Metody izolowania
komórek krwi obwodowej
Zakład Mikrobiologii i Laboratoryjnej Immunologii Medycznej
y
ródła komórek:
" krew obwodowa
" płyny ustrojowe
" tkanki  migdałki, węzły chłonne, grasica, śledziona&
Wybór metody izolacji komórek opiera się na uwzględnieniu:
" rodzaju komórek, które chcemy wyizolować
" wielkości odzysku uzyskanych komórek
" czystość uzyskanych komórek
Prawidłowo przeprowadzona izolacja powinna pozwolić na:
" ocenę sprawności funkcjonalnej komórek
" założenie hodowli komórek.
I. Metody izolowania komórek z narządów:
1) mechaniczne
2) enzymatyczne
Ad.1
Mechaniczne rozdrabnianie wyizolowanych narządów,
homogenizacja (przecieranie na sicie, wytłaczanie),
np. izolowanie leukocytów z grasicy, śledziony,
węzłów chłonnych.
Ad.2
grasica
Stosowanie enzymów np. trypsyny, powodujących
rozluz
nienie tkanki łącznej i uwolnienie komórek do
supernatantu.
śledziona
II. Metody izolowania frakcji komórek z krwi obwodowej
vð Metody biologiczne:
1- wykorzystanie właściwości fagocytarnych komórek
2- wykorzystanie właściwości adhezyjnych komórek
3- rozdział limfocytów T i B na kolumnach z perełkami szklanymi lub wełną nylonową
4- technika negatywnej selekcji
5- rozdział komórek za pomocą chromatografii powinowactwa
6- izolacja z narządów in vivo
vð Metody fizyko-chemiczne:
1- Metoda sedymentacji
2- Metoda adherencyjna
3- Izolowanie komórek w gradientach gęstości
4- Izolacja komórek z zastosowaniem kulek paramagnetycznych (magnetic beads)
5- Izolacja metodą immunoadsorbcji komórek na fazie stałej (panning)
6- Izolacja przy pomocy sortera komórkowego
Cele pobierania krwi
" Aby uzyskać surowicę, plazmę, które stanowią materiał badany do różnych oznaczeń
laboratoryjnych tj. oznaczanie poziomu przeciwciał, antygenów
" Aby wyizolować komórki: erytrocyty, leukocyty itp.
W celu wyizolowania komórek, krew pobieramy na substancje zabezpieczającą
krzepnięciu, na tzw. antykoagulant:
ØðEDTA (wersenian dwusodowy)
Øðcytrynian trójsodowy
ØðHeparyna
" w przypadku małych zwierząt (myszy, świnki, króliki) krew pobiera się prosto z serca
" w przypadku zwierząt większych np. owca, krew pobiera się poprzez wkłucie się do
żyły szyjnej
" człowiek - krew obwodową pobiera się zwykle z żyły łokciowej
Krew
Tkanka złożona z elementów morfotycznych
(upostaciowionych) oraz plazmy. Całkowita
objętość krwi krążącej wynosi ok.
5 litrów, ponad połowę stanowi osocze, ok. 45%
krwinki czerwone i ok. 1% krwinki białe i płytki krwi
PLAZMA:
to płyn prawie w całości złożony z wody, zawiera:
witaminy, mikro- i makroelementy, produkty
metabolizmu komórek, a także fibrynogen, nie zawiera
komórek
OSOCZE:
to plazma w której zawieszone są elementy morfotyczne
krwi
SUROWICA:
frakcja krwi pozbawiona zarówno elementów
morfotycznych oraz fibrynogenu i czynników krzepnięcia
krwi (pozostałość po oddzieleniu się skrzepu).
