OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH
Tech. spec.  5, 7 maja 2010 r.
Prowadzący: Michał A. Olkowski
CHARAKTERYSTYKA SUBSTANCJI AZOTOWYCH W MLEKU
Normalne mleko zawiera przeciętnie około 3,3% substancji azotowych ogółem. Pozycja ta
obejmuje białka właściwe (łącznie z proteozami i peptonami), które reprezentują blisko 95%
substancji azotowych ogółem lub ok. 3,1% w stosunku do mleka oraz związki azotowe
niebiałkowe określanie mianem azotu resztkowego, na które przypada 5% substancji azotowych
ogółem (lub 0,2% w stosunku do mleka). Związki azotowe niebiałkowe są reprezentowane przez:
peptydy, wolne aminokwasy, mocznik, amoniak, nukleotydy, kwas orotowy (witamina B13),
azotany i azotyny (substancje obce w mleku).
Najważniejszym białkiem mleka jest kazeina. Jest najbardziej przydatnym składnikiem jako
materiał budulcowy do syntezy hemoglobiny i białek osocza krwi. Po spożyciu mleka kazeina
tworzy w żołądku skrzep, który jest bardziej podatny na działanie enzymów trawiennych niż,
np. białka w produktach mięsnych. Jej zawartość w mleku towarowym waha się najczęściej w
granicach od 2,3 do 2,6%. Kazeina jest fosfoproteiną, tzn. w składzie elementarnym oprócz węgla
(53%), wodoru (7%), tlenu (22%), azotu (15,65%) i siarki (85%) zawiera także fosfor (0,85%),
który występuje tu w postaci reszt orto- i pirofosforanowych, związanych estrowo jako monoestry
lub dwuestry - w określonych miejscach cząsteczek  głównie z seryną, a także treoniną.
KAZEINA
Kazeina nie jest białkiem jednorodnym. Stosując metody elektroforetyczne, w jej składzie
wyróżniono 20 frakcji różniących się zawartością fosforu, składem aminokwasów, masą
cząsteczkową, udziałem sacharydów i właściwościami. Do głównych frakcji kazeiny należą:
wð kazeina Ä…
wð kazeina ²
wð kazeina Å‚
wð Ä…s- kazeina (strÄ…ca siÄ™ w obecnoÅ›ci jonów wapnia)
wð :-kazeina (kappa; nie strÄ…ca siÄ™ w obecnoÅ›ci jonów wapnia).
W mleku kazeina występuje głównie w postaci sferycznych, silnie porowatych skupisk,
zwanych micelami. Micele kazeinowe charakteryzują się znacznymi rozmiarami (średnica od 25
do 300 nm), dlatego w fazie wodnej mleka tworzą roztwór koloidalny (zol). Zostają one
uformowane z podjednostek składających się z monomerów poszczególnych frakcji kazeiny
połączonych ze sobą za pomocą mostków utworzonych przez jony wapniowe, fosforanowe oraz
cytrynianowe.
Strona 1 z 6
OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH
Tech. spec.  5, 7 maja 2010 r.
Prowadzący: Michał A. Olkowski
BIAA
KA SERWATKOWE
Pozostałe białka mleka określane są ogólnym terminem białek serwatkowych, gdyż po
wytrąceniu kazeiny w punkcie izoelektrycznym (który przypada przy pH 4,6) lub za pomocą
preparatu podpuszczkowego pozostają rozpuszczone w serwatce. Przeciętna zawartość tej grupy
substancji azotowych w mleku wynosi 0,6%. Białka serwatkowe reprezentowane są przez trzy
frakcje, mianowicie albuminy, immunoglobuliny oraz proteozy i peptony. Spośród białek
najwiÄ™ksze znaczenie odżywcze majÄ… albuminy, do których zaliczane sÄ…: ²-laktoglobulina,
Ä…-laktoalbumina i albumina serum krwi.
Białka serwatkowe są niezwykle cennym składnikiem mleka i jego przetworów.
Charakteryzują się bardzo dobrymi właściwościami funkcjonalnymi, wysoką wartością odżywczą,
a w szczególności składem aminokwasowym z przewagą aminokwasów siarkowych, lizyny
i tryptofanu w porównaniu z kazeiną. Wysoki udział cysteiny w białkach serwatkowych jest
korzystny ze względu na jej ważną funkcję regulacji stężenia glutationu, który ma kluczowe
znaczenie w ochronie komórek przed toksycznym działaniem wolnych rodników.
Tabela 1. Udział białek serwatkowych w serwatce.
