wówczas uniemożliwimy związanie tego białka.
Jest kilka takich metod. Wyznakowany na jednym końcu fragment DNA poddaje się działaniu
czynnika modyfikującego np. siarczanu dimetylu o małym stężeniu dobranym tak by w jednym
fragmencie DNA została zmetylowana tylko jedna guanina. Następnie dodaje się białko wiążące DNA
lub ekstrakt jądrowy i przeprowadza elektroforezę. Można wówczas zaobserwować dwa prążki 
jeden odpowiadający kompleksowi DNA  białko, a drugi DNA. Fragment DNA (nie związany z
białkiem) izoluje się z żelu i poddaje się działaniu piperydyny. Długość fragmentu otrzymanego po
cięciu piperydyną wskazuje który nukleotyd (guanina) został zmetylowany i bierze udział w reakcji
wiązania białka. Można zastosować podobne techniki, by stwierdzić również które z nukleotydów A,
C i T biorą udział w wiązaniu.
Metody oczyszczania białek wiążących DNA:
Po zidentyfikowaniu w cząsteczce DNA sekwencji wiążącej białko można ją wykorzystywać do
oczyszczania tego białka.
Metody oczyszczania wykorzystują zdolności białka do wiązania z określoną sekwencją DNA np.
chromatografia powinowactwa lub metoda hybrydyzacyjna (jeśli dysponujemy biblioteką cDNA).
Metody badania struktury białek i kompleksów białek z kwasami nukleinowymi.
Oczyszczanie białka wiążącego DNA lub RNA daje możliwość analizy struktury zarówno samego
białka, jak i białka połączonego z sekwencją nukleotydową.
Można poznać strukturę tej części białka, która się wiąże z DNA oraz zbadać oddziaływanie między
cząsteczkami. Głównymi metodami stosowanymi w tym celu są:
- krystalografia rentgenowska,
- spektroskopia magnetycznego rezonansu jÄ…drowego (NMR)
Krystalografia rentgenowska  opracowana w końcu XIX w. opiera się na dyfrakcji promieni
rentgenowskich. Promieniowanie to ma bardzo małą długość fal 0,01-10 nm. i jest to długość
porównywalna z odległościami między atomami w cząsteczkach. Gdy wiązka promieni zostaje
skierowana na kryształ to część przechodzi prosto, a część zmienia kierunek i się rozprasza. Jeśli
kryształ ma regularną strukturę to kolejne promienie rozpraszają się w podobny sposób i powstają
nakładające się koła. Obraz uzyskuje się na kliszy rentgenowskiej lub specjalnym detektorze.
Obraz w postaci serii plamek nazywany jest rentgenogramem dyfrakcyjnym. Stanowi on postawÄ™ do
opracowania struktury cząsteczki ponieważ względne ułożeni plamek odzwierciedla ułożenie
cząsteczek w krysztale. Po analizie otrzymujemy mapę gęstości elektronowej. W przypadku cząsteczki
białka jest to mapa sfałdowanego polipeptydu na podstawie której możemy określić położenie helis ą
i harmonijek ² oraz poszczególnych grup R. Pozwala to stworzyć trójwymiarowy model biaÅ‚ka.
Warunkiem jest uzyskanie białka w formie krystalicznej, co niekiedy jest bardzo trudne.
Badanie białek w roztworze umożliwia kolejna metoda  NMR- spektroskopia magnetycznego
rezonansu jądrowego, a przeprowadzona w sposób precyzyjny dostarcza danych o podobnej
rozdzielczości co krystalografia rentgenowska. Możliwe jest analizowanie tylko stosunkowo małych
białek.
Metoda NMR początek XX w. (1936r.) Metoda opiera się na zasadzie, że ruch obrotowy
naładowanego jądra atomowego wytwarza moment magnetyczny. Po przyłożeniu zewnętrznego pola
magnetycznego wirujÄ…ce jÄ…dro może przyjąć jednÄ… z 2 orientacji  Ä… lub ².
W metodzie spektroskopii NMR określa się częstość rezonansową badanego jądra na podstawie
pomiaru energii potrzebnej do przejÅ›cia ze stanu Ä… do ². Różne jÄ…dra atomowe charakteryzujÄ… siÄ™
specyficzną dla siebie częstością rezonansową. Wartość tego parametru  częstości rezonansowej,
zależy od otoczenia w jakim znajduje się jadro i dostarcza informacji na temat budowy cząsteczki.
