Enzymologia
Notatki z wykładów prof. W. Jarmuszkiewicz i prof. H. Kmity, wersja 1.3 (17.05.2009)
Wykład 1  03.03.2009
Enzymy sprawują kontrolę nad metabolizmem komórki. Metabolizm wymaga
skoordynowanego działania enzymów. Enzymy wzmacniają reaktywność reakcji chemicznej
(dzięki czemu część reakcji może zachodzić w temperaturze komórki) oraz zapewniają
precyzyjną kontrolę metabolizmu.
Enzymy są zestawione w szlaki bądz
cykle, co zapewnia ich skoordynowane działanie.
Skoordynowane działanie enzymów jest także możliwe dzięki kontaktom miedzy szlakami i
cyklami enzymatycznymi. Reakcje enzymatyczne są połączone w ciągi: produkt jednej reakcji
jest substratem drugiej.
Szlaki i cykle enzymatyczne zawierają punkty kontrolne (enzymy kluczowe), decydujące o ich
przebiegu.
Fosfofruktokinaza (kluczowy enzym glikolizy):
fruktozo-6-fosforan + ATP fruktozo-1,6-bisfosforan + ADP + H+
symulowana jest przez AMP, ADP, hamowana przez ATP, cytrynian.
Enzymy kluczowe są białkami allosterycznymi. Białko allosteryczne dostosowuje swoje
działanie do sytuacji zewnętrznej, czyli reaguje na informacje w postaci oddziałujących z nimi
cząsteczek. Cechą charakterystyczną działania białka allosterycznego jest kooperatywność,
tzn. współdziałanie tworzących je podjednostek, co zapewnia zwiększoną skuteczność tego
działania.
Istotą katalizy enzymatycznej jest specyficzne wiązanie stanu przejściowego. Pierwszym
etapem katalizy enzymatycznej jest utworzenie kompleksu enzym-substrat (ES). Substraty
wiążą się w miejscu aktywnym enzymu w określonej, korzystnej orientacji przestrzennej.
Zwykle substraty wiązane są w sposób silnie selektywny, co ma wpływ na katalityczną
specyficzność enzymów.
Enzymy przyspieszają reakcję ponad milionkrotnie.
Anhydraza węglanowa  jest jednym z najszybszych enzymów:
CO2 + H20 "! O=C-(OH)2
Enzymy charakteryzuje duża specyficzność pod względem:
1
 katalizowanej reakcji chemicznej,
 substratów.
W reakcjach katalizowanych przez enzymy rzadko występują reakcje uboczne prowadzące do
powstania zbędnych produktów.
Katalizowanie reakcji przez enzymy prowadzi do wytworzenia stanów przejściowych o
najwyższej energii. Stabilizacja stanów przejściowych jest istotą katalizy enzymatycznej.
Specyficzność substratowa i specyficzność reakcji.
Enzymy proteolityczne prowadzą:
- proteolizę, czyli hydrolizę wiązania peptydowego:
Peptyd +H20 "! komponent karboksylowy + komponent aminowy
- oraz zwykle także hydrolizę wiązania estrowego:
Ester + H20 "! kwas + alkohol
Specyficzność enzymów proteolitycznych:
Trypsyna (enzym trawienny) rozcina wiązanie peptydowe po karboksylowej stronie reszt
argininy i lizyny.
Trombina (uczestnicząca w krzepnięciu krwi) rozcina tylko wiązanie Arg-Gly.
Bakteryjna subtylizyna nie rozróżnia bocznych łańcuchów aminokwasowych sąsiadujących z
hydrolizowanym wiązaniem (najmniej specyficzny enzym proteolityczny).
Polimeraza DNA I to przykład enzymu o wysokiej specyficzności. Polimeraza  myli się
rzadziej niż raz na milion operacji.
Specyficzność enzymu wynika z precyzyjnej interakcji substratu z enzymem, co z kolei jest
wynikiem odpowiedniej struktury trójwymiarowej enzymu.
Aktywność wielu enzymów wymaga kofaktorów.
Apoenzym + kofaktor = holoenzym
Kofaktory enzymów:
 koenzym  kofaktor będący małą cząsteczką organiczną,
 grupa prostetyczna  koenzym silnie związany z enzymem,
  kosubstrat  koenzym luz
no związany z enzymem.
kofaktor (koenzym/metal) enzym
pirofosforan tiaminy dehydrogenaza pirogronianowa
2
nukleotyd flawinoadeninowy monooksydaza aminowa
Zn2+ anhydraza węglanowa
Zn2+ karbkoskypeptydaza
Mg2+ EcoRV
dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy dehydrogenaza mleczanowa
fosforan pirydoksalu fosforylaza glikogenowa
Mg2+ heksokinaza
Enzymy przekształcają z dużą wydajnością jedną formę energii w drugą:
 zamiana energii świetlnej na energię wiązań chemicznych z wytworzeniem gradientu
jonów w czasie fotosyntezy,
 zamiana energii chemicznej cząsteczek pożywienia na energię gradientu jonowego a
następnie energię wiązania chemicznego ATP  w mitochondriach,
 zamiana energii chemicznej ATP na energię mechaniczną w mięśniu (miozyna),
  zamiana energii chemicznej ATP na wytworzenie gradientu jonowego  pompy
błonowe.
Molekularne mechanizmy działania enzymów poznajemy dzięki mikrografii rentgenowskiej
ujawniającej szczegóły struktury 3D.
ATPaza-Ca2+ używa energii hydrolizy ATP do transportu Ca2+ w poprzek błony komórkowej,
wytwarzając gradient jonów Ca2+.
Nazwa enzymu zwykle pochodzi od jego substratu lub katalizowanej reakcji (końcówka 
aza). Są też nazwy potoczne.
Klasyfikacja enzymów oparta jest na typie przeprowadzanej reakcji.
6 głównych klas enzymów:
klasa typ reakcji Przykład
1. Oksydoreduktazy Utlenianie-redukcja Dehydrogenaza mleczanowa
2. Transferazy Przenoszenie grup Kinaza nukleozydomo-
nofosforanowa (kinaza NMP)
3. Hydrolazy Reakcje hydrolizy Chymotrypsyna
(przenoszenie grup
funkcyjnych na cząsteczki
wody)
4. Liazy Utworzenie wiązań Fumaraza
podwójnych poprzez dodanie
lub usunięcie grup
3
5. Izomerazy Izomeryzacja Izomeraza triozofosforanowa
(wewnątrzcząsteczkowe
przeniesienie grup)
6. Ligazy Ligacja (połączenie) dwóch Syntetaza aminoacylo-tRNA
substratów na koszt hydrolizy
ATP
Przykład:
ATP + NMP "! ADP + NDP
Nazwa potoczna  kinaza NMP = kinaza nukleozydomonofosforanowa.
Oznaczenie numerowe  EC 2.7.4.4 (1. liczba  klasa, druga  przenoszona grupa
(fosforanowa), trzecia  akceptor (fosforan), czwarta  jeszcze bardziej specyficzna).
I zasada termodynamiki  zasada zachowania energii  w każdym procesie suma energii
układu i otoczenia pozostaje stała. Energia nie może być tworzona lub niszczona; może być
tylko przekształcana.
II zasada termodynamiki  wszystkie procesy przebiegają w takim samym kierunku, aby
następował sumaryczny wzrost entropii wszechświata, aż do ustalenia się stanu równowagi.
Każdy układ dąży do stanu maksymalnego nieuporządkowania (entropii).
Energia swobodna (Gibbsa, G)  funkcja termodynamiczna wiążąca pierwszą i drugą zasadę
termodynamiki  jest użyteczną funkcją dla zrozumienia działania enzymów.
"G = "H  T"S
Gdzie:
- "G  zmiana swobodnej energii układu podczas przemiany przy stałej temperaturze (T) i
ciśnieniu (p).
- "H  zmiana entalpii tego układu
- "S  zmiana jego entropii.
Ponieważ:
- "H = "E + p"V,
Gdzie:
- "E  zmiana wewnętrznej energii,
- "V  zmiana objętości (zwykle bardzo mała)
Stąd:
"G = "E  t"S
4
A zatem "G zależy zarówno od zmiany energii wewnętrznej, jak i od zmiany entropii układu.
"G dostarcza informacji o spontaniczności reakcji, a nie o jej szybkości:
"G = 0  układ w stanie równowagi, brak zmian
"G < 0  wartość ujemna  reakcja może zajść spontanicznie, reakcja egzoergiczna
"G > 0  wartość dodatnia  reakcja nie może zajść spontanicznie, reakcja endoergiczna
"G reakcji zależy jedynie od "G produktów (stanu końcowego) i substratów (stanu
początkowego). "G reakcji nie zależy od drogi przemiany czy molekularnego mechanizmu
przemiany. "G reakcji nie daje informacji o szybkości reakcji.
Enzymy nie wpływają na "G reakcji.
Enzymy wpływają na energię wymaganą dla zapoczątkowania reakcji (czyli swobodną
energię aktywacji, "G! ), która określa szybkość reakcji.
