2011-09-26
Le\
y w lodówce polimeraza
Le\
y w lodówce polimeraza
Stara lecz mocna, enzym z \
elaza
Stara lecz mocna, enzym z \
elaza
Le\
y i sapie, dyszy i dmucha,
Le\
y i sapie, dyszy i dmucha,
śar z aktywnego jej centrum bucha.
śar z aktywnego jej centrum bucha.
Le\
y zamknięta w swej ciemnej celi:
Le\
y zamknięta w swej ciemnej celi:
 Czy wszyscy o mnie ju\
zapomnieli?
 Czy wszyscy o mnie ju\
zapomnieli?
Od magistranta a\
do docenta
Od magistranta a\
do docenta
Podstawy techniki PCR
Podstawy techniki PCR
nikt mnie ju\
chyba tu nie pamięta !!"
nikt mnie ju\
chyba tu nie pamięta !!"
I marzy biedna polimeraza
I marzy biedna polimeraza
śe ktoś ją bierze, w probówkę wkłada,
śe ktoś ją bierze, w probówkę wkłada,
A w tej probówce oba startery,
A w tej probówce oba startery,
JakaÅ› matrycka, zasady cztery
JakaÅ› matrycka, zasady cztery
I bufor świe\
y, wonny jak wino....
I bufor świe\
y, wonny jak wino....
Ech, by siÄ™ enzym wtedy uwinÄ…Å‚ !!
Ech, by siÄ™ enzym wtedy uwinÄ…Å‚ !!
Tak by popędził wzdłu\
nici obu,
Tak by popędził wzdłu\
nici obu,
Tak z obu końców zadał im bobu,
Tak z obu końców zadał im bobu,
śe nim by spostrzegł się zwierz czy człek
śe nim by spostrzegł się zwierz czy człek
Amplifikacji nadszedłby kres.
Amplifikacji nadszedłby kres.
dr hab.Ewa Balcerczak
PCR umo\
liwia w czasie kilku godzin uzyskanie 106
Metoda PCR (ang. Polymerase Chain
Metoda PCR (ang. Polymerase Chain
-109 kopii wyjściowego DNA.
Reaction) jest bardzo czułą i wydajną
Reaction) jest bardzo czułą i wydajną
Amplifikuje tylko wybrany, krótki fragment DNA
technikÄ… pozwalajÄ…cÄ… na szybkie,
technikÄ… pozwalajÄ…cÄ… na szybkie,
(od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad)
ekspotencjalne powielanie wybranej
ekspotencjalne powielanie wybranej
sekwencji kwasu nukleinowego.
sekwencji kwasu nukleinowego.
Reakcja PCR jest uwa\
ana obecnie za
Reakcja PCR jest uwa\
ana obecnie za
Cykl pierwszy
najwa\
niejsze narzędzie biologii
najwa\
niejsze narzędzie biologii
Cykl drugi
molekularnej.
molekularnej.