Zawartość w serwatce
Białko
[g/dm3]
Ogółem 5.0÷7.0
²-laktoglobulina 2.0÷4.0
Ä…-laktoalbumina 1.0÷7.0
Albumina serum 0.1÷1.7
Immunoglobuliny 0.6÷1.0
Proteozy i peptony 0.6÷1.8
Białka serwatkowe pobudzają do wzrostu oraz zapewniają ochronę immunologiczną
młodych ssaków. Ich ważne funkcje biologiczne są silnie uzależnione od właściwości
fizykochemicznych i funkcjonalnych. Kazeina ma głównie wartość żywieniową, natomiast znacznie
mniejsze od niej białka serwatkowe o budowie globularnej pełnią większą ilość funkcji
w prawidłowym rozwoju noworodków oraz niemowląt.
Głównym biaÅ‚kiem serwatki jest ²-laktoglobulina (²-lg). W biaÅ‚kach serwatkowych mleka
krowiego zawartość ²-lg ogółem wynosi ok. 60%, w mleku kobiecym jest jej niewiele, bÄ…dz
nie
występuje w ogóle, natomiast dominują w nim ą-laktoalbumina i laktoferryna, które stanowią
odpowiednio 40 i 25% wszystkich białek ogółem. Należy ona do nadrodziny lipokalin.
U noworodków bierze udział w wiązaniu retinolu pochodzącego od witaminy A oraz dodatkowo
przyczynia się do lepszego metabolizmu kwasów tłuszczowych zawartych w mleku krowim.
Strona 2 z 6
OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH
Tech. spec.  5, 7 maja 2010 r.
Prowadzący: Michał A. Olkowski
W temperaturach powyżej 60oC następuje cieplna denaturacja tego białka, w wyniku której zostają
odsłonięte grupy -SH aminokwasów siarkowych. W mocniej ogrzewanym mleku powstają
poÅ‚Ä…czenia dziÄ™ki tzw. mostkom disiarczkowym, pomiÄ™dzy czÄ…steczkami ²-lg, także ²-lg, º-kazeiny
i ą-laktoalbuminy oraz także wydzielany może być siarkowodór odpowiadający za przykry zapach
przypalonego mleka. Aby wyeliminować alergiczne dziaÅ‚anie ²-laktoglobuliny w gotowym
produkcie u osób nadwrażliwych, poddawana jest ona enzymatycznej hydrolizie.
Innym, istotnym białkiem serwatkowym jest ą-laktoalbumina, która jest składnikiem
kompleksu syntetazy (ligazy) laktozy wykorzystujÄ…cej glukozÄ™ i UDP-galaktozÄ™ jako substraty do
syntezy cukru mlekowego w aparacie Golgiego komórki nabłonkowej gruczołu mlecznego
u ssaków.
Strukturalnie zbliżonym do ą-laktoalbuminy białkiem jest lizozym. Typ-C lizozymu ma
właściwości bakteriostatyczne dzięki hydrolitycznemu działaniu na wielocukry obecne w ścianach
komórkowych drobnoustrojów. Dzięki unikalnym właściwościom tego białka, podczas karmienia
mleko kobiece jest wolne enteropatogenów.
Najsilniej zróżnicowaną grupą białek serwatkowych są immunoglobuliny. Laktoferyna
i transferyna są białkami glikoproteinowymi, które wiążąc żelazo ograniczają wzrost bakterii
poprzez transport i absorpcję tego pierwiastka w jelicie. Zawartość obu białek jest zróżnicowana
u wielu gatunków ssaków. Bakteriostatyczne działanie laktoferyny w ochronie przeciw
drobnoustrojom obecnym w gruczole mlecznym i powierzchniach śluzówkowych polega na
indukcji stanu zapalnego, dzięki któremu hamowany jest rozwój bakterii G(+) i G(-). Również
laktoperoksydaza wykazuje właściwości antyseptyczne, a jej działanie polega na katalizowaniu
reakcji utleniania w obecności nadtlenku wodoru tiocyjanianów do związków o szkodliwym
działaniu na drobnoustroje.
Opisywane białka, przeważnie immunoglobuliny, stanowią istotną grupę związków
wykorzystywanych w przemyśle farmaceutycznym, które są komercyjnie dostępne.
Strona 3 z 6
OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH
Tech. spec.  5, 7 maja 2010 r.
Prowadzący: Michał A. Olkowski
OZNACZENIA NA PRZYKA
ADZIE SERA
!!! WSZYSTKIE ODCZYNNIKI DODAJEMY POD DYGESTORIUM
W OBECNOÅšCI PROWADZ
CEGO ĆWICZENIA !!!
W pierwszej kolejności próbki należy doprowadzić do temperatury pokojowej, a następnie
przygotować próbę reprezentowaną poprzez utarcie sera bezpośrednio przed wykonaniem
oznaczeń.