Jednostki energii:
Dżul (J) jest ilością energii potrzebną do użycia siły 1 N przez odległość 1 m.
Kilodżul (kJ) równa się 1000 J.
Kaloria (cal) jest równoważna ilości ciepła potrzebnego do podwyższenia temperatury 1
grama wody z 14,5p C do 15,5p C.
Kilokaloria (kcal) równa się 1000 cal.
1 kcal = 4,184 kJ
1 kJ = 0,239 kcal
Wyznaczanie "G reakcji (aby określić spontaniczność reakcji):
A+B "! C+D
[C ][ D]
"G = "Gp + RT ln
[ A][ B]
R  stała gazowa, T  temperatura absolutna ([K]), [A], [B]  molowe stężenia (aktywności)
składników reakcji, "Gp  standardowa "G, gdy stężenia A, B, C, D równe są 1 M, a warunki
gazowe  1 atmosferze.
A zatem, "G zależy od właściwości substancji reagujących ("Gp ) i od ich stężeń.
Dla ułatwienia przyjęto, że pH 7 to wartość standardowa.
"Gp ' to "Gp w pH 7  zmiana standardowej energii swobodnej w pH 7.
"Gp jest związana ze stałą równowagi Keq.
5
W stanie równowagi "G = 0
[C ][ D]
0 = "Gp ' + RT ln
[ A][B ]
[C ][ D]
"Gp ' = - RT ln
[ A][B ]
Stała równowagi w warunkach standardowych K eq jest równa:
[C ][ D]
K eq =
[ A][B ]
Podstawiając powyższy wzór do jeszcze wyższego:
"Gp ' = - RT ln K eq
"Gp ' = - 2,303 RT log K
10 eq
-"Gp '
K =
eq
102,303 RT
Podstawiając R = 8,28 x 10-3 kJ mol-1 deg-1 oraz T=298 K (25p C)
-"Gp '
5,69
K =
eq
10
Zależność między "Gp ' i K (w 25p C): im większa K tym mniejsza "Gp ' (standardowa
eq eq
zmiana energii swobodnej).
K eq "Gp w [kJ/mol] "Gp w [kcal/mol]
1 0 0
10-1 5,69 1,36
10 -5,69 -1,36
Przykład obliczenia "Gp i "Gp  dla reakcji izomeryzacji DHAP do GAP:
W stanie równowagi stosunek [GAP]/[DHAP] = 0,0475 w 298 K (25p C) i pH 7, stąd K eq =
0,0475.
"Gp ' = - 2,303 RT log10 K Eq
"Gp ' = - 2,303 x 1,987 x 10-3 x 298 x log10 0,0475
"Gp ' = 1,80 kcal/mol (7,53 kJ/mol)
Jest to więc reakcja endoergiczna, która nie zajdzie spontanicznie w warunkach równowagi.
6
Gdy zmienimy stosunek [GAP]/[DHAP] do wartości 0,015 (na korzyść substratu), to "G reakcji
obliczona wg wzoru wyniesie:
[C ][ D]
"G = "Gp + RT ln
[ A][ B]
3 x10-6 M
"G = 1,80 kcal/mol + 2,303 RT log = 1,80 kcal/mol  2,49 kcal/mol =
10
2 x10-4 M
= - 0,69 kcal/mol (- 2,89 kJ/mol)
W tym przypadku reakcja zajdzie spontanicznie, gdyż jest reakcją egzoergiczną.
"G może być większa, mniejsza lub równa "Gp   zależnie od stężenia składników reakcji. Ma
to znaczenie w szlakach metabolicznych, gdy dla danej reakcji "Gp  > 0. Wówczas poprzez
dostosowanie stężenia substratów i produktów reakcja taka może stać się reakcją
spontaniczną. Na tej zasadzie opiera się sprzężenie reakcji tworzących szlaki metaboliczne.
Enzymy zmieniają szybkość reakcji nie mając wpływu na stan równowagi reakcji, tzn.
enzym zwiększa w tym samym stopniu szybkość reakcji zachodzącej w obu kierunkach
Dla przykładowej reakcji A "! B, gdzie dla A B:
 kF = stała szybkości Recka do przodu = 10-4/s,
 kR = do tyłu = 10-6/s.
kF/kR daje stałą równowagi reakcji:
k
[ B]
10-4
F
K = = = =100
[ A] k
10-6
R
Czyli niezależnie od obecności enzymu stała równowagi z tej reakcji jest zawsze równa 100.
Wnioski: enzym nie przesuwa stanu równowagi, tylko przyspiesza jego osiągnięcie.
Stan równowagi reakcji jest jedynie funkcją różnicy energii swobodnej między substratami a
produktami.
Wykład 2  10.03.2009
Enzymy przyspieszają reakcję ułatwiając tworzenie stanu przejściowego.
Stan przejściowy (S! ) ma energię wyższą zarówno od energii substratu (S) i produktu (P),
stąd jest najrzadziej występującym stanem w całym przebiegu reakcji.
7
Swobodna energia aktywacji Gibbsa (energia aktywacji, "G! ) jest różnicą energii swobodnej
między stanem przejściowym a substratem.
"G = GS!  GS
Enzymy przyspieszają reakcję obniżając energię aktywacji ("G! ) czyli ułatwiając tworzenie
stanu przejściowego. "G pozostaje bez zmian.
[rysunek: wykres wolnej energii od postępu reakcji]
Załóżmy, że stan przejściowy (S! ) i substrat (S) są w równowadze.
K! - stała równowagi dla tworzenia S!
V  szybkość tworzenia P z S! .
Szybkość reakcji ~ [S! ]
Ponieważ tylko S! (a nie S) może być przekształcony w produkt.
Im większa różnica między energią swobodną S i energią swobodną S! , tym mniejsza ilość
cząsteczek w stanie S! .
Ponieważ szybkość reakcji ~[S! ], które z kolei zależy od energii aktywacji ("G! ) to szybkość
reakcji (V) zależy od "G! .
Stosunkowo niewielkie obniżenie "G! (o 5,69 kJ/mol) daje znaczny (10x) wzrost V.
Niższa "G! (niższa bariera aktywacji) oznacza, że więcej cząsteczek posiada energię
wymaganą dla osiągnięcia S! .
Istotą katalizy enzymatycznej jest specyficzne wiązanie i stabilizacja stanu przejściowego,
który na drodze reakcji chemicznej jest stanem o najwyższej energii.
Intermediaty (związki pośrednie) (intermediates)  posiadają chemiczny czas życia dłuższy
niż wibracja cząsteczki, czyli >10-13s. Nawet jeśli S i P są stabilnymi cząsteczkami
chemicznymi, intermediaty (ES i EP) występują, przyjmując niskie wartości "G w diagramie
współrzędnych reakcji. Mniej stabilne intermediaty występują tylko podczas reakcji
katalizowanej przez enzym.
Przekształcenie dwóch kolejnych intermediatów reakcji stanowi etap reakcji (reaction step).
W reakcji złożonej z kilku etapów, szybkość całkowita zależy od etapu (lub etapów) o
największej energii aktywacji, tzw. etapu ograniczającego reakcję (rate limiting step).
8
E+S "! ES "! EP "! E+P
[obrazek: wykres Free energy od Reaction coordinate z zazn. Transition state]
Energia aktywacji jest barierą energetyczną dla reakcji chemicznych. Bariery te są istotne dla
życia: bez barier energetycznych, złożone makrocząsteczki spontanicznie zamieniane byłyby
do prostszych, a złożone i wysoce uporządkowane struktury metaboliczne nie mogłyby
istnieć.
W trakcie ewolucji enzymy  rozwinęły niższą energię aktywacji selektywnie dla reakcji
koniecznych dla przeżycia komórki.
Zasady badań enzymatycznych i kinetycznych.
Aktywność enzymu mierzymy oznaczając szybkość tworzenia P reakcji lub szybkość
zużywania S.
Wybór techniki pomiaru zależy od dostępności aparatury, odczynników, wymaganego
poziomu czułości, itd.
Podstawowe z
ródła literaturowe dotyczące metod badania aktywności poszczególnych
enzymów to:
-  Methods In Enzymology
-  Methods In Enzymatic Analysis
Krzywe przebiegu reakcji  uwagi praktyczne
Przyczyny zwolnienia reakcji:
- Ograniczenie dostępności S,
- zbliżanie się do stanu równowagi,
- inhibicja przez P,
- niestabilność jednego z elementów reakcji (E/S),
- inhibicja E zależna od czasu (niestabilność E),
- artefakty metodyczne:
a) ograniczenia techniczne wykraczające poza linearność pomiaru (pomiary
spektrofotometryczne),
b) brak linearności w reakcjach wspomagających (w układach sprzężonych),
- zmiany warunków pomiarowych.