Cykl trzeci
Cykl czwarty
Historia PCR
Historia PCR
Odczynniki w reakcji PCR
Odczynniki w reakcji PCR
1985
1985
Pierwsza publikacja o technologii PCR (Science)
Pierwsza publikacja o technologii PCR (Science)
1986
1986
Oczyszczona polimeraza Taq pierwszy raz u\
yta w PCR zamiast fragmentów Klenowa
Oczyszczona polimeraza Taq pierwszy raz u\
yta w PCR zamiast fragmentów Klenowa
Pierwsze zastosowanie w sÄ…dzie USA do identyfikacji DNA (HLA-DQA) - matrycowe DNA (powielana sekwencja)
Pierwsze zastosowanie w sÄ…dzie USA do identyfikacji DNA (HLA-DQA) - matrycowe DNA (powielana sekwencja)
1987
1987
Przyznanie podstawowego patentu firmie Cetus - startery (primery) komplementarne do
Przyznanie podstawowego patentu firmie Cetus - startery (primery) komplementarne do
1988
1988
Wprowadzenie zautomatyzowanej maszyny (termocyklera) przez Perkin Elmer
Wprowadzenie zautomatyzowanej maszyny (termocyklera) przez Perkin Elmer
końców sekwencji do powielenia
końców sekwencji do powielenia
Publikacja w Science dotyczÄ…ca pierwszego PCR z Taq
Publikacja w Science dotyczÄ…ca pierwszego PCR z Taq
1989
1989
- polimeraza
- polimeraza
Polimeraza Taq ogłoszona przez Science cząsteczką roku
Polimeraza Taq ogłoszona przez Science cząsteczką roku
Wprowadzenie AmpliTaq® DNA Polymerase (pierwsza rekombinacyjna polimeraza
Wprowadzenie AmpliTaq® DNA Polymerase (pierwsza rekombinacyjna polimeraza
- dNTP
- dNTP
Taq)
Taq)
Porozumienie Hoffmann-La Roche Inc. & Cetus dotyczÄ…ce rozwoju diagnostyki
Porozumienie Hoffmann-La Roche Inc. & Cetus dotyczÄ…ce rozwoju diagnostyki
- bufor
- bufor
opartej na PCR
opartej na PCR
1990
1990
Pierwszy kit PCR dla HLA DQA, polimorficzny locus u\
ywany do identyfikacji ludzi, - odpowiednie oprzyrzÄ…dowanie
Pierwszy kit PCR dla HLA DQA, polimorficzny locus u\
ywany do identyfikacji ludzi, - odpowiednie oprzyrzÄ…dowanie
dla potrzeb sÄ…du.
dla potrzeb sÄ…du.
Pierwsza amplifikacja I detekcja DNA przy zastosowaniu sondy fluorescencyjnej
Pierwsza amplifikacja I detekcja DNA przy zastosowaniu sondy fluorescencyjnej
dajÄ…ca podstawÄ™ do rozwoju w przyszÅ‚oÅ›ci technologii "real-time PCR (TaqMan®)
dajÄ…ca podstawÄ™ do rozwoju w przyszÅ‚oÅ›ci technologii "real-time PCR (TaqMan®)
1
2011-09-26
Reakcja PCR składa się z 25-40 cykli
Reakcja PCR składa się z 25-40 cykli
Warunki reakcji RT-PCR
Warunki reakcji RT-PCR
Ka\
dy cykl obejmuje trzy etapy
Ka\
dy cykl obejmuje trzy etapy
ilość cząsteczek matrycy: 101 - 106
ilość cząsteczek matrycy: 101 - 106
Cykl PCR:
temperatura hybrydyzacji: o 50C poni\
ej Tm (550C - 700C)
temperatura hybrydyzacji: o 50C poni\
ej Tm (550C - 700C)
stÄ™\
enie starterów: 0.1 - 0.5 mM
stÄ™\
enie starterów: 0.1 - 0.5 mM
Denaturacja
Denaturacja
stÄ™\
enie MgCl2: 1- 3 mM, ze wzrostem stÄ™\
enia wzrasta
stÄ™\
enie MgCl2: 1- 3 mM, ze wzrostem stÄ™\
enia wzrasta
Swoista hybrydyzacja = annealing
Swoista hybrydyzacja = annealing
wydajność reakcji ale równie\
wzrasta niespecyficzna
wydajność reakcji ale równie\
wzrasta niespecyficzna
amplifikacja i zmniejsza się dokładność syntezy
amplifikacja i zmniejsza się dokładność syntezy
Elongacja
Elongacja
stÄ™\
enie dNTP: 200 mM
stÄ™\
enie dNTP: 200 mM
Etapy reakcji PCR
Etapy reakcji PCR
5 3
5 3
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
3 5
3 5
Mieszanina
Denaturacja Annealing Elongacja
reakcyjna
DENATURACJA temp. około 95 C
DENATURACJA temp. około 95 C
5 3
5 3
5 3
5 3
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
CACTAC AGCTAT
T G C A
3 5
3 5
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
3 5
3 5
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
2
2011-09-26
Primery
Primery
5 CACTAC 3
5 CACTAC 3
Stosunek zasad C+G do A+T powinien być jak
Stosunek zasad C+G do A+T powinien być jak
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
najbli\
szy 50% i podobny dla primerów F i R
najbli\
szy 50% i podobny dla primerów F i R
zapewniajÄ…cy odpowiedniÄ… temperaturÄ™ hybrydyzacji.
