CHEMIA BIONIEORGANICZNA

1 . Przykłady procesów biologicznych, które wymagają jonów metali:

• oddychanie

• część procesów azotu (nitrogenaza)

• FOTOSYNTEZAA

• PRZEWODZENIE NERWÓW

• SKURCZ MIĘŚNIA

• OCHRONA PRZED CZYNNIKAMI TOKSYCZNYMI I MUTAGENNYMI

Z zewnątrz celowo wprowadzane są do organizmów kompleksy metali jako:

• leki - np. przeciwnowotworowe, przeciwreumatyczne, radiofarmaceutyki

• próby diagnostyczne - np. środki kontrastowe dla NMR, próbniki konformacji DNA i białek

• jony metali istotne jako elementy układów biologicznych

pierwiastki odgrywające podstawową rolę dla organizmu:

H, Mg, Na, K, Ca, V, Cr, Mo, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zu, O, p, Si, S, Cl, Br, J, Se, As, Sr

Stężenie kationów w płynach ustrojowych

Osocze płyn śródmiąższowy płyn komórkowy

Na 142 145 10

K 4,3 4,4 156

Ca 2,5 2,4 1,7

Mg 1,1 1,1 13

Transport przez błony

Formy występowania w plazmie krwi

Na - sód w białku 1 % - niejonowy

Na CO3 ; NaHCO3 - 0,5 % elektrostatycznie związany

Wolny sód - aktywny Na +

Ca 2+

W formie niejonowej

• albuminy, globuliny, CaHCO3+

W formie jonowej

• Ca2+ elektrostatycznie związany i Ca 2+ wolny

Elektroda jonoselektywna - mierzy potencjał; mierzy aktywność. Różna aktywność od stężenia

Rezultaty pomiaru Na+ i K+ różnymi metodami w plazmie

Jon stężenie (fotometria) aktywność

Na+ 140 104 (bezpośredni odczyt) 135 - po rozcieńczeniu 200x

K+ 4 3 3,9

Biomimetyki - odtwarzają proces który zachodzi w organizmach żywych

• konstruowanie modeli aktywnych metaloprotein i błon biologicznych

• zalety badań biomimetycznych: stosunkowo prosta kontrola procesów poprzez wprowadzaie systematycznych jednostkowych zmian strukturalnych w ukłądzie modelowym np.:

• zmiana polarności centrum wiążącego

• celowe wprowadzanie zawad sterycznych w wybranych regionach układu modelowego

• zmiany układu donorowego

• zmiany rozpuszczalnika

Niedogodność:

• brak oddziaływań białko - kompleks

• biomimetyki aparatu fotosyntetycznego

AMINOKWASY

• pojęcie zwitterjonu H3N+CH(R)COO-

• grupa aminowa i kwasowa

• taki zakres pH gdzie jest zwitterjon- jon obojnaczy

• różnice formy aminokwasów w zależności od pH

• grupy aminowe i COOH mogą tworzyć wiązanie pepetydowe

• 125 i 114 stopni - kąty wiązania peptydowego 2 formy tego wiązania

• delokalizacja wolnej pary elektronowej na azocie

• z tym wiązaniem jony metali tworzą kompleksy - można badać je spektrofotometrycznie

Struktura I- rzędowa białka

• kolejność aminokwasów w białku

Struktura II - rzędowa

• jakie są oddziaływania np. wiązanie wodorowe wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe

• też w kwasach nukleinowych

Struktura III- rzędowa

• struktura przestrzenna

• oddziaływania pi-elektronowe między grupami aromatycznymi

IV- rzędowa

• duze zegmenty łączą się w jedną całość

ENZYMY

• białka uczestniczące w procesach biokatalitycznych

• proces szybciej zachodzi

• grupa prostetyczna - koenzym - związany jest na stałe z enzymem (w tym jony metali) niebiałkowa; odpowiada za konkretną reakcję apoenzym+ koenzym= holoenzym

• jony metali aktywują koenzym

• enzymy wiażące tlen redukcja tlenu np. hemoglobina

Kompleksy ważne decydują w jakiej formie jest transportowane, przechowywane żelazo; Fe wytrąca się w pH ok. 4

• jeśli wytrącanie następuje nie jest tak w organizmie bo powstają kompleksy...