Metody izolowania frakcji komórek z krwi obwodowej
vðMetody biologiczne:
1- wykorzystanie właściwości fagocytarnych komórek
2- wykorzystanie właściwości adhezyjnych komórek
3- rozdział limfocytów T i B na kolumnach z perełkami szklanymi lub
wełną nylonową
4- technika negatywnej selekcji
5- rozdział komórek za pomocą chromatografii powinowactwa
6- izolacja z na rządów in vivo
Ad. 1 Metoda fagocytarna:
- służy do izolowania komórek monocytarnych z frakcji monocytaro-
makrofagowej i fibroblastów, do izolacji granulocytów
- metoda podobna do separacji magnetycznej
- komórki żerne miesza się z karbozydkiem żelaza i przenosi do zestawu
z magnesem, potrzebne nam komórki przytwierdzają się do ścianek
naczynia, a zebrany nadsÄ…cz odlewamy
Ad. 2 Metoda adhezyjna:
- naturalna adhezja (przyleganie) niektórych komórek do szkła lub
plastiku w temperaturze 37ºC
- komórki te w naturalny sposób odklejajÄ… siÄ™ od tych materiałów w 4ºC
Ad.3 rozdział limfocytów
- stosuje się kolumny z perełkami lub wełną nylonową
- wykorzystuje się tu także właściwości adhezyjne
- rozfrakcjonowanie limfocytów na subpopulacje
- limfocyty B adherują do wełny, a limfocyty T przechodzą z roztworem
przez wełnę
- limfocyty T można odzyskać z wełny poprzez mechaniczne odpłukiwanie
podłożem hodowlanym
Ad.4 technika negatywnej selekcji
- wykorzystuje się cytotoksyczną surowicę odpornościową oraz
dopełniacz (komplement)
- surowica skierowana jest przeciw określonej frakcji komórek
- następuje liza komórek, które nas nie interesują
Toksyczne przeciwciaÅ‚o + dopeÅ‚niacz + komórka swoista Ä…ð liza
Ad.5 rozdział komórek za pomocą chromatografii powinowactwa
- z zastosowaniem złoża np.. Sephadex, (mikrogranulek)
- wykorzystuje się naturalną adherencję komórek, tropizm do Sephadex u
- można użyć kolumn z przeciwciałami skierowanymi przeciwko określonym frakcjom
komórek
Sephadex
Ad.6 izolacja komórek z narządów in vivo
- narzÄ…dy jako z
ródło określonych komórek
- można prowokować gromadzenie się komórek w jamach ciała, dotyczy to głównie
zwierzÄ…t laboratoryjnych
- z
ródło limfocytów: grasica, śledziona, węzły chłonne
- z
ródło granulocytów i monocytów: u zwierząt przez szczepienie dootrzewnowe
neutralnymi substancjami np.. Peptonem. Granulocyty możemy uzyskać po 4-18
godzinach. FrakcjÄ™ makrofagowÄ… uzyskujemy po 72 godzinach od zaszczepienia
Metody izolowania frakcji komórek z krwi obwodowej
vð Metody biologiczne
vð Metody fizyko-chemiczne:
1- Metoda sedymentacji
2- Metoda adherencyjna
3- Izolowanie komórek w gradientach gęstości
4- Izolacja komórek z zastosowaniem kulek paramagnetycznych (magnetic beads)
5- Izolacja metodą immunoadsorbcji komórek na fazie stałej (panning)
6- Izolacja przy pomocy sortera komórkowego
Ad1) Metoda sedymentacji
" metoda najprostsza
" wykorzystuje zjawisko zróżnicowanej szybkości
opadania poszczególnych rodzajów krwinek w
zawiesinie
" pobranÄ… na antykoagulant krew poddaje siÄ™
spontanicznej sedymentacji 1-2h w 37 C
" erytrocyty opadają na dno probówki
" przyśpieszenie procesu:
" dekstran wielkoczÄ…steczkowy (Dextran 500)
" 3% żelatyny w NaCl lub z 1,2% alkoholu
poliwinylowego
Izolacja czystych populacji leukocytarnych wymaga  dalszych metod izolacji
(fizykochemicznych i biologicznych)
Ad 2) Metody adherencyjne
" Wykorzystują zdolność przylegania komórek do powierzchni szkła i
plastiku ( gł. monocyty)
Izolacja monocytów z frakcji komórek jednojądrowych
" inkubacja komórek na płytkach w medium z surowicą
" 60 min 37 C
" do powierzchni płytki  przyklejają się monocyty,
limfocyty pozostają w zawiesinie i łatwo je odpłukać
" monocyty po inkubacji w 4 C przez 30 min odklejajÄ… siÄ™
od płytki
Rozdział limfocytów B i T
" inkubacja w kolumnach z watą nylonową lub wypełnionych
sephadexem D-10
" adherencji ulegają limfocyty B, limfocyty T można odpłukać
Ad 3) Izolowanie komórek w gradientach gęstości
" wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze
właściwym izolowanych komórek
" mieszanina rozdzielajÄ…ca (gradient) o specjalnie
dobranej gęstości względnej tworzy  sito , które:
" zatrzymuje na swej powierzchni komórki
lżejsze
"  przepuszcza komórki cięższe (erytrocyty,
granulocyty)
Cechy gradientu:
üð niska lepkość
üð izoosmotyczny wzglÄ™dem komórek
üð nie powinien wnikać do komórek i
osłabiać ich żywotności
üð Å‚atwy do odpÅ‚ukania
Rodzaje gradientów:
" gradient jednostopniowy
mieszanina Ficollu (hydrofilowy polimer sacharozy) i
Isopaque (sodium metrioate) o gęstości 1,077
wprowadzona przez Boyum do izolacji limfocytów.