1. Substancje azotowe ogółem
Zasada metody polega na zmineralizowaniu próbki na mokro przy użyciu kwasu siarkowego,
katalizatora (CuSO4 x 5 H2O) i substancji podwyższającej temperaturę wrzenia (K2SO4). Proces
mineralizacji przyspiesza siÄ™ dodajÄ…c ok. 30% H2O2.
1. Utlenianie białek (i innych związków organicznych):
2H2SO4 ®ð 2SO2 + 2H2O + O2
--OOC-R-NH3+ + O2 ®ð xCO2 + yH2O + zNH3
2. WiÄ…zanie wydzielonego amoniaku przez kwas siarkowy:
2NH3+H2SO4 ®ð (NH4)2SO4
3. Ilość amoniaku oznacza się metodą miareczkową:
Po całkowitym zmineralizowaniu próbkę alkalizuje się stężonym roztworem NaOH:
(NH4)2SO4 + 2NaOH ®ð Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 (alkalizacja)
NH3 + H3BO3 ®ð NH4H2BO3 (wiÄ…zanie amoniaku przez kwas borowy)
Ilość związanego amoniaku oznacza się przez miareczkowanie destylatu przez
0,1 N HCl wobec np. oranżu metylowego lub wskaz
nika Tashiro (0,2 g czerwieni metylowej i 0,1 g
błękitu metylenowego rozpuszczone w 100 cm3 96% etanolu):
NH4H2BO3 + HCl ®ð NH4Cl + H3BO3
Oznaczoną zawartość azotu przelicza się na białko w mleku stosując współczynnik przeliczeniowy
6,38. Wynika on stąd, że główne białko mleka  kazeina zawiera przeciętnie 15,68% azotu.
Wykonanie
Odważyć po 0,5 g przygotowanego uprzednio sera z dokładnością do 0,001 g na papierze
pergaminowym, a następnie przenieść ilościowo do kolby Kjeldahla, po czym dodać przygotowaną
uprzednio mieszaninę do spalania (5 g K2SO4, 0,3 g CuSO4 x 5 H2O) oraz ostrożnie pod
wyciÄ…giem: 10 cm3 H2SO4 (d=1,84 g/cm3) i 2 cm3 perhydrolu (30% H2O2). Po dodaniu
odczynników przeprowadzić mineralizację próbek w zestawie umieszczonym pod dygestorium,
zwracając uwagę na poprawność podłączenia mechanicznego wyciągu powietrza. Spalanie
prowadzić przez 40 minut w temperaturze 280oC, a następnie przez 2,5 h w temperaturze 480oC.
Strona 4 z 6
OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH
Tech. spec.  5, 7 maja 2010 r.
Prowadzący: Michał A. Olkowski
Kiedy próbka zostanie całkowicie zmineralizowana i zawartość kolby stanie się zupełnie
przezroczysta, ogrzewanie powinno prowadzone być przez ok. 30 minut. Zmineralizowane próbki
w kolbach Kjeldahla po ochłodzeniu należy spłukać 50 cm3 chłodnej wody destylowanej.
Następnie kolbę należy umieścić w aparacie do destylacji KJELTEC 2100 firmy FOSS, gdzie
zostanie oddestylowany amoniak. Do kolby stożkowej o pojemności 200 cm3 dodać około 40 cm3
4% kwasu borowego (z dodatkiem odczynnika Tashiro) i umieścić w odbieralniku aparatu.
Otrzymany destylat miareczkować 0,1 N HCl wobec 2% roztworu fenoloftaleiny, do uzyskania
barwy jasnoróżowej. W taki sam sposób wykonano próbę ślepą, stosując do spalania zamiast
próbki wodę destylowaną.
Procentową zawartość substancji azotowych ogółem w serze obliczano wg wzoru:
gdzie:
5ØIÜ1 - 5ØIÜ2 " 1,4 " 6,38 " 100
5ØeÜ =
5ØZÜ " 1000
V1  ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie właściwej [cm3],
V2  ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie odczynnikowej [cm3],
m  naważka sera [g],
6,38  współczynnik przeliczeniowy azotu na białko.
2. Azot Amoniakalny
Zasada metody polega na oznaczeniu przez destylacjÄ™ wodnego wyciÄ…gu sera po Å‚agodnym
zalkalizowaniu przez dodanie MgO i zmiareczkowanie otrzymanego destylatu. Azot amoniakalny
występuje w serach w postaci związków amonowych i częściowo wolnego amoniaku.
