Metody barwienia i różnicowania komórek
" Barwienie preparatów mikroskopowych:
" Barwienie preparatów hematologicznych
" Barwienie preparatów mikrobiologicznych
" Immunohistochemia
Metody barwienia i różnicowania komórek
" Barwienie komórek
organelle znajdujÄ…ce siÄ™
w komórkach identyfikuje
się używając różnorodnych
pigmentów i barwników.
" Za pomocÄ… technik barwienia
można zabarwić
i zaobserwować większość
dużych organelli
komórkowych.
Metody barwienia i różnicowania komórek
" Standardowa technika barwienia metodÄ…
eozyna  hematoksylina
" Eozyna jest kwaśnym barwnikiem, który wykazuje
powinowactwo chemiczne z białkami cytoplazmy.
Zabarwia głównie cytoplazmę, zabarwione w ten sposób
struktury nazywane sÄ… acidofilnymi lub eozynofilnymi.
" Hematoksylina to podstawowy barwnik który wykazuje
powinowactwo z rybonukleoproteinami jądra. Barwi głównie
jÄ…dro a zabarwione struktury nazywane sÄ… bazofilnymi.
Barwienie i różnicowanie komórek
" Istnieje również wiele innych sposobów barwienia, które
używane są do wizualizacji poszczególnych tkanek.
" Krew obwodowa i szpik kostny barwione sÄ… technikÄ…
May  Grünwald  Giemsy, która rozróżnia wszystkie typy
komórek i ich poszczególne elementy np. różne ziarna
w granulocytach.
Barwienie preparatów hematologicznych
" Wykonuje się w celu oceny morfologii leukocytów,
erytrocytów i płytek krwi.
" Rozmaz wykonuje się na szkiełkach podstawowych z krwi
wersenianowej żylnej lub włośniczkowej ( jednak nie póz
niej
niż 2h od pobrania )
Wykonywanie rozmazu z krwi obwodowej
" Krew wersenianową dokładnie,
ale delikatnie wymieszać;
" Nanieść niewielką kroplę krwi na
szkiełko podstawowe ok.1 cm od
brzegu.
" Powyżej kropli oprzeć rozmazówkę na
szkiełku podstawowym przysunąć
rozmazówkę do kropli krwi tak aby, cała
krew równomiernie rozmieściła się
między szkiełkami.
" Jednym, zdecydowanym ruchem,
bez dociskania, rozprowadzić krew
utrzymując kąt między szkiełkami
ok. 45°
 Wykonywanie rozmazu z krwi obwodowej
" Natychmiast suszyć rozmaz poprzez wykonanie kilku
szybkich ruchów rozmazem w powietrzu
- faza szybkiego suszenia.
" Podpisać rozmaz zwykłym ołówkiem w jego najgrubszej
części: Imię i nazwisko pacjenta, ewentualnie data
i numer badania.
" Pozostawić rozmaz na powietrzu w temperaturze
pokojowej na ok. 1h  faza wolnego suszenia.
" W ten sam sposób wykonać drugi preparat dla tego
samego pacjenta  preparat rezerwowy w razie
niepowodzenia w barwieniu.
 Wykonywanie rozmazu z krwi obwodowej
Wykonywanie rozmazu z krwi obwodowej
 Wykonany rozmaz z krwi obwodowej
Prawidłowo wykonany rozmaz:
1. Ma barwę żółtoróżową
2. Jest coraz cieńszy ku końcowi
3. Ma jednolitą powierzchnię bez smug,  schodków
i dziur
4. Ma odpowiednią grubość, nie jest zbyt cienki, ani
zbyt gruby; w zbyt grubym rozmazie trudno
różnicować komórki (szczególnie blastyczne)
5. Ma długość ok. 3  4 cm i sięga do 2/3 długości
szkiełka
6. Brzegi rozmazu nie dochodzą do brzegów szkiełka
podstawowego
7. Zakończony jest tzw.:  brodą
Barwienie rozmazów
" Najczęściej stosowaną - jest metoda z użyciem
dwóch barwników: May-Grünwalda i Giemsy.
" W skład barwników wchodzą:
May-Grünwalda  bÅ‚Ä™kit metylenowy, eozyna, metanol,
Giemsy  błękit metylenowy, eozyna, azur
" Do barwienia stosuje się nierozcieńczony barwnik
May-Grünwalda dziÄ™ki czemu preparat nie musi być
utrwalany (gdyż w skład barwnika wchodzi alkohol
metylenowy)
Barwienie rozmazów
" Eozyna jest barwnikiem kwaśnym, który barwi
zasadowe struktury komórkowe (hemoglobina,
ziarnistości granulocytów kwasochłonnych).
" Azur i błękit metylenowy to barwniki zasadowe,
barwiące kwaśne struktury komórkowe (kwasy
nukleinowe, białka jądra komórkowego, ziarnistości).
Ogólny schemat barwienia: metodą MGG
" Wysuszony preparat należy barwić zgodnie z instrukcją
podaną przez producenta barwników.
1. Zalać preparat barwnikiem May-Grünwalda na 3-5 min.
2. Spłukać wodą destylowaną lub wodociągową
3. Zalać preparat rozcieńczonym barwnikiem Giemsy na
13-15 min.
4. Spłukać wodą destylowaną lub wodociągową
5. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze
pokojowej
" Odczynnik Giemsy bezpośrednio przed użyciem należy
rozcieńczyć buforem fosforanowym o pH 6.8 lub wodą
destylowana w stosunku 1 część barwnika do 9 części buforu
lub wody.