Większość badań białek z zastosowaniem tej metody opiera się na analizie jąder 1H w celu
zidentyfikowania otoczenia każdego atomu wodoru oraz wiązań chemicznych łączących te atomy z
innymi. Można w ten sposób odtworzyć strukturę białka.
Genom  kompletna informacja genetyczna organizmu potrzebna do powstania tego organizmu i do
utrzymania go przy życiu. W przypadku wyższych eukariotów jest to inf. Genet. Zawarta w
haploidalnym zestawie chromosomów charakterystycznych dla gamety. Większość genomów
zbudowana jest z DNA, a u niektórych wirusów z RNA.
Rodzaje genomów:
- genomy wirusów,
- genomy prokariotów,
-organelli eukariotów.  chloroplastowy, mitochondrialny,
- eukariotyczne genomy jÄ…drowe,
Drogi ewolucji genomów
Wszechświat powstał 14 mld lat temu wskutek pierwotnej eksplozji nazwanej Wielkim Wybuchem.
Ok. 10 mld lat temu z obłoków gazu wyrzuconego przez Wielki Wybuch zaczęły formować się
galaktyki, a w naszej galaktyce Słońce i planety zaczęły kondensować ok. 4,6 mld lat temu.
Ziemię pokrywała woda i w niej pojawiły się pierwsze systemy biochemiczne. Początkowo pojawiły
się samoreplikujące się polinukleotydy, będące przodkami genów.
Coraz bardziej złożone systemy przedkomórkowe poprzedziły pojawienie się pierwszych komórek
podobnych do dzisiejszych bakterii, co nastąpiło ok. 3,5 mld lat temu, w okresie gdy zaczęły pojawiać
siÄ™ pierwsze lÄ…dy.
Pierwotne oceany zawierały sole mineralne podobne do współczesnych, jednakże zupełnie odmienny
był skład ziemskiej atmosfery, odmienne były w związku z tym gazy rozpuszczone w oceanach. Udział
tlenu w atmosferze wzrósł dopiero po pojawieniu się fotosyntezy. Wcześniej dominowały metan i
amoniak. Wykazano, że wyładowaniom elektrycznym w mieszaninie tych gazów towarzyszy synteza
takich jak alanina, glicyna czy walina. Powstawały również cyjanowodór i formaldehyd, które
uczestnicząc w dodatkowych reakcjach przyczyniły się do pojawienia innych aminokwasów oraz
puryn i pirymidyn a w mniejszym stopniu cukrów.
Panująca wówczas na ziemi atmosfera sprzyjała formowaniu pierwszych biocząsteczek  cząsteczek
organicznych.
Przypuszcza się, że różnego rodzaju zjawiska geochemiczne doprowadziły do polimeryzacji
biocząsteczek. To co stało się póz
niej pozostaje niewyjaśnione, czyli jak z nieuporządkowanego zbioru
biocząsteczek doszło do uformowania uporządkowanych grup, wykazujących przynajmniej niektóre z
właściwości biochemicznych przypisywanych życiu.
Jeszcze do niedawna nie potrafiono znalez
ć wyjaśnienia, w jaki sposób doszło do współdziałania
polinukleotydów i polipeptydów oraz utworzenia samoreprodukującego się systemu.
Białka nie mogą się same replikować, polinukleotydy zaś mogą się replikować i syntetyzować białka,
ale potrzebują do tego białek. Przełom nastąpił w roku 1980, kiedy odkryto aktywność katalityczną
RNA  rybozymy.
Znane obecnie rybozymy katalizujÄ…:
- cięcie autokatalityczne  samowycinanie intronów,
- cięcie innych cząsteczek RNA  np. RNazaP,
- syntezę wiązań peptydowych (prowadzona przez rRNA w rybosomach).
Wykazano, że cząsteczki RNA mogą prowadzić syntezę i replikację cząsteczek RNA oraz łączyć ze sobą
aminokwasy analogicznie do syntezy peptydów. Oznacza to, że pierwsze systemy biochemiczne
mogły opierać się w całości na RNA.