[P]
[czas]
9
Istotą katalizy jest specyficzne wiązanie stanu przejściowego. Pierwszym etapem katalizy
enzymatycznej jest utworzenie kompleksu enzym-substrat (ES). Substraty wiążą się w
miejscu aktywnym enzymu w określonej, korzystnej orientacji przestrzennej. Zwykle
substraty wiązane są w sposób silnie selektywny, co ma wpływ na katalityczną specyficzność
enzymów.
[obrazek: enzymatic catalysis of a reaction between two substrates]
Dowody na istnienie kompleksu ES:
1. Reakcja katalizowana enzymatycznie wykazuje szybkość maksymalną, czyli przy
odpowiednio dużym stężeniu substratu, wszystkie miejsca katalityczne zostają
obsadzone.
2. Krystalografia rentgenowska pozwoliła na otrzymanie obrazów (o dużej
rozdzielczości) przedstawiających kompleksy ES lub kompleksy analog substratu 
enzym.
3. Zmiana w charakterystyce spektralnej enzymu lub substratu wraz z utworzeniem
kompleksu ES. Intensywność fluorescencji grupy fosforanu pirydoksalu (grupy
prostetycznej), znajdującej się w miejscu aktywnym syntetazy tryptofanowej, ulega
zmianie po dodaniu substratów reakcji, czyli seryny i indolu.
Miejsce aktywne enzymu to obszar, który:
 wytwarzając odpowiednią orientację przestrzenną specyficznie wiąże substraty (i
kofaktory), co sprzyja tworzeniu stanu przejściowego,
 zawiera reszty AA (tzw. grupy katalityczne enzymu) biorące udział w tworzeniu i
zrywaniu wiązań,
 bezpośrednio obniża energię aktywacji reakcji.
Cechy wspólne miejsc aktywnych enzymów:
1. Miejsce aktywne to trójwymiarowa szczelina utworzona przez grupy pochodzące z
różnych części sekwencji AA enzymu.
2. Miejsce aktywne zajmuje tylko stosunkowo małą część całkowitej objętości enzymu.
AA nie wchodzące w skład miejsca aktywnego tworzą: (często dopasowując się
przestrzennie) trójwymiarowe rusztowanie konieczne dla utworzenia miejsca
aktywnego, miejsca regulatorowe (miejsca wiążące aktywatory), miejsca
oddziaływania z innymi białkami, kanały, dzięki którym substraty docierają do miejsca
aktywnego.
3. Miejsca aktywne są hydrofobowymi zagłębieniami lub szczelinami. Miejsce wiążące S
znajduje się w szczelinie, która niedostępna jest dla cząsteczek wody. Niepolarny
(hydrofobowy) charakter szczeliny sprzyja wiązaniu S, a także katalizie. Czasami
szczelina zawiera specyficzne reszty polarne konieczne dla wiązania S i katalizy.
4. W miejscu aktywnym, wiele słabych niekowalencyjnych oddziaływań bierze udział w
wiązaniu S z E. Są to oddziaływania o energii swobodnej ok. 10-50 kJ/mol takie jak
oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, interakcje
10
hydrofobowe. Oddziaływania te wymuszają wysoki stopień specyficzności wiązania S
z E.
5. Specyficzność wiązania S z E zależy od precyzyjnie określonego ułożenia atomów w
miejscu aktywnym. Model klucza i zamka wiązania enzymu z substratem  w modelu
tym, kształt miejsca aktywnego enzymu jest komplementarny do kształtu substratu.
Model wymuszonego dopasowania wiązania enzymu z substratem  w modelu tym
wiązanie substratu pociąga za sobą zmianę kształtu enzymu. Kształt miejsca
aktywnego staje się komplementarny do kształtu substratu dopiero po związaniu
substratu.
Energia wiązania między enzymem a substratem  energia swobodna uwalniana podczas
wiązania E i S, a więc podczas tworzenia się licznych słabych oddziaływań między E i S.
Maksymalizacja energii wiązania jest odpowiedzialna za dużą specyficzność substratową
wykazywaną przez wiele enzymów. Do pełnego zestawienia tych oddziaływań dochodzi tylko
wtedy, gdy substrat jest w stanie przejściowym, a zatem, maksymalna energia wiązania jest
uwalniana gdy enzym ułatwia tworzenie stanu przejściowego.
Energia uwalniana podczas oddziaływań pomiędzy enzymem i substratem może być
traktowana jako obniżenie energii aktywacji.
Badanie szybkości reakcji chemicznych nazywamy kinetyką, a badanie szybkości reakcji
katalizowanych przez enzymy  kinetyką enzymatyczną. Kinetyczny opis aktywności
enzymów jest konieczny dla zrozumienia działania enzymów.
A P  reakcja pierwszego rzędu
V = k[A], jednostka: k/s (k  stała szybkości reakcji)
A + B P lub 2A P  reakcja drugiego rzędu
V=k[A][B] lub V=k[A]2; jednostka k/(Ms)
Istnieją także reakcje pseudopierwszego rzędu (jeden z dwóch substratów w znacznym
nadmiarze, kinetyka zależy tylko od jednego) i reakcje zerowego rzędu (gdy szybkość reakcji
nie zależy od stężenia substratu).
1913  opracowanie kinetycznego modelu działania enzymów: Leonor Michaelis, Maud
Menten.
Model Michaelisa-Menten opisuje właściwości kinetyczne wielu enzymów.
Vmax
V
max
2
[S]
11
Wykres zależności szybkości reakcji Vo od stężenia substratu [S] dla enzymu zachowującego
się zgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten, pokazuje że osiągana szybkość jest maksymalna
(V ).
max
Przy stałym stężeniu E, Vo jest prawie liniowo proporcjonalna do [S] przy małym [S], przy
dużym [S] Vo jest prawie niezależna od [S].
Stała Michaelisa (K ) to stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji równa jest połowie
M
Vmax.
Szybkość katalizy (Vo) to liczba moli produktu utworzonego w czasie 1 s.
Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji (Vo).
Vo
produkt [S4]
[S3]
[S2]
[S1]
czas
Ilość produktu tworzonego przy różnych stężeniach substratu jest wykreślona jako funkcja
czasu. Szybkość początkowa (Vo) dla każdego stężenia substratu jest wyznaczona z
nachylenia krzywej na początku reakcji (przy małym stężeniu P), gdy reakcja odwrotna jest
jeszcze nieznaczna.
W stanie równowagi nie obserwujemy zmian netto [S] i [P].
Zmiany w stężeniu uczestników reakcji katalizowanej przez enzym jako funkcja czasu.
W warunkach stanu stacjonarnego stężenia intermediatów reakcji ([ES]) nie zmieniają się.
Zmienia się tylko [S] i [P], aż do osiągnięcia stanu równowagi, przeciwnie do stanu
przedstacjonarnego.
stężenie stężenie
stan stacjonarny czas czas
Omówienie kinetycznego modelu Michealisa-Menten:
12
Vo = k2 [ES]
Szybkość tworzenia ES = k1 [E] [S]
Szybkość rozpadu ES = (k-1 2
+ k ) [ES]
W stanie stacjonarnym szybkość tworzenia ES = szybkości rozkładu ES.
k1[E][S] = (k-1 + k2) [ES]
śą k-1�ąk2źą
[ E ][S ]
=
[ ES ] k1
Wprowadz
my nową stałą KM  stała Michaelisa
k-1�ąk2
K =
M
k1
[ E ][S ]
[ ES ]=
K
M
Maksymalna szybkość reakcji (Vmax) jest uzyskana, gdy wszystkie miejsca katalityczne enzymu
są wysycone substratem, tzn. gdy [ES]=[E] . Stąd:
T
Vmax = k2[E]T
Równanie Michaelisa-Menten (dla reakcji z 1 substratem):
[S ]
V =V
0 max
[ S ]�ąK
M
Zależność V od [S]:
0
Przy małym [S], gdy [S] jest znacznie mniejsze od KM, tzn. szybkość reakcji jest proporcjonalna
V
max
do S: V = [S ] .
0
K
M
Przy dużym [S], gdy [S] jest dużo większe od KM, tzn. osiągnięta została wartość Vmax, która
jest niezależna od [S], Vo=Vmax.
13
V
max
Kiedy [S]=KM, wtedy V = .
0
2
Zatem KM jest równa stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę swojej
maksymalnej szybkości.
Znaczenie wartości KM:
Mała K  enzym o dużym powinowactwie do substratu.
M
Duża KM  enzym o małym powinowactwie do substratu.
Fizjologiczne znaczenie K :
M
 fizjologiczna wrażliwość na aldehyd octowy wywołana defektem mitochondrialnej
dehydrogenazy aldehydu octowego o niskiej KM (w porównaniu z enzymem
cytozolowym):
CH3CH2OH + NAD+ "! (enzym: dehydrogenaza alkoholowa) CH3CHO + H+ + NADH (forma
cytozolowa  o dużym KM).
CH3CHO + NAD+ (enzym: dehydrogenaza acetaldehydowa) CH3COO- + NADH + 2 H+ (forma
mitochondrialna  o małym KM).
