Walidacja procedury analitycznej
Zawartość
" Czym jest walidacja procedur analitycznych ?
" Dlaczego walidujemy procedury analityczne ?
" Na czym polega walidacja ?
" Co jest wynikiem walidacji ?
 świadectwo (sprawozdanie) walidacji,
 niepewność pomiaru
Różnice terminologiczne
PN-EN ISO/IEC 17025. Ogólne wymagania dotyczące kompetencji
laboratoriów badawczych i wzorcujących:
walidacja metody badawczej
VIM, Międzynarodowy słownik podstawowych i ogólnych terminów
metrologii:
walidacja procedury pomiarowej
Dobra Praktyka Laboratoryjna:
walidacja standardowej procedury pomiarowej
Zakres walidacji
ż� wymagania analityczne  czyli cel prowadzenia pomiarów
�� określenie charakterystyki procedury analitycznej
ż� sprawdzenie, że wymagania mogą być w pełni zrealizowane
za pomocą tej procedury analitycznej
ż� świadectwo (raport) walidacji
Walidacja
Walidacja jest potwierdzeniem, przez zbadanie i przedstawienie
obiektywnego dowodu, że zostały spełnione szczególne wymagania
dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania.
(PN-EN ISO/IEC 17025)
Walidacja procedury analitycznej
Oznacza wyznaczenie:
- parametrów analitycznych;
- zakresu i ograniczeń procedury analitycznej;
- identyfikacja czynników mogących zmieniać jej charakterystykę.
- Jaki analit może być oznaczany, w jakich matrycach i w obecności
jakich interferentów?
- Jaką niepewnością będą charakteryzowały się wyniki ?
Należy potwierdzić, że wybrana procedura jest odpowiednia do
rozwiązania konkretnego problemu
(np. dla rozwiązania określonego problemu analitycznego)
Problemy analityczne
- sprawdzanie zgodności z aktami normatywnymi
- tworzenie nowych regulacji normatywnych
- Diagnostyka medyczna
- Sterowanie procesami produkcyjnymi
- kontrola i zapewnienie jakości w przemyśle
- wspomaganie krajowego i międzynarodowego handlu
- wspomaganie badań
Dlaczego potrzebujemy walidacji ?
Laboratoria powinny wykazać, że pracują w ramach
wdrożonego systemu zarządzania, są kompetentne w zakresie
niezbędnym do zapewnienie jakości wyników pomiarów.
(PN-EN ISO/IEC 17025)
Najważniejsze wymagania normy PN-EN ISO/IEC 17025:
��walidacja procedur analitycznych
��zapewnienie spójności pomiarowej
��wyznaczenie niepewności wyników
Walidacja jest niezbędna
nawet jeżeli nie zamierzamy ubiegać się o akredytację
Dlaczego walidujemy procedury analityczne ?
" W celu poznania parametrów analitycznych stosowanej procedury
pomiarowej;
" W celu zapewnienia zaufania:
 użytkowników danej procedury (analityków pracujących w
laboratorium)
 odbiorców wyników pomiarowych (klientów laboratorium)
Zapamiętajmy !
Walidacja jest badaniem procedury analitycznej, a nie pracy
analityka !
Często spotykane terminy
" Walidacja pełna: gdy badane są wszystkie istotne
parametry (pomiarowe, działania) procedury analitycznej.
" Walidacja częściowa: gdy badane są jedynie niektóre
parametry procedury analitycznej.
" Potwierdzenie: procedura dotycząca zwalidowanych
procedur mających status normy. Nie ma potrzeby ich
dodatkowego walidowania, należy jedynie potwierdzić
możliwość ich prawidłowego stosowania laboratorium.
Które procedury analityczne
powinny być walidowane ?
��nie mające statusu normy;
��opracowania własne;
��znormalizowane, stosowane poza przewidzianym zakresem;
��znormalizowane, po wprowadzeniu modyfikacji.
Czy zwalidowana procedura może być zastosowana w
laboratorium  automatycznie ?
�� (Po pierwsze) Nie, musi zostać potwierdzona;
�� (Po potwierdzeniu) Tak, w ściśle określonym zakresie.
Metody znormalizowane
i nie mające statusu normy
y
ródła metod statusie normy:
��procedury mające status norm międzynarodowych,
regionalnych i krajowych (ISO, EN, PN, DIN, BS, ASTM....),
��procedury publikowane przez uznane organizacje (AOAC dla
artykułów spożywczych i rolnych; ICH dla analizy klinicznej,...),
Nie dotyczy procedur publikowanych w literaturze naukowej i
technicznej.