zapewniajÄ…cy odpowiedniÄ… temperaturÄ™ hybrydyzacji.
Zaprojektowane primery nie powinny: być
Zaprojektowane primery nie powinny: być
T G C A
komplementarne do siebie (self-annealing); ani
komplementarne do siebie (self-annealing); ani
tworzyć stabilnych struktur drugorzędowych typu
tworzyć stabilnych struktur drugorzędowych typu
 spinka do włosów (hairpin).
 spinka do włosów (hairpin).
3 5
3 5
Powinny mięć urozmaiconą sekwencję i odpowiednią ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
Powinny mięć urozmaiconą sekwencję i odpowiednią ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
długość (zwykle ok. 20 nt.), je\
eli majÄ… namno\
yć
długość (zwykle ok. 20 nt.), je\
eli majÄ… namno\
yć
specyficznie określoną sekwencję. Nale\
y sprawdzić
specyficznie określoną sekwencję. Nale\
y sprawdzić
homologię primerów do sekwencji matrycy. AGCTAT
homologię primerów do sekwencji matrycy. AGCTAT
ANNEALING temp. około 45 - 60 C
5 CACTACG 3
5 CACTACG 3
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
T G C A
3 5
3 5
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
.
.
GAGCTAT
GAGCTAT
ELONGACJA temp. około 72 C
5 CACTACGA 3 5 CACTACGAGC 3
5 CACTACGA 3 5 CACTACGAGC 3
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT... ...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT... ...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
T G C A
T G C A
3 5 3 5
3 5 3 5
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA... ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA... ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
ATTGAGCTAT
ATTGAGCTAT
TGAGCTAT
TGAGCTAT
ELONGACJA temp. około 72 C
3
2011-09-26
5 CACTACGAGCTA 3
5 CACTACGAGCTA 3
5 CACTACGAGCTAGCGCCATTTAA 3
5 CACTACGAGCTAGCGCCATTTAA 3
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
T G C A T G C A
3 5 3 5
3 5 3 5
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA... ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA... ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
AAATTGAGCTAT CTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT
AAATTGAGCTAT CTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT
5 CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGAT 3 5 CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA 3
5 CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGAT 3 5 CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA 3
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT... ...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT... ...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
T G C A
3 5 3 5
3 5 3 5
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA... ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA... ...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
TGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT
TGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT
PROFIL TERMICZNY CYKLU PIERWSZY CYKL TERMOREPLIKACJI DNA
PoczÄ…tkowa matryca (+)
3
5
°C
Cykl 1 Cykl 2
100 3 starter1 5
Denaturacja Denaturacja
94
Wydłu\
anie
startera
72
Dołączanie
startera
55
starter2
5 3
