Nowoczesne techniki mikroskopowe
1 mm = 1000µm
1µm = 1000 nm
1 nm = 10 Å
1 Å = 100 pm
Metody utrwalania tkanek
·ð Poprzez usuniÄ™cie wody i zastÄ…pienie jej alkoholami (acetonem)
·ð Poprzez zwiÄ…zanie grup aminowych biaÅ‚ek(formaldehyd, paraformaldehyd, glutaraldehyd)
Zostawiamy wodę, ale blokujemy białka. Białko traci swoją aktywność, np. enzymatyczną
·ð Poprzez stabilizacjÄ™ wody( zablokowanie krystalizacji) w temperaturze > -1400C.(witryfikacja)
Histochemia  wykorzystywanie reakcji chemicznych do badań morfologicznych
Immuno-histochemia  wykorzystanie substancji z zakresu immunologii ( np. przeciwciała) do
wykazania reakcji barwnej w określonym miejscu  np. na tkance.
Poprzez utrwalanie tkanek dążymy do zatrzymania reakcji chemicznych
Utrwalanie alkoholem/acetonem
Pozytywy Negatywy
Nie zmienia grup reaktywnych białek Zmienia strukturę II-II-IV rzędową
( przestrzenną) białek ( denaturacja
białek)
Szybie utrwalanie ( penetracja) Zbyt długie przetrzymywanie
powoduje stwardnienie materiału
(overfixed)
Utrwaanie małych skrawków (1-4mm) Krótki czas przechowywania materiału
Utrwalanie aldehydami
Pozytywy Negatywy
Utrwalanie nieagresywne(12-24 Inaktywacja większości enzymów (grup
godziny) reaktywnych)
Brak zjawiska nadmiernego Osłabienie odczynów
utrwalania(overfixation) immunohistochemicznych
Utrzymanie naturalnej barwy tkanek Potrzeba płukania tkanek po
utrwaleniu(przed wykonaniem
odczynów)
Możliwość przechowywania tkanek
latami
Utrwalacze Złożone
Utrwalacze makroanatomiczne  b. dobre do dużych próbek, gorsze odwzorowanie szczegółów
Utrwalacze cytoplazmatyczne  dobre do małych próbek
Utrwalacze jÄ…drowe(np. Carnoy s)
Witryfikacja
Fizyczne utrwalenie tkanki poprzez zestalenie wody bez wytworzenia kryształków. Woda staje się
homogenna i przechodzi w strukturę, przyp. Miód. Jest twarda, zestalona. W Polsce niemożliwe jest
tworzenie wycinków
Rewitryfikacja  Przywrócenie stanu pierwotnego.
Kriobiologia
·ð Krioprezerwacja tkanek(cryopreservation)
-Zamrażanie(szybkie, wolne, kontrolowane i niekontrolowane)
-Witryfikacja (to nie zamrażanie!!)
·ð Liofilizacja
·ð Hypotermia(+4 do -33)
Przygotowanie skrawka do witryfikacji:
Wyciąganie wody z komórki poprzez umieszczanie jej w roztworze hiperosmotycznym względem
badanego skrawka.CP  Cryopreservant
Zasady szybkiego zamrażania
Szybkie przejście temp <-900C (optymalna -1300C)
Można zastosować spray odbierający z tkanek ciepło(-500C)
Można zastosować płynny CO2(-700C). Zmienia się on gwałtownie w gaz i odbiera ciepło z tkanek
Barwienie
·ð Reakcja barwna w oparciu o siÅ‚y elektrostatyczne
-Proteina-NH3+ + eozyna- = Proteina-NH3-eozyna KOLOR CZERWONY
-Proteina-OSO3-+B.metylenowy+=Proteina-OSO3- KOLOR NIEBIESKI-b.metylenowy
·ð Reakcja barwna w oparciu o wiÄ…zania kowalencyjne  w reakcjach histochemicznych
-PAS(periodic acid-Schiff) do wykrywania cukrów
-WiÄ…zanie Abs z FITC
·ð Reakcja barwna w oparciu o siÅ‚y Van der Waalsa(0,2nm)
Enzymy w histochemii
Enzymy hydrolityczne(metoda Gomori/Gomori s acid phosphates)
Enzymy oksydoredukcyjne
Porównanie mikroskopów
Miroskop świetlny  maksymalne powiększenie 1500x. Światło przechodzi przez próbkę i pada na
soczewkę. Rozdzielczość poniżej 1 nm
Mikroskop elektronowy  z
ródłem światła jest katoda. Wiązka elektronów przechodzi przez preparat i
powstaje obraz. Obraz płaski bez elektronów odbitych!
Mikroskop skaningowy  Widoczne są wszystkie odbite od preparatu elektrony, które tworzą obraz
przestrzenny.
 Mikroskop optyczny, Prześwietleniowy
prześwietleniowy mikroskop elektronowy
Oświetlenie Oświetlenie  Światło Wiązka elektronów,
widzialne, = 0,04 Å
 = 4000  8000 Å
Maksymalne 2.000 x 5.000.000 x i więcej
powiększenie
Zdolność rozdzielcza 1µm czyli 10.000 Å 1.4  2.2 Å
Sposób obserwacji bezpośredni Pośredni (obraz tworzony
na ekranie
fluorescencyjnym)
Preparaty Przez
roczyste optycznie Przez
roczyste dla wiÄ…zki
elektronów
Stosowane soczewki Szklane, kwarcowe Elektromagnetyczne,
elektrostatyczne
Mikroskop sił atomowych
Uzyskiwany obraz jest przestrzenny. Obraz zbierany jest przez fotodiodÄ™. Mikroskopia badajÄ…ca
powierzchniÄ™.
Metody badania:
1.Contact mode  laser odpowiednio naciska końcówkę dotykającą preparat. Bada w ten sposób
powierzchnię. Obraz przekształcony jest w impuls elektryczny wyłapywany przez fotodiodę, która
wysyła go do komputera.
2.Tapping mode  końcówa z odpowiednią siłą i określoną częstotliwością dotyka powierzchni
preparatu. Na podstawie zmian częstotliwości tworzy obraz.
Mikroskopia konfokalna
Znalazła zastosowanie w dermatologii i okulistyce. Ogniskuje się na małej powierzchni
W mikroskopie konfokalnym laser jest
z
ródłem światła(od 400-750 nm). Jest ono
ukierunkowane w stronÄ™ preparatu na
określoną płaszczyznę. W momencie
przechodzenia przez preparat wiÄ…zka
wyzwala fotony, które wracają po tym
samym torze do detektora. W detektorze
ulegajÄ… one wzmocnieniu(wyzwalajÄ…
elektrony). Wyzwolony impuls elektryczny
trafia do obróbki końcowej w komputerze.
Wyzwalanie elektronów w fotopowielaczu
przebiega na zasadzie reakcji łańcuchowej.
Wivascope to urządzenie użyteczne w
okulistyce i dermatologii.
Metoda trójbarwna Massona to metoda do
badania tkanki Å‚Ä…cznej i zmian
niedokrwiennych. Jest to element
histochemii