Kiedy wymagana jest walidacja procedury ?
Procedura
analityczna
Tak Nie
Już zwalidowana ?
Konieczna Konieczna
potwierdzenie walidacja
Zakres walidacji
Procedura analityczna
Przygotowanie
" Walidacja całej procedury
próbek w
(od przygotowania próbki do wyniku)
laboratorium
" Walidacja pełnego zakresu stężeń
(oczekiwany zakres stężeń !)
Kalibracja
przyrządów i
pomiary
" Walidacja względem spodziewanych
rodzajów próbek
Przetwarzanie
danych
Podejmij wysiłek tam, gdzie to konieczne
Wynik
Wymagany zakres walidacji
Dla danego zadania analitycznego warto wybrać najważniejsze parametry
odnośnie zakresu walidacji
(selekcja parametrów usprawnia funkcjonowanie laboratorium!!!!)
Cholesterol w surowicy
Granica wykrywalności: nie jest istotna
Niepewność: istotna
(np.. mniejsza niepewność wyników stała się w USA z
ródłem
oszczędności 100 mln $/rok)
Ocena zanieczyszczenia środowiska [lokalizacja zagrożeń]:
Zakres pomiarowy istotny
Granica wykrywalności nie jest istotna
Niepewność nie jest istotna
Kontrola antydopingowa:
Granica wykrywalności parametr decydujący
Niepewność nie jest istotna
Zakres pomiarowy, liniowość: nie jest istotna
Technika walidacji
& zgodnie z zaleceniami PN-EN ISO/IEC 17025
��Wyznaczanie niepewności jest równoznaczne z systematyczną oceną
czynników wpływających na wynik pomiaru
��Polecane jest stosowanie certyfikowanych materiałów odniesienia
(CRM)
��Polecany jest udział w porównaniach międzylaboratoryjnych
��Polecane jest porównywanie wyników uzyskiwanych za pomocą innych
technik analitycznych
Używaj...
�� Wzorce i/lub materiały odniesienia
�� Próbki zerowe (ślepe)
�� Próbki syntetyczne (np. fortyfikowane)
�� Analizę statystyczną
�� Znajomość zagadnienia
Przypisanie parametrów walidacyjnych
Parametry analityczne procedury pomiarowej
(jakościowe): o�selektywność, specyficzność
(ilościowe):
��zakres roboczy (liniowy)
��granica wykrywalności i oznaczalności
��odzysk
Właściwości wyników pomiarów:
�� spójność pomiarowa
�� niepewność, uwzględniając np.
powtarzalność / odtwarzalność
odporności
Specyfikacja parametrów walidacji
��selektywność/interferencje
��odzysk
��liniowość, zakres roboczy
��granica wykrywaloności / oznaczalności
��powtarzalność
��odtwarzalność
��odporność
��kontrola jakości
��niepewność
��spójność pomiarowa
Zakres walidacji
Selektywność i specyficzność
Selektywność oznacza stopień w jakim metoda może być
stosowana do oznaczania danego analitu w obecności
innych składników próbki bez występowania
interferencji.
(IUPAC, 2001)
Specyficzność oznacza 100 % selektywność
Czy istnieją metody absolutnie selektywne ?
IUPAC zaleca unikania stosowania terminu
specyficzność !
Selektywność i specyficzność
metod analitycznych
Selektywność
specyficzność
mała średnia wysoka
Grawimetria
Alkacymetria Spektrofotometria Chromatografia
GC-MS
Kompleksometria
Neutronowa analiza
aktywacyjna
Odzysk (1)
Określa wiarygodność procedury pomiarowej
(IUPAC 1999)
Wartośćzmierzona
R =
Wartośćodniesienia
Wartość odniesienia dla:
Cobs.
- CRM
R =
CCRM
- próbki wzbogaconej Cobs. - Cmat.
R =
Canalit.dod.