3 PoczÄ…tkowa matryca (-) 5
1 2 3 Jednostka
czasu
4
2011-09-26
PRODUKTY PIERWSZEGO CYKLU TERMOREPLIKACJI
DRUGI CYKL TERMOREPLIKACJI DNA
PoczÄ…tkowa matryca (+) PoczÄ…tkowa matryca (+)
3 3
5 5
3 starter1 5
starter2
5 3
3 PoczÄ…tkowa matryca (-) 5
3 PoczÄ…tkowa matryca (-) 5
3
starter1 5
starter2
5 3
starter2 3
5 3 starter1 5
starter2 3
5
3 starter1 5
Zale\
ność liczby cykli od wyjściowej liczby cząsteczek
PRODUKTY DRUGIEGO CYKLU TERMOREPLIKACJI DNA
matrycowego DNA
3
5
Liczba czÄ…steczek matrycy Liczba cykli
Matryce poczÄ…tkowe
300 000 25  30
3 5
15 000 30  35
3 Fragmenty DNA o niezdefiniowanej długości 5
3
5
1 000 35  40
50 40 - 45
3 5
Właściwe fragmenty
5 3
Wizualizacja produktu reakcji PCR
Wizualizacja produktu reakcji PCR
Schemat elektroforezy
Schemat elektroforezy
Elektroforeza w \
elu agarozowym
Elektroforeza w \
elu agarozowym
Elektroforeza w \
elu poliakrylamidowym
Elektroforeza w \
elu poliakrylamidowym
Barwniki wykorzystywane do uwidocznienia produktu
Barwniki wykorzystywane do uwidocznienia produktu
reakcji PCR:
reakcji PCR:
-bromek etydyny
-bromek etydyny
-sole srebra
-sole srebra
5
2011-09-26
Optymizacja liczby cykli.
Optymizacja liczby cykli.
Wpływ stę\
enia jonów magnezu na przebieg PCR
Wpływ stę\
enia jonów magnezu na przebieg PCR
1 2 3
4
19 21 23 25 27 19 21 23 25 27 19 21 23 25 27 19 21 23 25 27
Polimerazy DNA i RNA, nukleotydylotransferazy DNA i RNA, W zwiÄ…zku z opatentowaniem Taq oraz poszukiwaniem
Polimerazy DNA i RNA, nukleotydylotransferazy DNA i RNA, W zwiÄ…zku z opatentowaniem Taq oraz poszukiwaniem
enzymy katalizujÄ…ce syntezÄ™ DNA i RNA. Substratami tej reakcji sÄ…
enzymy katalizujÄ…ce syntezÄ™ DNA i RNA. Substratami tej reakcji sÄ…
enzymów o większej dokładności i termostabilności
enzymów o większej dokładności i termostabilności
trifosforany deoksyrybonukleozydów (dNTP i NTP).
trifosforany deoksyrybonukleozydów (dNTP i NTP).
rozpoczął się wyścig w izolowaniu i patentowaniu
rozpoczął się wyścig w izolowaniu i patentowaniu
nowych termostabilnych polimeraz z ro\
nych gatunków.
nowych termostabilnych polimeraz z ro\
nych gatunków.
Polimerazy były izolowane i klonowane z wielu organizmów: T4, E. coli,
Polimerazy były izolowane i klonowane z wielu organizmów: T4, E. coli,
T7, T5.
T7, T5.
Wiele termostabilnych polimeraz o aktywności DNA
Wiele termostabilnych polimeraz o aktywności DNA
Przełomową modyfikacją udoskonalającą oryginalnie opisaną technikę
Przełomową modyfikacją udoskonalającą oryginalnie opisaną technikę
polimerazy typu I, izolowanych jest z
polimerazy typu I, izolowanych jest z
PCR było zastąpienie fragmentu Klenowa polimerazy DNA I z E. coli
PCR było zastąpienie fragmentu Klenowa polimerazy DNA I z E. coli
przez termostabilnÄ… polimerazÄ™ z Thermus aguaticus (Taq) ekstremotermofili nale\
Ä…cych do Archebacteria (temp.
przez termostabilnÄ… polimerazÄ™ z Thermus aguaticus (Taq) ekstremotermofili nale\
Ä…cych do Archebacteria (temp.
optymalna powy\
ej 80 ÚC) izolowanych z dna oceanów
optymalna powy\
ej 80 ÚC) izolowanych z dna oceanów
Polimeraza Taq jest obecnie u\
ywana do większości reakcji PCR.