" na warstwÄ™ gradientu (ok. 3ml)
Przed
Po wirowaniu
wirowaniem
nawarstwić pełną krew
z antykoagulantem (5ml)
" wirowanie w temp. pokojowej przy 400g
przez 20 min
Krew Plazma
" erytrocyty, granulocyty, martwe
Interfaza z
komórki opadają na dno probówki komórkami
PBML
" interfaza  komórki
jednojÄ…drowe (limfocyty,
monocyty)
Erytrocyty i
granulocyty
Rodzaje gradientów cd&
" gradient dwustopniowy  nawarstwione na siebie preparaty
Histopaq 1,119 i Histopaq 1,077
" wirowanie  30 min przy 700g w temp. pokojowej
" 2 interfazy:
" pierwsza od góry  limfocyty i monocyty
" druga  granulocyty
" erytrocyty  opadają na dno probówki
Gradisol G
" mieszanina Uropoliny i dekstranu
" jednostopniowy gradient
" po wirowaniu 25min przy 400g  2 interfazy
Percoll (mikrokuleczki koloidalnej krzemionki pokrytych poliwinylopyrolidonem)
 dowolne wielostopniowe gradienty (rozcieńczając NaCl  0,15nM)
Ad 4) Izolacja komórek z zastosowaniem kulek paramagnetycznych
(magnetic beads)
" Uzyskiwanie czystych populacji komórek z wstępnie uzyskanej mieszaniny
" Wyizolowane komórki inkubowane są z kulkami magnetycznymi
opłaszczonymi przeciwciałami przeciw Ag (Antigen) powierzchniowym komórek
Rozdział frakcji PBML na frakcję monocytarną i limfocytarną za
pomocą sortera komórkowego MACS
Inkubacja komórek PBML z cząsteczkami paramagnetycznymi
(opłaszczonymi mysimi monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko ludzkiemu CD14+)
przez 30 min temp. 4oC)
wirowanie (1400 obr/min,10 min. w temp. 4oC.)
Naniesienie frakcji komórek
PBML na kolumnÄ™ LS.
Rozdział pozytywny =
frakcja komórek
monocytarnych (CD14+)
>zatrzymana w kolumnie LS
frakcja limfocytarna (CD14 -)
>w przesÄ…czu
Frakcja komórek
monocytarnych została
usunięta z kolumny LS
(przy pomocy tłoka do
kolumny).
Ad 5) Izolacja metodą immunoadsorbcji komórek na fazie stałej (panning)
" stosowany m.in. do rozdziału limfocytów T na subpopulacje CD4 i CD8
" limfocyty T inkubuje się z Ab (Antibody  przeciwciało) monoklonalnymi np.
anty  CD4
" zawiesinę komórek wylewa się na płytkę Petriego opłaszczoną Ab anty
mysie białko
" po inkubacji limfocyty CD4 zostają związane a limfocyty CD8 można
odpłukać
Ad 6)- Izolacja przy pomocy sortera komórkowego (cytometr przepływowy)
Izolacja limfocytów T przy zastosowaniu testu rozetowego E
Zaliczana do grupy biologicznych metod izolacji.
Zasada  obecność markera CD2 na limfocytach T.