Wartość K danego enzymu zależy od substratu (może być różna dla różnych substratów
M
danego enzymu) oraz warunków zewnętrznych (temp., pH, siła jonowa). Przedział KM: 10-1 
10-7 M
Wartość KM danego enzymu może być różna dla różnych substratów (Vmax pozostaje bez
zmian).
[E] wpływa na wartość Vmax ale nie na KM:
14
Określanie Vmax i KM przy użyciu wykresu odwrotności V0 i [S]:
Równanie L-B: 1/Vo = 1/Vmax + KM/Vmax * 1/[S]
Wykres odwrotności wartości V0 i [S] czyli wykres Lineweavera-Burka.
Nachylenie prostej: K /V
M max
Przecięcie osi Y: 1/Vmax
Przecięcie osi X = -1/KM
Znajomość Vmax i KM danego enzymu jest użyteczna dla wielu celów biochemicznych:
 oszacowania wewnątrzkomórkowych szybkości reakcji,
 określenia metabolicznych punktów kontrolnych,
 porównania izoenzymów z różnych tkanek i organów,
 określenia molekularnych mechanizmów katalizy enzymatycznej,
 określenia liczby obrotów,
 ilościowego porównania różnych substratów,
 określenia możliwości inhibitorów i aktywatorów.
Wykład 3  17.03.2009
15
Opóz
nienie (lag) lub przejściowe przyspieszenie (burst) reakcji  przyczyny:
1. Artefakt pomiaru.
2. Niewłaściwa kontrola temperatury pomiaru a T1 + b T2 = (a + b + T3) gdzie a, b 
objętości składników reakcji, T1, T2  temp. składników mieszaniny, T3  temp.
pomiaru.
3. Osadzanie nierozpuszczalnych elementów.
4. Wolna odpowiedz
detektora
5. Powolna dysocjacja od E odwracalnego inhibitora lub aktywatora.
6. Szybkość osiągania wartości stanu stacjonarnego przez [ES] i [EP].
7. Hamowanie lub aktywacja E przez duże [S].
8. Aktywacja przez P.
9. Wzajemne przekształcenia izoform S.
10. Efekty histeretyczne  zależność układu od wcześniejszego stanu (stanu preinkubacji
składników reakcji)
PROBLEMY PRAKTYCZNE
Ponieważ nie zawsze wszystkie S reakcji są w stężeniu wysycającym, prawdziwa KM i
prawdziwa Vmax różnią się na ogół od mierzonej KM i mierzonej Vmax.
[S ]
V =V
0 max
[ S ]�ąK
M
Przed doświadczeniem mającym na celu oznaczenie KM i Vmax danej reakcji należy ustalić
optymalne warunki reakcji tj. pH, temperaturę, siłę jonową, stężenie kationów (zwykle Mg2+ i
[K+] są istotne), itp.
Celem jest uzyskanie jak największej szybkości reakcji przy najmniejszym [E] wymaganym
do detekcji szybkości reakcji (pamiętając, że E musi być stabilny podczas całego czasu
pomiaru).
Znaczenie wartości K :
M
KM oznacza stężenie S, przy którym połowa miejsc aktywnych jest obsadzona, a więc stanowi
miarę [S] wymaganego do osiągnięcia znaczącej katalizy. Dla wielu enzymów K = stężeniu
M
substratu in vivo.
Ułamek miejsc obsadzonych przez S: (gdy znamy KM dla każdego S); fES = V/Vmax = [S] + KM
KM jest związany ze stałymi szybkości reakcji:
k : stała S ES
1
k-1: stała ES S
k2: stała ES E+P
16
k-1�ąk2
K =
M
k1
Gdy k-1 >> k2:
k-1
K =
M
k1
Stała dysocjacji kompleksu ES wynosi:
k-1
[ E ][ S ]
K = = =K
ES
[ ES ] k1 M
To K równa się stałej dysocjacji kompleksu ES i w tych warunkach określa siłę kompleksu ES,
M
tzn. mała KM oznacza silne wiązanie kompleksu ES i odwrotnie.
Znaczenie wartości V :
max
Vmax ujawnia liczbę obrotów enzymu czyli liczbę cząsteczek S przekształconych w P przez
cząsteczkę enzymu na jednostkę czasu, w warunkach pełnego wysycenia enzymu
substratem.
Vmax = k2[E]T
[E]T  stężenie miejsc aktywnych
k2 = kkat = liczba obrotów enzymu
V
max
k2=
[ E ]T
Przykład: anhydraza węglanowa  enzym o największej znanej liczbie obrotów.
10-6 M roztworu enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem katalizuje tworzenie
0,6 M H CO na sekundę.
2 3
A więc k2 = liczba obrotów = 0,6/10-6 [M/s/M] = 600000/s.
Stąd, cykl katalizy = 1/k2  1,7 źs.
Zwykle liczba obrotów enzymów in vivo wynosi 1-104/s.
Gdy enzym wysycony jest S, tzn. gdy [S] >> KM, to szybkość katalizy = k2 = kkat = liczbie
obrotów.
Zwykle jednak, w warunkach fizjologicznych:
[S]/Km = 0,01  1,0 stąd większość enzymów nie jest wysycona substratem,
[S] << KM i szybkość katalizy << kkat (liczby obrotów), gdyż większość miejsc aktywnych
enzymu nie jest zajęta.
17
W warunkach, gdy [S] << KM, kinetykę enzymu charakteryzuje wielkość kkat/KM, czyli szybkość
katalizy zależy od k /K .
kat M
Poprzez połączenie poprzednich równań otrzymamy:
V0 = k2[ES]; [ES] = [E][S]/ KM
daje:
k
kat
V = [ E][S ]
0
K
M
Gdy [S] << KM, to [E] = [E]T, stąd:
k
kat
V =śą źą
0
K
M [ E ][S ]
kkat/KM jest stałą szybkości oddziaływania S i E oraz miarą wydajności katalitycznej.
Porównując wartości kkat/KM możemy porównać preferencje enzymu do różnych substratów,
np. chymotrypsyna preferuje rozszczepianie wiązań peptydowych znajdujących się obok
rozbudowanych hydrofobowych łańcuchów bocznych
Ograniczenia wydajności enzymów czyli wartości k /K :
kat M
kkat kkat kkat
= = k1"ąk1
K śąk-1�ąkkatźą śąkkat�ąk-1źą
M
k1
Załóżmy, że kkat >> k-1, wtedy kkat/KM zbliża się do wartości k1, czyli szybkości tworzenia ES. Tak
więc górna granica kkat/KM narzucona jest przez k1.
Stąd szybkość tworzenia ES nie może być większa niż kontrolowana przez dyfuzję szybkość
(częstotliwość), z jaką spotykają się S i E.
Dyfuzja ogranicza k , stąd k nie może być większa niż 108-109/s/M. co stanowi też górną
1 1
granicę kkat/KM.
Enzymy, które osiągnęły perfekcję kinetyczną, to enzymy, dla których stosunek kkat/KM jest
bliski kontrolowanej przez dyfuzję szybkości spotykania się enzymów z substratami (czyli
wynosi 108-109/s/M).
18
Szybkość katalityczna tych enzymów ograniczona jest wyłącznie szybkością ich spotykania się
z substratami w roztworze. Dla nich dalszy wzrost kkat można uzyskać tylko przez skrócenie
czasu potrzebnego do dyfuzji.
Tutaj każde spotkanie E z S jest produktywne, stąd mogą istnieć siły elektrostatyczne
ściągające S do miejsca aktywnego  efekt Kirke, tak by skrócić czas potrzebny na dyfuzję S
do E.
Enzym kkat/KM [/s/M]
Esteraza acetylocholinowa 1,6 x 108
Anhydraza węglanowa 8,3 x 107
Katalaza 4 x 107
Krotonaza 2,8 x 108
Fumaraza 1,6 x 108
Izomeraza triozofosforanowa 2,4 x 108
�-laktamaza 108
Dysmutaza ponadtlenkowa 7 x 109
Ograniczenie narzucone przez szybkość dyfuzji w roztworze może być częściowo pokonane
przez:
 siły elektrostatyczne przyciągające S do miejsca aktywnego,
 uwięzienie substratów i produktów w ograniczonej objętości kompleksu
wieloenzymatycznego.
Reakcje wielosubstratowe.
Większość reakcji biologicznych zawiera 2 substraty i 2 produkty: A + B "! P + Q
W większości przypadków dochodzi w nich do przeniesienia grupy funkcyjnej (np.
fosforanowej czy amonowej) lub elektronów (reakcje redoks) między substratami.
Reakcje wielosubstratowe (dwusubstratowe) dzielimy na 2 klasy:
1. Reakcje przeniesienia sekwencyjnego:
W reakcji dwusubstratowej tworzy się trójskładnikowy przejściowy kompleks: E-S-S i E=P=P
W mechanizmie sekwencyjnym wszystkie SS muszą związać się z E przed uwolnieniem P.