Polimeraza Taq jest obecnie u\
ywana do większości reakcji PCR.
w pobli\
u kominów geotermalnych.
w pobli\
u kominów geotermalnych.
Wiele jej cech mo\
e być zarówno wadą i zaletą. Brak aktywności 3'
Wiele jej cech mo\
e być zarówno wadą i zaletą. Brak aktywności 3'
do 5' egzonukloeazy uniemo\
liwiające korektę błędów. Wykazano Wśród Archebacteria znajdują się gatunki
do 5' egzonukloeazy uniemo\
liwiające korektę błędów. Wykazano Wśród Archebacteria znajdują się gatunki
dodatnią korelację między aktywnością egzonukleoityczną 3' to 5'
dodatnią korelację między aktywnością egzonukleoityczną 3' to 5'
hipertermofilne o optymalnej temp. wzrostu powy\
ej
hipertermofilne o optymalnej temp. wzrostu powy\
ej
oraz wiernością syntezy.
oraz wiernością syntezy.
100 ÚC. Nale\
ą one głównie do trzech rodzajów:
100 ÚC. Nale\
ą one głównie do trzech rodzajów:
Pyrodictium, Pyrococcus, and Pyrobaculum.
Pyrodictium, Pyrococcus, and Pyrobaculum.
Taq w jednym cyklu na dołączony nukleotyd myli się z częstością od
Taq w jednym cyklu na dołączony nukleotyd myli się z częstością od
2*10-4 do 2*10-5
2*10-4 do 2*10-5
Charakterystyka DNA polimeraz
Taq Vent DeepVen Pfu Tth UlTma
y
ródło Thermus Thermococcus Pyrococcus Pyrococcus Thermus Thermotoga
aquaticus litoralis GB-D furiosus thermopilus maritima
97.5 10 130 ? 120
T1/2 95oC 40 360 400 180 20 >50
92.5C 130 ? ? ? ? ?
Aktywność + - - - + -
5 -3
Aktywność - + + + - +
3 -5
Szybkość 75 >80 >80 60 >33 ?
Syntezy (pz/s)
Końce 3 A >95% tępe >95% tępe ? 3 A Tępe
Optimum Mg(mM) 1.5 2.0 ? 1.5-2.0 ? ?
Optimum KCl(mM) 50 10 ? 10 ? ?
6
2011-09-26
MatrycÄ… do reakcji PCR jest
Materiał do badania
Materiał do badania
DWUNICIOWA CZ
STECZKA czyli :
DNA lub cDNA otrzymane z mRNA
krew pełna pobrana na antykoagulant inny ni\
heparyna
krew pełna pobrana na antykoagulant inny ni\
heparyna
(zamro\
ona lub przechowywana w temperaturze
(zamro\
ona lub przechowywana w temperaturze
lodówki)
lodówki)
Izolowanie kwasów nukleinowych składa się z 4 etapów:
komórki jądrzaste krwi (  ko\
uszek leukocytarny )
komórki jądrzaste krwi (  ko\
uszek leukocytarny )
wymazy zawieszone w NaCl lub buforze TRIS
wymazy zawieszone w NaCl lub buforze TRIS
" dezintegracji próbki
bioptaty
bioptaty
materiał pobrany sródoperacyjnie (zamro\
ony w
materiał pobrany sródoperacyjnie (zamro\
ony w
" lizy
ciekłym azocie)
ciekłym azocie)
" usunięcia białek oraz innych substancji
zeskrobiny skóry
zeskrobiny skóry
" wytrącenia kwasów nukleinowych
7
2011-09-26
Modyfikacje PCR
Modyfikacje PCR
przechowywanie
przechowywanie
DNA w temp. 4 C , dłu\
sze -20 C
DNA w temp. 4 C , dłu\
sze -20 C
RT-PCR
RT-PCR
RNA w temp. -70 C (cDNA -20 C)
RNA w temp. -70 C (cDNA -20 C)
 gniazdowy PCR
 gniazdowy PCR
 multiplex PCR