Wyniki barwienia
cytoplazma :
" zasadochłonna  niebieska (limfocyty, monocyty, plazmocyty)
" kwasochłonna  w różnych odcieniach różu i czerwieni
(erytrocyty, granulocyty)
" amfoteryczna  w różnych odcieniach fioletu
jądra komórkowe:
" odcienie fioletu  młodsze postacie jaśniejsze, starsze ciemniejsze
ziarnistości:
" azurochłonne  w odcieniach fioletu, od granatu do czerwieni
(w granulocytach obojętnochłonnych, monocytach, limfocytach)
" kwasochłonne  żółtobrunatne (w eozynofilach)
" zasadochłonne  ciemnofioletowe z czerwoną poświatą
(w bazofilach)
Różnicowanie rozmazów:
" Wybarwiony i wysuszony rozmaz oglądamy w powiększeniu
1000-krotnym (10 okular x - 100 obiektyw) z użyciem olejku
immersyjnego.
Oceniamy wszystkie komórki obecne w rozmazie:
" Leukocyty - oceniamy morfologiÄ™
i różnicujemy na poszczególne klasy
" Erytrocyty - oceniamy morfologię (wielkość, kształt,
wybarwienie, występowanie wtrętów,rulonizację, aglutynację)
" Płytki krwi - oceniamy morfologię i występowanie agregatów
Różnicowanie rozmazów:
" Decydujący wpływ na wynik badania ma wybór odpowiedniego
miejsca do oceny morfologii komórek.
" Preparaty oceniamy najczęściej w 2/3 długości rozmazu gdzie:
" Erytrocyty są ułożone równomiernie, nie nakładają się na siebie,
ale nie ma też między nimi wolnych przestrzeni
" W erytrocytach dobrze widoczna jest della, czyli przejaśnienie
pośrodku komórki
" Leukocyty sÄ… odpowiednio rozpostarte, co pozwala na ocenÄ™
struktury jÄ…dra i cytoplazmy; w zbyt grubym rozmazie leukocyty
przyjmujÄ… formÄ™ kulistÄ…
Różnicowanie rozmazów:
" Po rozmazie poruszamy siÄ™ liniÄ…
meandrowÄ…, inaczej ruchem konika
szachowego, ponieważ większe
komórki np.: monocyty, granulocyty,
maja tendencję do układania się na
brzegach i końcu rozmazu
" Różnicujemy co najmniej 100 kolejno
napotkanych leukocytów.
Wynik podajemy jako procent
poszczególnych klas leukocytów
Różnicowanie rozmazów:
Właściwy sposób oglądania preparatu
podczas liczenia wzoru odsetkowego
X% Rozmieszczenie komórek w preparacie krwi obwodowej
w zależności od obszaru oględzin preparatu uzyskuje się
różne wyniki
Rozmaz krwi obwodowej
a - erytrocyty b - granulocyt obojętnochłonny
d - limfocyt
c - granulocyt kwasochłonny
Rozmaz krwi obwodowej
a
b
c
a - erytrocyty b - granulocyt obojętnochłonny c - granulocyt zasadochłonny ( bazofil)
Różnicowanie rozmazów:
" Wartości prawidłowego
leukogramu
" Granulocyty:
" obojętnochłonny:
" o jądrze pałeczkowatym 3-6 %
" o jÄ…drze podzielonym 58-66 %
" kwasochłonne 2-4 %
" zasadochłonne 0-0,5 %
" Limfocyty 20-45 %
" Monocyty 4-8 %
Granulocyt obojętnochłonny o jądrze
pałeczkowatym
" kształt okrągły lub owalny
" cytoplazma-różowa ziarnistość nieliczna azurochłonna
i obojetnochłonna
" Jądro: nie jest podzielone na płaty, pałeczkowate
Granulocyt obojętnochłonny o jądrze
podzielonym
" kształt okrągły lub owalny
" cytoplazma-różowa ziarnistość nieliczna azurochłonna
i obojętnochłonna
" Jądro: płatowe < 6 płatów
Granulocyt kwasochłonny - eozynofil
" Kształt okrągły lub owalny
" Cytoplazma - różowa zwykle zakryta ziarnistościami
" ziarnistości - bardzo liczne, barwy od złocistej do
brunatnej, kwasochłonne
" jadro-dwupłatowe
Granulocyt zasadochłonny - bazofil
" Kształt okrągły lub owalny
" Cytoplazma - bladoróżowa zwykle zakryta
" ziarnistości - różnej wielkości metachromatyczne, koloru
atramentowego
" jadro-płatowe
 Limfocyty
" Średnica limfocytów jest różna około 9-12 źm
" Jądro- okrągłe, owalne
" JÄ…derka  w barwieniu MGG sÄ… niewidoczne
" Cytoplazma  niebieskawa w różnych odcieniach
" W cytoplazmie niektórych komórek mogą występować
ziarnistości azurochłonne (czerwonofioletowe, błyszczące dość
grube o ostrych nieregularnych granicach
 Monocyty
" Największe komórki krwi widoczne w prawidłowym
rozmazie krwi obwodowej( średnica 16-20 źm
Nieregularny kształt okrągły lub owalny
" JÄ…dro- nieregularne, przypomina litery: C,E,L,U
" Cytoplazma niebieskosina
" Ziarnistości  nieobecne lub azurochłonne
(jasnofioletowe) ziarnistości ułożone są w jednym lub
kilku skupiskach.
" W cytoplazmie obecne sÄ… wodniczki
PÅ‚ytki krwi Trombocyty
DZI
KUJE ZA UWAG