Wyróżniamy:
- uporządkowany mechanizm sekwencyjny (substraty wiążą się z E w określonej sekwencji,
takie reakcje zwykle opisujemy diagramem Clelanda),
- przypadkowy mechanizm sekwencyjny (sekwencja łączenia substratów i uwalniania
produktów jest przypadkowa  np. reakcja kinazy keratynowej).
19
W diagramie Clelanda pojawiają się wielokąty z możliwymi wariantami.
2. Reakcje podwójnego przeniesienia (reakcje ping-pong).
Jeden lub więcej P jest uwalnianych przed związaniem wszystkich substratów. Istnieje
pośrednia forma enzymu z podstawioną grupą  forma, w której enzym jest czasowo
zmodyfikowany. Nie tworzy się trójskładnikowy przejściowy kompleks ESS, np. reakcja
aminotransferazy asparaginowej  reakcja przeniesienia grupy aminowej między
aminokwasem i ketokwasem: asparaginian + ą-ketoglutaran "! glutaminian +
szczawiooctan.
Analiza kinetyki stanu stacjonarnego (steady-state) dla reakcji dwusubstratowej pozwala
rozróżnić reakcje przeniesienia sekwencyjnego oraz reakcje przeniesienia podwójnego.
Hamowanie aktywności enzymów.
Hamowanie aktywności enzymów przez małe cząsteczki lub jony jest głównym
mechanizmem kontroli.
Inhibitory są narzędziem badawczym w badaniu mechanizmu działania enzymów. Działanie
wielu leków i toksyn opiera się na inhibicji enzymów.
Wyróżniamy:
1. Inhibicję nieodwracalną (I (inhibitor) wiąże się kowalencyjnie lub bardzo silnie z E)
Np. penicylina kowalencyjnie modyfikuje bakteryjną transpeptydazę, co zapobiega
syntezie ścian komórkowych i prowadzi do śmierci bakterii,
Np. aspiryna kowalencyjnie modyfikuje cytooksygenazę co zmniejsza syntezę
cząsteczek sygnałowych stanu zapalnego.
20
2. Inhibicję odwracalną (szybka dysocjacja kompleksu EI)
 inhibicję kompetycyjną
 inhibicję niekompetycyjną
Rozróżnienie między inhibitorem kompetycyjnym, akompetycyjnym i niekompetycyjnym.
Inhibitor kompetycyjny wiąże się do miejsca aktywnego E, zapobiegając wiązaniu substratu z
enzymem.
Inhibitor akompetycyjny  wiąże się jedynie do kompleksu ES. Miejsce wiązania tego I jest
tworzone tylko podczas oddziaływania E i S. Inhibicji tej nie można przezwyciężyć podając
więcej S.
Inhibitor niekompetycyjny wiąże się do innego miejsca niż miejsce aktywne, nie zapobiega
wiązaniu substratu.
Inhibicja kompetycyjna.
I kompetencyjny zmniejsza szybkość katalizy przez zmniejszenie liczby cząsteczek enzymu
wiążących substrat.
Przy danym [I], inhibicja może być zmniejszona przez zwiększenie [S].
Przykłady:
 bursztynian (S) i malonian (I), enzym: dehydrogenaza bursztynianowi,
 kofaktor tetrahydrofolian (koenzym) i jego analog strukturalny metotreksat (I) 
enzym: reduktaza dihydrofolianu. Metotreksat wiąże się 100x silniej do reduktazy niż
naturalny S (koenzym),
 ibuprofen (lek)  inhibitor enzymów uczestniczących w szlakach sygnalizacji stanu
zapalnego,
 statyny (leki obniżające wysoki poziom cholesterolu)  inhibitory kluczowego enzymu
biosyntezy cholesterolu).
Inhibicja niekompetycyjna.
I niekompetycyjny zmniejsza liczbę obrotów enzymu; nie wpływa na zmniejszenie liczby
cząsteczek E wiążących S. Inhibicji niekompetycyjnej nie można przezwyciężyć podając
większe stężenie S.
Inhibicja mieszana  I wpływa jednocześnie na wiązanie S i na liczbę obrotów E, wiążą się
poza miejscem wiązania S do E lub ES.
Kinetyczne rozróżnienie inhibicji kompetycyjnej i niekompetycyjnej.
Inhibicja kompetycyjna:
21
[ E ][ I ]
Ki=
 stała dysocjacji kompleksu EI (I  inhibitor kompetycyjny).
[ EI ]
Im mniejsza Ki, tym inhibicja jest skuteczniejsza.
Gdy stężenie I kompetycyjnego wzrasta, wyższe [S] są wymagane dla osiągnięcia danej
szybkości reakcji.
Przebieg reakcji sugeruje, w jaki sposób wystarczająco wysokie [S] może całkowicie
przezwyciężyć inhibicję kom petycyjną.
Pozorna wartość KM (pozorna stała Michaelisa) ulega zmianie i równa się ilościowo:
1�ą[I ]
app
K =K
M M
Ki
Im większe [I] tym większa KMapp.
Enzym ma taką samą V +/- I kompetycyjny.
max
Efektem działania I kompetycyjnego jest zwiększenie KMapp, a więc [S] potrzebnego do
uzyskania danej szybkości.
Wykres szybkości reakcji od ilości substratu (Michaelisa):
Wykres Lineweavera-Burka dla inhibicji kompetycyjnej: I kompetycyjny nie zmienia V , ale
max
zwiększa KM.
Równanie LB:
K
1 1 1
M
= �ąśą źąśą źą
V V V [S ]
0 max max
22
Równanie LB przy inhibicji kompetycyjnej:
K
[ I ]
1 1 1
M
= �ąśą źąśą1�ą źąśą źą
V V V K [S ]
0 max max i
E+I "! EI
[ E ][ I ]
Ki=
[ EI ]
[ I ]
śą1�ą źą
W obecności I kompetycyjnego nachylenie wykresu rośnie o czynnik
Ki , który mówi
nam o sile wiązania I.
[ I ]
śą1�ą źą
Ki = ą
Przykład: Mamy E o K = 10-4 M czyli V = V /2 gdy S = 10-4 M.
M 0 max
W obecności 2 x 10-3 M I kompetycyjnego, dla którego Ki = 10-3 M, wartość KMapp = KM
[ I ]
śą1�ą źą
Ki = 3 x 104 M
[S ]
V =V
Pamiętając, że
 równanie MM, gdy [S] = 10-4 M, V0 = Vmax/4, a więc
0 max
[ S ]�ąK
M
obecność I kompetycyjnego o połowę obniża szybkość reakcji przy takim stężeniu substratu.
Inhibicja akompetycyjna.
Inhibitor akompetycyjny  wiąże się jedynie do kompleksu ES. Miejsce wiązania tego I jest
tworzone tylko podczas oddziaływania E i S. Inhibicji tej nie można przezwyciężyć podając
więcej S.
app
I akompetycyjny obniża K , która maleje wraz ze zwiększaniem [I] (enzym wiąże się do ES
M
zmniejszając [ES] stąd więcej S wiąże się do E aby utrzymać równowagę między E i ES).
23
Vmax nie może być osiągnięta.
Przykład: herbicyd glikofosforan  I akompetycyjny szlaku biosyntezy aminokwasów
aromatycznych.
Wykres Lineweavera-Burka dla inhibicji akompetycyjnej.
[ I ]
śą1�ą źą
I akompetycyjny obniża KMapp p i Vmaxapp o ten sam faktor
Ki .
W obecności I akompetycyjnego nachylenie wykresu nie zmienia się, a punkt przecięcia osi Y
[ I ]
śą1�ą źą
rośnie o faktor
Ki .
Linie są równoległe.
Wykład 4  24.03.2009
24
Inhibicja niekompetycyjna.
Przebieg reakcji pokazuje, że S wiąże się zarówno do wolnego E jak i kompleksu EI. S może
wiązać się do EI ale kompleks EIS nie tworzy produktu. Vmax nie może być osiągnięta, nawet
przy wysokim [S].
I niekompetycyjny obniża stężenie funkcjonalnego enzymu, stąd:
Vmax jest obniżana do nowej wartości tzw. pozornej szybkości maksymalnej Vmaxapp, podczas
gdy KM pozostaje niezmieniona.
V
app max
V =
max
1�ą[ I ]
K
i
Inhibicji tej nie można przezwyciężyć podając więcej S.
Wykres Lineweavera-Burka dla inhibicji niekompetycyjnej:
[ I ]
śą1�ą źą
I niekompetycyjny nie zmienia KM, ale zmniejsza Vmax o czynnik
Ki .
25
W obecności I niekompetycyjnego nachylenie wykresu Vmaxapp/ KM rośnie o czynnik
[ I ]
śą1�ą źą
Ki . Ki dla kompleksu EI oraz EIS są takie same.
[ I ]
śą1�ą źą
ą = 1 +
Ki
Przykład: deoksycyklina (antybiotyk)  inhibitor kolagenozy (enzym proteolityczny). Lek
stosuje się przy leczeniu chorób przyzębia.
Ołów  inhibitor wielu enzymów z grupami sulfhydrylowymi.