Puryny i pirymidyny budują DNA i RNA oraz ATP - kwas adenozynotrójfosforanowey

• kwas deoksyrybonukleinowy - polimer dwuniciowy

• rola wiązań wodorowych destabilizacja lub stabilizacja DNA

• kompleks cynku - sczepia białka helisy ` palce cynkowe'

• próbniki - kompleksy jonów metali; można wmieszać je w nici DNA i obserwować je

BŁONA KOMÓRKOWA

Funkcje błon;

• bariera utrzymująca objętość i skłąd komórki

• matryca dla receptorów (białek) przekazujących bodźce i substancje do komórki

• miejsce przebiegu procesów przemiany energii

1. fotosynteza

2. fosforylacja oksydacyjna

W2 ENZYMY

• stężenie O2 w roztworze nie przekraca 10^-3 mola/dm3 musi być enzym odpowiedzialny za transport tlenu w organizmach żywych enzym wiąże tlen

1. Enzymy redoks

• nośniki tlenu; hemoglobina (1-centrum) i hemocjanina (2 centra)

• deoksyhemerytryna i oksyhemerytryna

Biologiczne centrum Fe

• centrum aktywne hemoglobiny hem

• 4 atomy azotu

• podjednostki składjaące się na molekułę hemoglobiny

• grupy karboksylowe ulegają zamianie

CO2 + H2O > H+ + HCO3-

• efekt Bohra; wiązanie tlenu zwiększa wydalanie CO2

kooperatywny mechanizm wiązania tlenu

• związanie tlenu powoduje opadnięcie Fe na powierzchnie porfiryny

Układy miedziowe

• niebieskie białka miedziowe - barwa niebieska ; miedź, azot, siarka, przeniesienie elektronów powoduje zabarwienei; tetraedr

• typ II - niezabarwiony bo nie ma struktury tetraedrycznej; dysmutaza zawiera Zn - nie bierze udziału w procesie redoks

• typ III - pary jonów Cu (II) sprzężone oddziałują ze sobą antyferromagnetycznie

• typ IV - zawiera kilka typów centrów np. neuroplazmatyczne

HEMOCJANINA

• desoxy Cu+1 donory - azoty z histydyny; 350 pm( mała odległość) wiązanie tlenu zmiana barwy; tlen łączy się pomiędzy miedzi

Problemy w ustaleniu struktury:

1 - odległość centrów Cu (II)

2 - odległość centrów Cu (I)

3 - liczba i rodzaj ligandów formie utlenionej

4 - liczba i rodzaj ligandów w formie zredukowanej

5 - brak sygnału widma EPR dla centrów Cu (II) - diamagnetyczne własności utlenionej formy białka

6 - jak związany tlen w cząsteczce

EXTAF - pokazuje donorowe atomy w stosunku do jonu metali; rentgenowska

Widma Romera - dowiodły istnienia nadtlenku - pasmo drgania rozciąganego O-O

WIDMO UV Vis- 2 pasma, które odpowiadają ...

• w różnych układach różne struktury

• badania spektroskopowe

Biologiczna redukcja tlenu do wody przy użyciu LAKAZY :

• 1:1 1:2 w takim stosunku reaguje O2 nośnik tlenu

• ukłądy biomimetyczne w temp. 90 stopni apoenzym powoduje zachamowanie nieporządanych reakcji chemicznych

• redukcja biologiczna- wodór jest związany w NADH i oddaje wodór i elektrony poprzez cytochromy elektrony redukują tlen

• LAKAZA - białko miedziowe, niebieska, tetraedryczne centrum; 4 -elektronowy reduktor tlenu produktem jest O2; by zredukować O2 musi występować w formie zredukowanej; substrat redukuje laktazę (cząsteczkę hydrohinonu) laktaza utlenia hydrohinon do hinonu i ulega redukcji i sama redukuje tlen