Wykonanie
Odważyć po 12,5 g sera z dokładnością do 0,01 g, a następnie rozetrzeć w moz
dzierzu, dodajÄ…c
stopniowo ok. 50 cm3 wody destylowanej o temperaturze 40°C. OtrzymanÄ… emulsjÄ™ przenieść
ilościowo do kolby miarowej o pojemności 250 cm3, popłukując moz
dzierz porcjami wody
destylowanej. Dodać około 3-4 krople 40% roztworu formaliny (w celu zahamowania dalszej
proteolizy biaÅ‚ek) i zawartość kolby dokÅ‚adnie wymieszać, po czym schÅ‚odzić do temperatury 20°C
i dopełnić wodą destylowaną do kreski i wytrząsać przez około 5 minut. Wytrząsanie powtarzać
w odstępach co 10 min. Przez 1 godzinę. Po tym zabiegu do kolb włożyć spiralnie zwinięty drucik
i na około 1,5 godziny wstawić kolby do lodówki (lub do wody z lodem). Po 1,5 godzinie inkubacji
za pomocą drucika usunąć całkowicie zestalony w szyjce kolb korek tłuszczu. 50 cm3 wcześniej
przefiltrowanego przesączu, odmierzyć do kolby destylacyjnej aparatu Kjeldahla, dodać 1 g MgO
i destylować do 25 cm3 4 % H3BO3 (z dodatkiem odczynnika Tashiro). Destylat miareczkować do
zmiany barwy za pomocÄ… 0,1 M HCl.
Procentową zawartość azotu amoniakalnego obliczano wg wzoru:
Strona 5 z 6
OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH
Tech. spec.  5, 7 maja 2010 r.
Prowadzący: Michał A. Olkowski
5ØIÜ " 1,4 " 5 " 6,38 " 100
5ØeÜ =
5ØZÜ " 1000
gdzie:
V- ilość 0,1 N HCl zużyta do miareczkowania [cm3],
m  naważka sera [g].
3. Azot Rozpuszczalny
Substancje azotowe sera rozpuszczalne w wodzie postajÄ… z nierozpuszczalnego w wodzie
parakazeinianu wapnia podczas dojrzewania sera. Są one reprezentowane przez różne związki
wielkoczÄ…steczkowe, jak: albumozy, peptony i polipeptydy oraz zwiÄ…zki prostsze, jak proste
peptydy, aminokwasy i amoniak (zwiÄ…zki w postaci soli amonowych). Oznacza siÄ™ je w wodnym
wyciÄ…gu metodÄ… Kjeldahla.
Wykonanie
Odważyć po 12,5 g sera z dokładnością do 0,01 g, a następnie rozetrzeć w moz
dzierzu, dodajÄ…c
stopniowo ok. 50 cm3 wody destylowanej o temperaturze 40°C. OtrzymanÄ… emulsjÄ™ przenieść
ilościowo do kolby miarowej o pojemności 250 cm3, popłukując moz
dzierz porcjami wody
destylowanej. Dodać około 3-4 krople 40% roztworu formaliny (w celu zahamowania dalszej
proteolizy biaÅ‚ek) i zawartość kolby dokÅ‚adnie wymieszać, po czym schÅ‚odzić do temperatury 20°C
i dopełnić wodą destylowaną do kreski i wytrząsać przez około 5 minut. Wytrząsanie powtarzać
w odstępach co 10 min. Przez 1 godzinę. Po tym zabiegu do kolb włożyć spiralnie zwinięty drucik
i na około 1,5 godziny wstawić kolby do lodówki (lub do wody z lodem). Po 1,5 godzinnej inkubacji
za pomocą drucika usunąć całkowicie zestalony w szyjce kolb korek tłuszczu i pobrać pipetą znad
osadu około 100 cm3 roztworu, który następnie należy przefiltrować przez sączek z bibuły.
Dalszą część oznaczenia przeprowadzić identycznie jak w punkcie 1 wykorzystując 25 cm3 filtratu.
Procentową zawartość substancji azotowych rozpuszczalnych w serze obliczyć wg wzoru:
5ØIÜ1 - 5ØIÜ2 " 1,4 " 6,38 " 100 " 10
5ØeÜ =
5ØZÜ " 1000
gdzie:
V1  ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie właściwej [cm3],
V2  ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie odczynnikowej [cm3],
m  naważka sera [g],
6,38  współczynnik przeliczeniowy azotu na białko.
LITERATURA
1. Bylund G. 1995: Dairy Handbook; Tetra Pak Processing Systems AB S-221 86 Lund, Sweden
2. Pijanowski E. 1984: Zarys chemii i technologii mleczarstwa. Tomy 1, 2 i 3., Państwowe
Wydawnictwo Naukowe, Warszawa
3. Zmarlicki (red.) 1981: Ćwiczenia z analizy mleka i produktów mlecznych, Skrypty SGGW-AR
w Warszawie, wydanie II, 40-51.
Strona 6 z 6