Wartość R bliska 1 oznacza niewielkie obciążenie procedury
pomiarowej
Odzysk (2)
Wartość odzysku dla danej próbki (R), jest iloczynem trzech
parametrów (VAM Project 3.2.1):
R = Rm * Rs * Rrep
Rm: wartość średnia odzysku dla CRM lub dla próbki
wzbogaconej
u(Rm): niepewność wartości certyfikowanej lub odchylenie
standardowe wielokrotnowych pomiarów
Rs: współczynnik uwzględniający wpływ matrycy
Rrep: współczynnik uwzględniajacy w zachowaniu się analitu w
próbkach wzbogaconych i rzeczywistych
Zakres liniowości,zakres roboczy
Zakres liniowości
Zakres roboczy
Stężenie
Wielkość sygnału
Czułość
" Definicja:
Iloraz przyrostu odpowiedzi przyrządu pomiarowego przez
odpowiadający mu przyrost sygnału wejściowego
[VIM 1993]
" Interpretacja:
Nachylenie zależności kalibracyjnej
Odpowiedz
przyrządu =
sygnał
zawartość
Granica wykrywalności (LOD)
Granica oznaczalności(LOQ)
ślepa próba:
" instrumentalna
" odczynnikowa
" procedury analitycznej
(roztwarzanie, zatężanie)
Równanie zależności kalibracjnej:
Sygnał = b0 + b1 * c
Ybl = wartość średnia dla ślepej próby;
sbl = odchylenie standardowe dla ślepej próby
(
YLOD = Ybl + 3 sbl Ł� LOD = YLOD  b0)/b1
(
YLOQ = Ybl + 10 sbl Ł� LOQ = YLOQ  b0)/b1
Znaczenie LOD
Zdolność wykrywania śladowych ilości analitu
Wynik badania: analit(u)&
Analit
nie wykryto
Wykryto ��
cx < LOD
Wykryto
nie wykryto ś�
cx e" LOD
�� kontaminacja, nieodpowiednia selektywność, interferencje?
ś� interferencje?
Wartość graniczna
Analit nie jest obecny Analit jest obecny
Wartość graniczna
Obszar FN Obszar FP
granica
Ślepa próba
wykrywalności
c 0 c > 0 steżenie
Odporność (1)
Odporność procedury analitycznej oznacza stabilność
uzyskiwanych wyników w zakresie niewielkich zmian
warunków pomiarowych opisanych w procedurze analitycznej.
Warunki pomiarowe są dokładnie opisane w procedurze
pomiarowej:
np. pH, temperatura, stężenia odczynników, ......
Odporność (2)
Parameter nie-odporny Parameter odporny
~0
Parameter
Values
Parameter Values
Pn Pa
Pn
Pa
Response
Response
Badanie odporności procedury
analitycznej (3)
" Identyfikacja zmiennych dla danej procedury: A, B, C, D ...,
" Zaprojektowanie eksperymentu (Youden/Steiner),
" Systematyczna zmiana danej zmiennej pozwala na ocenę
jej wpływu na wynik oznaczenia (patrz tabela Y/S),
" Ocena uzyskanych wyników i wybór warunków
optymalnych,
" Modyfikacja procedury pomiarowej (w zakresie badanych
zmiennych).
Odporność (4)
Nr eksperymentu 1 2 3 4 5 6 7 8
Parametry
A pH 5 5 5 5 7 7 7 7
B temp. 25 25 35 35 25 25 35 35
C czas reakcji 30 60 30 60 30 60 30 60
D odczynnik 1 1 1 2 2 2 2 1 1
E odczynnik 2 1 2 1 2 2 1 2 1
F wiek kolumn stara nowa nowa stara stara nowa nowa stara
G analityk xx yy yy xx yy xx xx yy
Odpowiedz
r t u v w x y z
Określenie odporności pozwala na:
��zebranie informacji o danej procedurze pomiarowej
��sprawdzenie poprawności równania modelowego
��odpowiednią modyfikację procedury pomiarowej
Raport z walidacji (1)
Sprawozdanie z walidacji
Procedura oznaczanie kadmu
Selektywność: brak interferencji w obecności
metodą GF-AAS
chlorków do 1 mg/kg
Mezurand: stężenie kadmu w produktach
Spójność pomiarowa: SI. Ustalono przez
spożywczych
kalibrację oraz przez pomiary CRM firmy YYY
y
ródło procedury:opracowanie własne
Charakterystyczna niepewność: 10%,
Przeznaczenie: ocena produktow spożywczych
Składniki niepewności, patrz Aneks
Matryca: surowce i produkty spożywcze
Postepowanie: 1. mineralizacja mikrofalowa,
2. oznaczanie GF-AAS
Nazwisko
Kalibracja: użyto roztwory wzorcowe
Funkcja Analityk Kierownik
wyprodukowane przez firmę-ZZZ Laboratorium
podpis
Zakres roboczy: do 20 g/kg
data
LOD: 1 g/kg
LOQ: 3,5 g/kg
Czy mogę wykonać oznaczenie kadmu ?
Rodzaj próbki Oczekiwane stężenie ODPOWIEDy

mleko 0,5 - 1,5 ng/g NIE: poniżej LOD
woda morska 5 - 30 ng/L NIE: obecność Cl-
woda jeziorowa 5 - 10 źg/L TAK
Czas na pytania
Czas na ocenę