Inhibicja mieszana  I wpływa jednocześnie na wiązanie S i na liczbę obrotów E, wiążąc się
poza miejscem wiązania S do E lub ES.
Równanie i wykres LB:
KM 1 ą'
1
=śą źąśą źą�ą
V V [S ] V
0 max max
[ I ]
ą=1�ą
Ki
Vmax jest obniżana do nowej wartości  tzw. pozornej szybkości maksymalnej Vmaxapp. KM
rośnie do nowej wartości, pozornej KM. Aktywność enzymu zależy od pH. Zwykle optymalne
warunki pH odpowiadają warunkom, w których enzym funkcjonuje.
Wykorzystanie inhibitorów nieodwracalnych do identyfikacji (mapowania) grup miejsca
aktywnego enzymu.
Krystalografia rentgenowska pozwala na identyfikację grup funkcyjnych E po
zmodyfikowaniu ich przez inhibitor nieodwracalny.
Trzy kategorie inhibitorów nieodwracalnych:
26
1. Związki reagujące ze specyficznymi grupami
2. Analogi substratów
3. Inhibitory wywołujące  samobójstwo enzymu .
Ad. 1.  np. DIPF i amid kwasu jodooctowego.
I nieodwracalny, diizopropylofluorofosforan (DIPF), hamuje enzymy (esterazę
acetylocholinową oraz chymotrypsynę) poprzez kowalencyjne modyfikowanie kluczowej
reszty seryny.
Amid kwasu jodooctowego hamuje nieodwracalne enzymy reagując z kluczową resztą
cysteiny.
Ad. 2. (affinity labels)
Są to cząsteczki strukturalnie podobne do S, które kowalencyjnie modyfikują reszty w
miejscu aktywnym E. Są bardziej specyficzne w stosunku do miejsca aktywnego od związków
reagujących ze specyficznymi grupami.
Keton chlorometylowy tosylo-L-fenyloalaniny (TPCK) jest aktywnym analogiem normalnego
substratu chymotrypsyny. TPCK wiąże się do miejsca aktywnego chymotrypsyny i modyfikuje
istotną resztę histydyny.
Ad. 3. (suicide inhibitors) czyli inhibitory wpływające na mechanizm reakcji (mechanism-
based inhibitors)
Najbardziej specyficzne narzędzie do modyfikacji miejsca aktywnego E.
I wiąże się do E (jak substrat), początkowo dochodzi do normalnej katalizy. Tworzy się
aktywny chemicznie intermediat, który hamuje E poprzez modyfikację kowalencyjną.
Zmodyfikowana grupa E jest katalitycznie aktywna, stąd E uczestniczy we własnej
nieodwracalnej inhibicji.
Inhibitory wpływające na mechanizm reakcji (inhibicja wywołująca samobójstwo enzymu):
Oksydaza monoaminowa (MAO), enzym ważny w syntezie neurotransmiterów, wymaga
obecności ko faktora FAD. Inhibitor, N,N-dimetylopropargiloamina hamuje MAO poprzez
kowalencyjne zmodyfikowanie FAD. Inhibitor jest najpierw utleniony, po czym na drodze
alkilacji N5 kowalencyjnie modyfikuje FAD. Addukt N-5 flawiny jest stabilizowany poprzez
dodanie protonu.
Inhibicja przez analogi stanu przejściowego pozwoliła zajrzeć w głąb katalizy.
Inhibitory potwierdzają, że istotą katalizy jest selektywne wiązanie stanu przejściowego, o
czym świadczy siła, z jaką te analogi stanu przejściowego działają jako inhibitory.
Przykład: 2-karboksypirol (I będący analogiem stanu przejściowego reakcji racemazy
prolinowej) wiąże się z tym E 160 razy silniej niż prolina  naturalny S  izomeryzacja L-
proliny do D-proliny prowadzona przez racemazę proliny, enzym bakteryjny, przechodzi
27
przez etap planarnego stanu przejściowego (występującego w jednej płaszczyz
nie, w którym
węgiel ą jest trygonalny, a nie tetragonalny).
Przeciwciała rozpoznające stan przejściowy działają jak katalizatory (abzymy). Pozwoliły
zrozumieć znaczenie stanu przejściowego.
Przykład: przeciwciało wyprodukowane używając inhibitora ferrochelatazy (n-
metyloprotoporfirynę), będącego strukturalnym analogiem stanu przejściowego
przeprowadzanej przez ten enzym reakcji, katalizowało reakcję tylko 10 x wolniej od E, a
2500 x szybciej w stosunku do reakcji nie katalizowanej.
Użycie analogu stanu przejściowego do wytworzenia przeciwciał katalitycznych.
Znaczenie analogów stanu przejściowego:
 pozwalają na wgląd w mechanizm katalizy,
 mogą służyć jako silne i specyficzne inhibitory enzymów,
 mogą być użyte jako immunogenny do wytworzenia wielu nowych katalizatorów.
4 podstawowe sposoby regulacji enzymów:
1. Kontrola allosteryczna.
Aktywność enzymów allosteryczych ulega zmianie w odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe
(aktywatory czy inhibitory allosteryczne) lub informację przekazywaną między miejscami
aktywnymi.
2. Wielorakość form enzymów.
Izozymy lub izoenzymy umożliwiają zróżnicowaną regulację tej samej reakcji w różnym
miejscu i czasie. Izozymy to homologiczne enzymy w danym organizmie, które katalizują tę
samą reakcję ale różnią się nieznacznie strukturą i wartościami KM i Vmax oraz właściwościami
regulacyjnymi. Izoenzymy ulegają specyficznej ekspresji w różnych tkankach lub organellach
lub w różnych stadiach rozwojowych.
3. Odwracalna modyfikacja kowalencyjna
Zmiana aktywności enzymu przez odwracalne dodanie grupy modyfikującej, najczęściej
grupy fosforanowej.
4. Aktywacja proteolityczna
Nieodwracalne przekształcenie enzymu nieaktywnego w aktywny. Następuje hydroliza
jednego lub kilku wiązań peptydowych w nieaktywnym prekursorze enzymu  zymogenie czy
proenzymie (przykład: enzymy trawienne, kaspazy, enzymy procesu krzepnięcia krwi).
Kinetyka enzymów allosterycznych jest niezgodna z kinetyką Michaelisa-Menten.
Enzymy allosteryczne wykazują sigmoidalną zależność szybkości reakcji od stężenia
substratu.
28
Enzymy te składają się z kilku podjednostek i kilku miejsc aktywnych.
Związanie S do jednego miejsca aktywnego może zmienić właściwości innych miejsc
aktywnych w danej cząsteczce enzymu. Rezultatem jest kooperatywność wiązania substratu,
czyli wiązanie S do jednego miejsca aktywnego ułatwia wiązanie S do innych miejsc
aktywnych.
Aktywność tych enzymów może być zmieniana przez cząsteczki regulatorowe, które wiążą
się do specyficznych miejsc, innych niż miejsca katalityczne. Enzymy te są kluczowymi
regulatorami szlaków metabolicznych w komórce, gdyż ich właściwości katalityczne
zmieniają się w zależności od potrzeb komórki.
Karbamoilotransferaza asparaginowa (ATCaza) jest hamowana allosterycznie przez produkt
końcowy szlaku biosyntezy pirymidyn.
Reakcja ATCazy  w syntezie pirymidyn ATCaza katalizuje pierwszy etap, polegający na
kondensacji asparaginianu i karbamoilofosforanu do N-karbamoiloasparaginianu.
Hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego czyli przez produkt końcowy.
CTP hamuje ATCazę. Trifosforan cytydyny, końcowy produkt szlaku syntezy pirymidyn,
hamuje ATCazę pomimo niewielkiego podobieństwa strukturalnego do reaktantów lub
produktów reakcji katalizowanej przez ten enzym.
CTP wiąże się do miejsca allosterycznego (regulatorowego) i jest przykładem inhibitora
allosterycznego.
29
ATCaza składa się z odrębnych podjednostek katalitycznych i regulatorowych, które można
rozdzielić stosując związki rtęciowe reagujące z grupami tiolowymi.
p-hydroksyrtęciobenzoesan oddziałuje z kluczowymi resztami cysteiny w ATCazie,
powodując dysocjację ATCazy na dwa rodzaje podjednostek.
Badania ATCazy wykorzystujące metodę ultra irowania.
[wykresy]
Wzorce szybkości sedymentacji (A) natywnej ATCazy i (B) enzymu poddanego działaniu p-
hydroksyrtęciobenzoesanu wskazują, że enzym może ulec dysocjacji na dwa typy
podjednostek.
ATCaza: 2x(3x34kDa)+3x(2x17kDa).
Duże zmiany w strukturze IV-rzędowej pośredniczą w oddziaływaniach allosterycznych w
ATCazie.
Struktura IV-rzędowa ATCazy widziana z góry (rysunek). Widoczna jest pojedyncza cząsteczka
katalityczna tj. pojedynczy trimer (łańcuchy katalityczne (C) oznaczono kolorem niebieskim);
drugi trimer jest przyłączony za widocznym.
c- katalityczne
r- regulatorowe.