" CD2 na powierzchni limfocytów T łączy się
spontanicznie z krwinkami barana tworzÄ…c
rozety
" rozeta = limfocyt + 3 lub Ä…ð krwinek
Powstałe rozetki izoluje się przez wirowanie na gradiencie Percoll.
Hemoliza krwinek czerwonych szokiem osmotycznym Ä…ð zawiesina limfocytów.
Niezależnie od metody izolacji  ocena żywotności i czystości wyizolowanych
komórek.
żywotność
przyżyciowe barwienie błękitem trypanu (wnika do wnętrza martwych
komórek);
prawidłowo przeprowadzona izolacja = 100% żywotność;
niska żywotność komórek = nie pozwala na dalszą wiarygodną ocenę
aktywności
liczba żywych komórek (opalizujące)
X 100%
Żywotność =
liczba wszystkich komórek (niebieskie+opalizujące)
czystość
ocena pod mikroskopem w preparacie wybarwionym metodÄ… Giemsy,
licząc co najmniej 100 komórek i podając procent badanych komórek.
Liczenie gęstości komórek w komorze Bq
rkera :
1.Przygotować komorę.
2.Rozcieńczyć zawiesinę wyizolowanych
leukocytów w płynie Turka Bq
rkera w stosunku
1:20.
3.Zawiesinę wybarwionych komórek przenieść do
komory zgodnie z intrukcjÄ… prowadzÄ…cego
ćwiczenia.
4.Metoda liczenia:
KOMORA Bp
RKERA
Do zliczania leukocytów i erytrocytów.
 głębokość komory: 0,1 mm
 duży kwadrat: 1 mm2
 grupowy kwadrat: 0,04 mm2
 siatka licznika z 9 dużymi kwadratami
 każdy duży kwadrat jest podzielony na 16 grupowych
 kwadraty grupowe nie sÄ… podzielone
Lk x rozcieńczenie x 104
= l.kom/ml
2
Lk  liczba komórek w dwóch dużych
kwadratach
Typy komór do zliczania komórek:
Komora Thoma
Komora Bürkera
Komora Fuchs-Rosenthala
Komora Neubauera
Cel izolowania komórek układu odpornościowego
" dobór dawców przy przeszczepach  określanie
markerów powierzchniowych zgodności tkankowej.
" badanie chorób nowotworowych  izolowanie
komórek nowotworowych, określanie markerów
powierzchniowych
" badanie reakcji alergicznych  badanie aktywności
komórek układu odpornościowego na alergeny
" w opracowaniu szczepionek  badanie odpowiedzi
immunologicznej
" badanie niedoborów odporności
" immunologia rozrodu  leczenie bezpłodności
" badanie aktywności proliferacji komórek
fagocytujÄ…cych
" cel diagnostyczny!!!
 Otrzymywanie erytrocytów
1. Świeżo pobraną krew zmieszać w stosunku 1:2 z płynem Alsever a (glukoza,
cytrynian sodu, chlorek sodu, woda).
2. Tak przygotowanÄ… zawiesinÄ™ można przechowywać w 4ºC przez 1-8 tygodni.
3. Przed wykorzystaniem krwinek należy 3-krotnie przepłukać je NaCl 0,85%, wirując za
każdym razem 10 minut, w 4ºC, w 2000 obr/min.
Izolacja komórek krwi na Gradisolu:
1.Rozcieńczyć krew w PBS bez jonów wapnia i
magnezu w stosunku 1:3
(9ml krwi + 18ml PBS)
2.Nanieść rozcieńczoną krew na gradient, stosunek
objętościowy krew  gradient 1:2.
(2ml Gradisolu + 4ml rozcieńczonej krwi)
3.Wirowanie 20-25 min. 400 x g (1600-2000obr/min)
w temp. pokojowej
4.Zebrać delikatnie warstwę kożuszka do nowych
probówek.
5.PÅ‚ukać dwukrotnie PBS bez jonów Ca²+ i Mg²+
przez 5 min. 300 x g w temp. pokojowej.
6.Odlać supernatant i dodać 1ml PBS, wymieszać
aby powstała jednorodna zawiesina komórek.
7.Policzyć gęstość komórek w komorze Bq
rkera.