Terapia Genowa Nowotworów
Co to jest terapia genowa? Dlaczego jest
stosowana?
u�Terapia genowa = wprowadzenie
prawidłowych genów do komórek które
zawierają defektywne geny w celu
rekonstrukcji prawidłowego białka
(fenotypu)
Strategie terapii genowej
u�Modyfikacja komórek somatycznych
przez transfer prawidłowych genu(ów)
do genomu gospodarza.
u�Komórki somatyczne stosowane aby
mieć pewność że wprowadzony gen nie
będzie dziedziczny na następne
generacje.
u�Geny mogą być wprowadzane do
komórek pacjenta bezpośrednio lub
pośrednio, a po wprowadzeniu mogą się
integrować z chromosomem albo
pozostawać poza nim
Pierwsza  Terapia Genowa
u�Pierwszy protokół terapii genowej został
przeprowadzony 14 września 1990 roku
 4 letnia dziewczynka Ashanti DeSilva
poddana terapii przeciw SCID
t�Ciężki wrodzony niedobór odporności (Sever
combined immunodeficiency)
Dr. W. French Anderson i jego pacjent po terapii genowej
Ashanti DeSilva
ADA
u� ADA - deaminaza adenozynowa bierze udział w degradacji
kwasów nukleinowych i jest enzymem syntetyzowanym przez
wiele typów komórek.
u� Wrodzony niedobór tego enzymu jest szczególnie ostro
widoczny w przypadku limfocytów T, co powoduje, że
pacjenci ADA cierpią na złożone upośledzenie układu
odpornościowego.
u� Transfer genów ADA do komórek T ADA- przywrócił
normalny fenotyp.
7
SCID (Sever combined immunodeficiency)
SCID
ADA
SCID to ostra choroba jest z założenia dobrym obiektem terapii genowej
z kilku powodów:
u� gen ADA jest mały i dobrze scharakteryzowany
u� docelowymi komórkami są dobrze dostępne limfocyty T, które mogą
być utrzymywane w kulturze umożliwiając terapię ex vivo
u� choroba ma charakter recesywny, a ekspresja genów nie jest zbyt
ścisła  osobnicy normalni wykazują duży zakres poziomu enzymu
od 10 do 5000% wartości średniej.
9
Autosomalna nieprawidłowość recesywna
Terapia genowa może być przeprowadzana:
u� in vivo przez transfer materiału genetycznego
bezpośrednio do organizmu pacjenta (terapia
genowa in vivo)
u� lub komórki mogą być pobrane od pacjenta i do
nich zostać wstawiony materiał genetyczny
(terapia genowa ex vivo).
in vivo
ex vivo
Metody transferu genów
Cztery klasy wektorów wirusowych do
zastosowania w terapii genowej
u�wektory retrowirusowe
u�wektory adenowirusowe
u�wektory wirusa opryszczki
u�wektory wirusa związanego z
adenowirusem  stowarzyszone (AAV)
Retrowirusy
Adenowirusy
Metody transferu genów w terapii genowej
Główne metody transferu genów w terapii genowej i ich zastosowanie
Metoda transferu Efektywność Efektywność Zastosowanie w terapii
genów transferua integracjia genowejb
Ex vivo In vivo
Wektor Wysoka Wysoka + ?
retrowirusowy
Wektor Wysoka Niska ą +
adenowirusowy
Wektor oparty na Niska Niska ą +
wirusie opryszczki
Wektory pochodne Wysoka Wysoka + ?
od adenowirusa
Endocytoza przy Wysoka Niska  +
udziale receptorów
Liposomy Niska Niska ą +
a
Na podstawie transferu genów do kultur komórkowych
b
(+) szerokie zastosowanie; (ą) zastosowanie ograniczone; ( ) brak zastosowania lub zastosowanie
niewielkie.
Terapie monogenowe
Strategie terapii genowej nowotworów
u�Kompensacja defektu genetycznego
u�Korekta mutacji, rewersja zmutowanego genu
u�Hamowanie ekspresji zmutowanego genu
u�Bezpośrednia eliminacja komórek
u�Uzyskanie przez komórki nowych cech
fenotypowych
SMaRT"! - technika korekty mutacji
u�
SMaRT"! - "Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing."
u�
Celem terapii jest transkrypt mRNA kopiowany z genu
niosącego mutację.
u�
Zastąpienie genu z mutacją genem prawidłowym z
wykorzystaniem naturalnego mechanizmu składania genów
u�
Dostarczenie ssRNA homologicznego do sekwencji intronu
sąsiadującej z eksonem uszkodzonego genu.
u�
SMaRT"! jest komercyjnie dostępny w firmie Intronn, Inc.