Teoria świata RNA wydaje obecnie bardzo spójna i prawdopodobna. Cząsteczki RNA początkowo
replikowały przypadkowo przyłączając kolejne rybonukleotydy na zasadzie komplementarności.
Spontanicznie więc pojawiały się sekwencje o aktywności rybozymów. Rybozymy umożliwiły
ostatecznie większą samokontrolę samoreplikacji. Dobór naturalny promował najskuteczniej
replikujące się systemy. Większa dokładność replikacji mogła pozwolić na wydłużenie cząsteczek RNA
i rozwinięcie bardziej złożonych właściwości katalitycznych.
SamoreplikujÄ…ce siÄ™ czÄ…steczki RNA zdolne do prowadzenia prostych reakcji biochemicznych nazwano
protogenomami. Reakcje te mogły polegać na uwalnianiu energii w trakcie w trakcie hydrolizy wiązań
fosforanowych w ATP i GTP. Po wytworzeniu błon lipidowych powstały pierwsze struktury
komórkopodobne. Separacja od środowiska zewnętrznego pozwalała na większą kontrolę
prowadzonych procesów.
W jaki sposób świat oparty na RNA ewoluował w kierunku DNA?
Pierwszą ważną zmianą był rozwój enzymów białkowych, które uzupełniały, a ostatecznie zastąpiły
większą część aktywności katalitycznej rybozymów. Przejście do katalizy białkowej wymagało
całkowitej zmiany roli protogenomów w RNA, które stały się cząsteczkami kodującymi. Jednak z
uwagi na niestabilność wiązania fosfodiestrowego w RNA doszło do redukcji rybonukleotydów do
deoksyrybonukleotydów. RNA było przypisywanie w procesie odwrotnej transkrypcji na DNA, a
przyjęcie przez DNA formy dwuniciowej umożliwiającej (& ) kopiowanie i naprawę uszkodzeń
zagwarantowało sukces DNA.
Pierwsze genomy składały się z wielu oddzielonych cząsteczek DNA, z których każda odpowiadała
innemu białku. Połączenie tych odcinków w pierwsze chromosomy mogło nastąpić zarówno na etapie
RNA jak i DNA. Umożliwiało to kontrolę nad przekazywaniem informacji genetycznej podczas
podziałów komórkowych.
Najprawdopodobniej życie na Ziemi musiało powstać więcej niż raz. Jednak wszystko wskazuje na to,
że komórki bakteryjne, archeonów i eukariontów pochodzą od wspólnego przodka. Przykładem może
być np. duże podobieństwo kodu genetycznego (nie jest jednakowy). Gdyby organizmy miały więcej
niż jednego przodka to tych kodów byłoby więcej.
Najprawdopodobniej przewagę zyskał system który pierwszy rozwiązał zdolność syntezy białek i
zaczął wykorzystywać DNA do przekazywania informacji genetycznej. Organizmy te miały większy
potencjał katalityczny i wierniejszą replikację, czym zyskały przewagę nad pozostałymi systemami.
Komórki zawierające DNA-RNA-białko mogły się szybciej mnożyć i wygrywały konkurencję o składniki
odżywcze.
Dane paleontologiczne zawierajÄ… dowody wskazujÄ…ce na istnienie:
- pierwszych jednokomórkowych glonów 1,4 mld lat,
-pierwszych glonów wielokomórkowych 0,9 mld ,
- zwierząt wielokomórkowych  640 mln lat temu ,
- bezkręgowców  530 mln lat temu (eksplozja kambryjska),
- pierwsze lądowe rośliny, owady i inne zwierzęta 350 mln lat temu,
- dinozaury wyginęły 65 mln lat temu,
- pierwsze hominidy pojawiły się zaledwie 4,5 mln lat temu.
Ewolucja genomu prowadziła do coraz większej jego złożoności, np. liczba genomów u bakterii
wynosi ok. 1000 , u kręgowców  30  40 tys. (& ) genów zanikła, a na ich miejsce pojawiły się nowe.
Najprostszą formą życia są wirusy. Są obligatoryjnymi pasożytami  mogą się namnażać jedynie w
komórce gospodarza, a w celu replikacji i ekspresji swoich genomów muszą podporządkować sobie
przynajmniej część genomu komórki gospodarza.