 multiplex PCR
Podstawy reakcji RT-PCR
Reverse Transcriptase-PCR
Reverse Transcriptase-PCR
Materiał biologiczny
" proces PCR poprzedzony jest
" proces PCR poprzedzony jest
RNA
przepisaniem informacji z mRNA na
przepisaniem informacji z mRNA na
AAAAAAAAA
AAAAAAA
cDNA (komplementarny DNA) w reakcji
cDNA (komplementarny DNA) w reakcji
AAAAAAA
odwrotnej transkrypcji (ReverseTranscriptase),
odwrotnej transkrypcji (ReverseTranscriptase),
Synteza cDNA
" w obecności odpowiedniego startera
" w obecności odpowiedniego startera
(najczęściej uniwersalny oligo dT lub
(najczęściej uniwersalny oligo dT lub
Hybrydyzacja ze specyficznym starterem Hybrydyzacja z oligo (dT) Hybrydyzacja z heksamerami
AAAAAAA
oligonukleotyd swoisty dla pojedynczego
oligonukleotyd swoisty dla pojedynczego AAAAAAA
AAAAAAA
TTTTTTT
matrycowego RNA)
matrycowego RNA)
cDNA
PCR
Zanieczyszczenie RNA genomowym DNA
Genomowe DNA
mRNA
8
2011-09-26
 Gniazdowy (nested) PCR  Multiplex PCR
 Gniazdowy (nested) PCR  Multiplex PCR
w jednej mieszaninie reakcyjnej wykorzystuje siÄ™
w jednej mieszaninie reakcyjnej wykorzystuje siÄ™
" obejmuje dwie następujące po sobie reakcje PCR więcej ni\
jedną parę starterów
" obejmuje dwie następujące po sobie reakcje PCR więcej ni\
jedną parę starterów
" po pierwszej reakcji PCR z u\
yciem jednej pary
" po pierwszej reakcji PCR z u\
yciem jednej pary
mo\
na namna\
ać kilka genów w jednej probówce
mo\
na namna\
ać kilka genów w jednej probówce
starterów następuje druga reakcja PCR (matrycą jest
starterów następuje druga reakcja PCR (matrycą jest
produkt pierwszej reakcji), w której stosuje się inne
produkt pierwszej reakcji), w której stosuje się inne
startery zlokalizowane bli\
ej środka powielanego mo\
na wykonać porównawczą analizę półilościową -
startery zlokalizowane bli\
ej środka powielanego mo\
na wykonać porównawczą analizę półilościową -
fragmentu DNA.
fragmentu DNA.
namno\
eniu, obok analizowanego fragmentu DNA,
namno\
eniu, obok analizowanego fragmentu DNA,
poddaje siÄ™ matrycÄ™ standardowÄ… (gen metabolizmu
poddaje siÄ™ matrycÄ™ standardowÄ… (gen metabolizmu
podstawowego), uzyskując jej ściśle mierzalne ilości.
podstawowego), uzyskując jej ściśle mierzalne ilości.
" ostateczny wynik tak przeprowadzonego procesu jest
" ostateczny wynik tak przeprowadzonego procesu jest
wielokrotnie bardziej wiarygodny od uzyskanego
wielokrotnie bardziej wiarygodny od uzyskanego
Pozwala to równie\
kontrolować poprawność
Pozwala to równie\
kontrolować poprawność
metodą zwykłego PCR (wzrost czułości i swositości
metodą zwykłego PCR (wzrost czułości i swositości
przebiegu prowadzonego procesu
przebiegu prowadzonego procesu
diagnostycznej)
diagnostycznej)
Schemat multiplex PCR
Schemat multiplex PCR
9