21
HAMOWANIE EKSPRESJI GENÓW I
KOREKCJI MUTACJI
u� terapia oparta na tworzeniu tripleksów  zawiera wiązanie
specyficznego dla genu oligonukleotydu (TFO) do ds DNA w celu
hamowania transkrypcji.
u� terapia antysensowa  zawiera wiązanie specyficznego dla genu
oligonukleotydu lub polinukleotydu do RNA; w niektórych
przypadkach stosuje się otrzymany metodami inżynierii genetycznej
rybozym, cząsteczkę RNA o właściwościach katalitycznych, która może
trawić transkrypt RNA.
u� terapia z zastosowaniem wewnątrzkomórkowych przeciwciał i
aptamerów oligonukleotydowych  opiera się na skonstruowaniu
przeciwciał, które mogą być skierowane do specyficznego białka lub
aptamerów oligonukleotydowych, specyficznie wiążących się do
wybranych polipeptydów.
22
siRNA (small interfering RNA)
u�
23
miRNA vs siRNA
Dwa kompleksy:
1- miRNA niepełne dopasowanie. Następuje sortowanie RNA na tzw. p-
bodies (processing bodies) z dodatkowymi białkami. mRNA jest
degradowany lub magazynowany.
2- siRNA perfekcyjne dopasowanie. mRNA jest degradowany.
24
Dlaczego terapia genowa ?
25
Sztuczne uśmiercanie komórek rakowych
26
27
28
ZEGAR BIOLOGICZNY KOMÓRKI - SKRACANIE TELOMERÓW
l� wzrost aktywności telomerazy
w komórkach nowotworowych
poszukiwanie specyficznych
l� odbudowywanie i wydłużenie
telomerów - nabycie cech inhibitorów telomerazy
nieśmiertelności
inhibitor GRN163L  czerniak
29
HAMOWANIE ANGIOGENEZY
30
Supresorowa terapia genowa
Zwiększenie puli genowej
Wprowadzanie genów supresorowych dzikiego typu
Aktywacja procesu apoptozy
31
Przykłady prób terapii genowej chorób
nowotworowych
Schorzenie Zmieniane komórki Strategia
Guzy mózgu Komórki guza in vivo Wprowadzanie fibroblastów gryzoni zawierających
Komórki guza ex vivo zrekombinowane retrowirusy dla infekcji komórek
mózgu i dostarczanie genu HSV-tk
Komórki macierzyste ex vivo Transfekcja DNA dla wprowadzenia antysensu IGF1
Rak sutka Fibroblasty ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu MDR1
Komórki macierzyste ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu IL4
Rak jelita grubego Komórki guza in vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu MDR1
Komórki guza ex vivo Liposomy dla dostarczenia genów kodujących HLA-
B7 i b�2-mikroglobulinę
Czerniak złośliwy Fibroblasty ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu IL2 lub TNF
Komórki guza in vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu IL2 lub IL4
Komórki guza ex vivo Liposomy dla dostarczenia genów kodujących HLA-
B7 i b�2-mikroglobulinę
Fibroblasty ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu IL2
Białaczka szpikowa Limfocyty T/komórki zezłośliwione Retrowirusy dla dostarczenia genu IL4
Nerwiaki Komórki guza Retrowirusy dla dostarczenia genu TNFA
Rak płuca Komórki guza Retrowirusy dla dostarczenia genu HSV-tk
Komórki guza in vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu KRAS
Fibroblasty ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu IL4
Rak jajnika Komórki guza in vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu TP53 dzikiego
typu
Komórki guza ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu HSV-tk
Nerczak Komórki macierzyste ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu MDR1
Komórki guza ex vivo Retrowirusy dla dostarczenia genu IL2 lub TNF
32
u� Every realm of medicine has its defining
moment, often with a human face attached.
Polio had Jonas Salk. In vitro fertilization had
Louise Brown, the first test-tube baby.
Transplant surgery had Barney Clark, the
Seattle dentist with the artificial heart. AIDs
had Magic Johnson. Now gene therapy has
Jesse Gelsinger.
Sheryl Gay Stolberg