Lokalizacja miejsca aktywnego ATCazy krystalizacja enzymu w obecności analogu pary
substratów (czyli analogu produktu pośredniego reakcji)  PALA  inhibitora
kompetycyjnego.
Miejsce aktywne ATCazy znajduje się w rejonie kontaktu między parami łańcuchów c w
obrębie trimeru c.
Miejsce aktywne składa się głównie z reszt należących do jednego łańcucha, ale łańcuch
sąsiedni także dostarcza ważne reszty.
30
Ponieważ miejsca aktywne znajdują się w miejscach kontaktu 2 łańcuchów c, każdy trimer c
dostarcza 3 miejsca aktywne. W sumie ATCaza ma 6 miejsc aktywnych.
N-fosfonoacetylo-L-asparaginian (PALA) jest analogiem produktu pośredniego reakcji i silnym
inhibitorem kompetycyjnym ATCazy.
Zmiany w strukturze IV-rzędowej w ATCazie (w miejscu aktywnym) wywołane związaniem
PALA  uwidocznienie dwóch stanów konformacyjnych (struktur IV-rzędowych). Dwa trimery
c rozsuwają się na odległość 1,2 nm i obracają się o ok. 10 stopni. Trzy dimery r obracają się
o 15 stopni.
Przejście z formy T do R w ATCazie. ATCaza istnieje w 2 stanach konformacyjnych:
- w zwartej stosunkowo nieaktywnej formie nazywanej formą T (ang. tense  napięta)
dominującej w nieobecności S ( o małym powinowactwie do S)
- rozszerzonej (rozsuniętej) formie nazywanej R (ang. relaxed  rozluz
niona) dominującej w
obecności S ( o dużym powinowactwie do S).
Związanie PALA (inhibitora kompetycyjnego) stabilizuje formę R.
Forma T ma niższe powinowactwo względem S (SS) i stąd niższa aktywność katalityczna od
formy R.
W obecności jakiegoś stałego [S] lub [SS] enzym znajduje się w stanie równowagi między
formą T i R.
Osiągnięcie równowagi zależy od liczby miejsc aktywnych zajmowanych przez S.
CTP (jako inhibitor allosteryczny) wiąże się do podjednostek regulatorowych (6) ACTazy,
oddalonych od miejsc aktywnych (6).
Wiązanie CTP (inhibitora allosterycznego) z podjednostkami regulatorowymi ATCazy
stabilizuje formę T, przez co aktywność enzymu spada czyli zmniejsza się szybkość tworzenia
P (karbamoilofosforanu).
2c2+3r2 -> c6r6
Jednoprzejściowy mechanizm regulacji allosterycznej  cały E jest przekształcony z jednej
formy w drugą i wszystkie miejsca aktywne podlegają tym samym oddziaływaniom (zmiana
typu  wszystko albo nic )
Forma R i forma T są w równowadze. Nawet przy braku S lub regulatora, ATCaza znajduje się
w stanie równowagi między formą T i R. Przy braku S, równowaga jest przesunięta w
kierunku form T, która występuje ok. 200x częściej.
Związanie I allosterycznego (CTP) przesuwa równowagę w kierunku formy T, co prowadzi do
zmniejszenia aktywności katalitycznej. Taki mechanizm regulacji allosterycznej nazywamy
mechanizmem jednoprzejściowym, tzn. cały enzym (wszystkie miejsca aktywne)
przekształcany jest w jedną formę (R lub T).
31
ATCaza wykazuje kinetykę sigmoidalną. Wykres zależności tworzenia produktu jako funkcji
[S] ma postać krzywej sigmoidalnej, ponieważ wiązanie substratu z jednym miejscem
aktywnym sprzyja przejściu całego enzymu w formę R, co zwiększa aktywność pozostałych 5
miejsc aktywnych, prowadząc do wzrostu całkowitej aktywności. Zatem miejsca aktywne
wykazują kooperatywność. A
ańcuchy tworzące podjednostki współpracują ze sobą: gdy
jeden zmienia konformację, robią to wszystkie.
Krzywa sigmoidalna jest sumą dwóch krzywych M-M, z których jedna odpowiada formie T, a
druga formie R. Wzrost [S] faworyzuje przejście z krzywej formy T do krzywej formy R.
Otrzymanie krzywej sigmoidalnej w wyniku kooperatywności można zrozumieć wyobrażając
sobie enzym allosteryczny jako mieszaninę 2 enzymów typu M-M, z których jeden wykazuje
dużą wartość KM, co odpowiada formie T, a drugi  małą wartość KM, co odpowiada formie R.
W miarę wzrostu [S], równowaga przesuwa się z formy T w kierunku formy R, co prowadzi do
ostrego wzrostu aktywności, zależnego od [S].
Wyizolowany trimer c charakteryzuje się parametrami kinetycznymi formy R.
W przypadku ATCazy, w formie T, 3 trimery r utrzymują 3 trimery c wystarczająco blisko
siebie, aby kluczowe pętle na ich powierzchni zderzały się i przeszkadzały dostosowaniom
strukturalnym niezbędnym dla wiązania S z wysokim powinowactwem i dla katalizy.
Regulacje allosteryczne modulują stan równowagi między formami T i R.
Wpływ CTP na kinetyką ATCazy: CTP stabilizuje formę T ATCazy, sprawiając, że wiązanie S
jest utrudnione, co uniemożliwia przekształcenie enzymu w formę R. wskutek tego krzywa
ulega przesunięciu w prawo.
Wykład 5  07.04.2009
Zastosowanie abzymów:
1. Rozkładanie kokainy do nietoksycznych związków.
2. ADAPT  antibody-directed abzyme prodrug therapy.
32
3. Terapia raka  aldolaza.
4. Odporność na herbicydy.
5. Sepsa.
6. AIDS.
Uwagi końcowe: prof. Jeremy Lee, 1999:
1. Skuteczny abzym powinien przekształcać ok. 100 cząsteczek substratu na sekundę.
2. Otrzymanie skutecznego abzymu zajęło nam 10 lat.
3. Wprowadzenie skutecznego abzymu do użycia w medycynie zajmie 5-10 lat, ale
abzym umożliwiający usunięcie toksyn z ziaren roślin uprawnych zostanie
wprowadzony do użycia prawdopodobnie szybciej.
Kataliza w środowisku niewodnym.
Istnieją enzymy, których substraty są nierozpuszczalne w wodzie. W komórce znacząca
frakcja enzymów jest związana z błonami lub działa w lokalnych hydrofobowych
przedziałach.
Kataliza w środowisku niewodnym powinna być czymś naturalnym, szczególnie dla enzymów
innych niż hydrolazy.
Hydroliza jest także możliwa przy ograniczonej zawartości wody. Wraz z eliminacją wody
maleje szybkość reakcji.
To, co się dzieje z reakcjami hydrolizy przy malejącej zawartości wody ma duże znaczenie
praktyczne. Poprzez manipulowanie zawartością wody można kontrolować kierunek
przebiegu reakcji (oddziaływanie na stałą równowagi). Klasyczny przykład: lipazy.
Korzyści wynikające z katalizy w środowisku niewodnym:
 zwiększona rozpuszczalność substratów niepolarnych,
 zmiana specyficzności substratowej i stereospecyficzności (zależnie od użytego
rozpuszczalnika),
 kontrola kierunku przebiegu reakcji czyli zmiana równowagi termodynamicznej.
Eliminacja wody umożliwia nie tylko odwrócenie reakcji, ale umożliwia także
biotransformacje, które w innych warunkach są niemożliwe.
O czym należy pamiętać manipulując zawartością wody?
Zmniejszanie zawartości wody w środowisku reakcji wymaga na nowo ustalenia danych
dotyczących stabilności enzymu i jego oddziaływania z substratem.
Możliwości wykorzystania katalizy w środowisku niewodnym:
 Farmacja - preparaty immunologiczne (oligosacharydy, glikolizacja makrocząsteczek),
 Detergenty (glikozydy wyższych alkoholi),
 Chemia zapachów (glikozydy niektórych kwasów hydroksykarboksylowych),
 Przemysł spożywczy (glikolipidy).
33
Możliwość kontrolowania kierunku reakcji katalizowanych przez enzymy oraz ich
specyficzności w środowisku niewodnym spowodowała rozwój tzw. inżynierii
rozpuszczalnikowej (nazywanej też szerzej  inżynierią środowiska reakcji , z ang. medium
engineering), która dostarcza alternatywnych rozwiązań dla inżynierii białkowej.
Biokatalityczne plastiki  enzymy zmodyfikowane w kierunku zwiększenia rozpuszczalności
w rozpuszczalniku organicznym mogą być włączane w różnego rodzaju polimery, a uzyskane
w tej sposób struktury nazywane biokatalitycznymi plastikami, są aktywne i stabilne zarówno
w środowisku wodnym jak i rozpuszczalnika organicznego.
Jako enzym modelowy przy konstrukcji biokatalitycznych plastików stosuje się
chymotrypsynę. Jest aktywna w środowisku wodnym, jak i rozpuszczalnika organicznego. Jak
wiele proteaz obok wiązań peptydowych hydrolizuje również wiązania estrowe. Hydroliza
wiązań estrowych nie ma prawdopodobnie większego znaczenia fizjologicznego, służy jednak
jako reakcja modelowa (porównanie z enzymami syntetycznymi).
Enzymy syntetyczne  cząsteczka z hydrofobową kieszenią zawierającą odpowiednio
ułożone grupy funkcyjne, umożliwiające przekształcenie słabo wiązanego substratu, poprzez
silnie wiązany stan przejściowy, w produkt. Cząsteczka odpowiednio duża i podatna na
zmiany strukturalne.
Wykorzystanie: reakcje nie podlegające w naturze katalizie enzymatycznej. Konkurenci:
DNAzymy, ekstremozymy, kataliza w środowisku niewodnym.
Związki wykorzystywane do otrzymywania enzymów syntetycznych:
 polimery syntetyczne (peptydy i poliaminokwasy, pochodne polietylenoiminy (bo
sama nie jest enzymem), polimery winylowe, polimydła),
 związki makrocykliczne (paracyklofany, cyklodekstryny  przemysł farmaceutyczny i
spożywczy, do maskowania nieprzyjemnych smaków i zapachów, stabilizacji
substancji lotnych).
Triada katalityczna: 3 aminokwasy  asparaginian, histydyna, seryna.
Ustalenia końcowe: obecnie większy nacisk kładzie się na wybór substratu niż na konstrukcję
enzymu.
Ekstremozymy  narzędzia przetrwania organizmu w warunkach ekstremalnych.
Enzymy ekstremofili (ekstremozymy) zachowują aktywność w warunkach ekstremalnych:
Znaczenia:
 zastosowania praktyczne,
 korekta drzewa ewolucyjnego,
 poznanie relacji struktura-właściwości.
34
Główne ośrodki badań: USA, Japonia, Niemcy.
Definicja warunków ekstremalnych:
 pH - < pH 3 lub > pH 9,
 temperatura - < 10p C lub > 45p C
 zasolenie - > 15 % (w/v) NaCl,
 rozpuszczalniki organiczne  np. > 1 % toluen,
 jony metali ciężkich  np. > źM Hg lub Cd,
 ciśnienie - > 50 MPa (50 atm)
 UV - ?
 X - ?
Poznane organizmy najbardziej ekstremotermofilne mogą żyć w 121p C.
Otrzymywanie ekstremozymów:
A. Od białka do genu
 hodowla komórek z interesującego środowiska,
 ekstrakcja białek,
 poszukiwanie danej aktywności,
 izolacja enzymu i genu,
 klonowanie.
B. Od genu do białka
 izolacja DNA organizmów z danego środowiska,
 restrykcja DNA i transformacja bakterii,
 selekcja transformantów w poszukiwaniu danej aktywności.
Modyfikacje ekstremozymów:
 racjonalne planowanie: poznanie strukturalnych podstaw, właściwości i
wprowadzenie odpowiednich zmian w genie,
 strategia Edisona: mutageneza i selekcja mutantów,
 mieszanie szczepów: bakterii ewoluują raczej przez wymianę genów
(polichloropochodne difenylu).
Molekularne przystosowania enzymów z psychrofili:
 enzymy te wykazują szczególnie wysoką wartość K /KM, czyli skuteczność
kat
katalityczną, co kompensuje zwolnione tempo przebiegu reakcji chemicznych w
niskiej temperaturze (perfekcja katalityczna),
 optymalizacja parametrów katalitycznych wynika prawdopodobnie z faktu, iż
struktura tych białek jest niesamowicie giętka i w trakcie katalizy dochodzi do
częstych zmian konformacyjnych.
Istnieje wiele sposobów praktycznego wykorzystania enzymów.
35
Detergenty:
Klasyfikacja detergentów zawierających enzymy:
 proszki do prania,
 płyny do mycia naczyń,
 detergenty przemysłowe i instytucjonalne.
Krótka historia enzymatycznych proszków do prania:
1913: pierwszy enzymatyczny detergent (Burnus  wyciąg z trzustki)
1960-1970  wprowadzenie proteazy bakteryjnej, zmiana formy enzymów (proszek w
granulat),
1980-1990  wprowadzenie lipaz i celulaz, detergenty w postaci płynu,
~2000  proszki  compact
Enzymy stosowane obecnie w proszkach do prania:
1. Proteazy
 proteazy serynowe z rodzaju Bacillus  usuwają plamy pochodzenia białkowego.
2. Amylazy
 ą-amylazy z rodzaju Bacillus  usuwają plamy pochodzenia skrobiowego.
3. Lipazy
 Aspergillus oryzae (GMO)  Humicola lanuginosa lub wyciąg z trzustki  usuwają
plamy pochodzenia tłuszczowego.
4. Celulazy
 neutralne (Humicola insolens) i alkaliczne (Bacillus sp.)
 usuwają mikrofibryle, a razem z nimi brud,
 powodują wzmocnienie koloru i zwiększenie miękkości tkaniny.
Badanie skuteczności działania enzymu w proszku do prania  parametry:
 postać,
 stosowana dawka proszku i jego skład,
 pH roztworu proszku,
 siła jonowa,
 temperatura prania,
 czas prania,
 siły mechaniczne,
 twardość wody,
 poziom zabrudzenia,
 rodzaj tkaniny.
Biosensory enzymatyczne.
Klasyczny przykład biosensora enzymatycznego: biosensor glukozowy (glukoza + O2 kwas
glukonowy + H2O2).
36
Rozwiązania techniczne stosowane w biosensorach enzymatycznych:
 enzym immobilizowany między błoną zewnętrzną i wewnętrzną, produkt reakcji
wykrywany przez elektrodę,
 bufor zawierający enzym oraz substrat są wstrzykiwane do komory zawierająej
elektrodę,
 enzym immobilizowany na powierzchni elektrody,
 enzym jest bezpośrednio sprzężony z elektrodą.
Porównanie biosensorów enzymatycznych i mikrobiologicznych.
Biosensory mikrobiologiczne:
 mniejsza podatność na hamowanie,
 większa tolerancja na pH,
 dłuższa możliwość działania,
 tańsze (brak konieczności izolacji i oczyszczania enzymu),
 dłuższy czas odpowiedzi na sygnał,
 dłuższy czas powrotu do stanu wyjściowego,
 konieczność zapewnienia selektywności reakcji.
Typy biosensorów mikrobiologicznych:
1. mierzące aktywność oddechową,
2. mierzące obecność elektrochemicznie aktywnych metabolitów,
3. wykorzystujące zjawisko luminescencji.
Przykłady substancji wykrywanych przez biosensory mikrobiologiczne:
 DNA,
 etanol,
 glukoza,
 aminokwasy  prolina, asparaginian, glutaminian, cysteina, fenyloalanina,
 mocznik.
Istotną dziedziną zastosowania biosensorów jest detekcja organizmów patogennych, np.
system GeneXpert (firmy Cepheid) przyspiesza PCR i umożliwia detekcję bakterii wąglika.
Diagnostyka
Zastosowanie enzymów diagnostycznych:
1. Produkcja żywności  testy bezpieczeństwa,
2. Medycyna  analiza jakościowa i ilościowa, paski testowe,
Terapia
Możliwości terapeutycznego wykorzystania enzymów w terapii raka:
37
1. Zahamowanie ekspresji pewnych białek na poziomie mRNA  rybozymy i
deoksyrybozymy,
2. Enzymatyczna aktywacja czynnika terapeutycznego  enzymy białkowe.
Nanociała: nowe podejście w wykorzystaniu przeciwciał.
ADEPT a nanociała:
 u dromaderów, ale także u dwugarbnych azjatyckich wielbłądów i
południowoamerykańskich lam około 50% Ab krążących we krwi nie ma łańcuchów
lekkich,
 nanociała to przeciwciała pozbawione łańcuchów lekkich, skrócone do rejonów
zmiennych,
 podstawowa charakterystyka nanociał: silne powinowactwo do antygenów, duża
sprawność molekularna, odporność na temperaturę i pH, mogą być kodowane przez
pojedynczy gen i produkowane przez mikroorganizmy (ok. 1 g z 1 l hodowli drożdży),
 włączenie w ADEPT  przed fazą badań klinicznych
GDEPT: kontrolowana genetycznie enzymatyczna terapia nowotworów:
 ekspresja enzymu i jego aktywność ograniczona tylko do komórek nowotworowych,
 nie powinien istnieć jego endogenny analog,
 zastosowany enzym nie może być toksyczny,
 powinien wystąpić efekt widza (działanie na okoliczne komórki wskutek działania
enzymu w jednej komórce).
Lokalizacja enzymu ma podstawowe znaczenie dla aktywacji czynnika terapeutycznego.
Wiele leków działa jako inhibitory enzymów.
38