2Cu2+ + hydrohinon 2 Cu + + hinon 2 H+

2 Cu 2+ + ½ O2 + 2 H+ 2Cu2+ + H2O

lakaza stosunkowo trwała; do utleniania różnych substancji przemysł drzewny, wybielanie papieru, tani enzym

• tworzą go grzyby i drzewo lakowe

• 4 atomy miedzy w otoczce apoenzymu

• grupy COOH, NH2 przez to przyłączanie do podłoża

• typ I białka miedziowego Cu 2 histydyny i siarka przyjmowanie elektronów od substratu; jeśli tego nie ma laktoza nie działa

• elektron przekazany do centrum (2 miedzy są blisko siebie i są sprzężone antyferromagnetycznie) związanie i redukcja O2

• trzecia miedź - klaster miedziowy

• 3 typy centrów ( I, II, III)

• laktozy mają różne potencjały formalne

• by zastosować lakazę ten potencjał musi być najwyższy takie atomy Cu otoczone hydrofobowym otoczeniem Ala, Ser, His izoluje centrum miedziowe i hydrohinon może dotrzeć do centrum i oddziaływać tunelowanie elektronowe na centrum Cutunelowanie zależne od odległości im większa tym gorzej

• Typ I - miedź na II stopniu utl. Max absorbcji przy 610 nm

• Typ II - miedź na II stopniu utl.sygnał EPR zbliżony do niskocząsteczkowego kompleksu

• Typ II - 2 miedzi sprzężone

• Lakaza niebieska

• Lakaza żółta dodatkowe ligandy

• Lakaza biała Zn zamiast Cu w jednym miejscu

Oczyszczanie wysokoaktywnych preparatów lakazowych:

• chromatografia jonowymienna

• adsorpcyjna

• oddziaływania hydrofobowe

• powinowactwa

Właściwości oczyszczonych lakaz:

• masa cząsteczkowa

• zawartość skłądnika węglowodanowego

• stałe kinetyczne

• potencjał redoks - jak aktywna lakoza

• liczba atomów Cu w centrum aktywnycm optima działania lakaz

• większość pracuje w pH 3,5 - 5

• niektóre pH >7

Funkcje lakazy:

• uczestniczy w biosyntezie ligniny u roślin wyższych

• detoksyfikuje środowisko naturalne (fenole, hinony, utleniane to co ma pierścień hinonowy)

• udział w procesie mikrobiologicznej depolimeryzacji ligniny

Zastosowania:

• delignifikacja w produkcji papieru i pulpy drzewnej

• sensory enzymatyczne w analizie leków (morfina a kodeina)

• klarowanie wina

• usuwanie zanieczyszczeń środowiska; trichlorofenole, alkeny, odpady przemysłowe, degradacja herbicydów, odbarwianie

Układ bioelektroniczny - biomateriał unieruchamia się na podłoży przewodzącym (np. elektrodzie) osadza się lakazę i pełni ona funkcję czujnika na substancję np. O2 monitorowanie stężenia substancji ; lakaza zachowuje własności

Korzyści z tych układów

• wysoka specyficzność oddziaływań enzym-substrat i duża liczba obrotów w biokatalizie może być wbudowana w układach biosensorowych

• uaktywnienie enzymów na powierzchni przewodzącej biotransformacja

• fotoczułe enzymy i proteiny zaadsorbowane na elektrodzie aktywacja światłem; optoelektronika

Problemy kontaktu materiału

• trzeba znać strukturę biokatalizatora i położenie redoks

• odległość elektrody od centrum aktywnego często zbyt duża

• enzym powinien być w pobliżu elektrody

• unieruchomienie enzymu bepośredni kontakt enzymu z elektrodą niekorzystny

Związanie enzymów z podłożem:

• bezpośredni kontakt elektryczny

• Met - przeniesienie elektronów dzięki synetycznym i biologicznym nośnikom (mediatory)

• Adsorpcja enzymu na powierzchni elektrody

• Złącza (mostki) molekularne - zapewniają przeniesienie elektronu na większe odległości

• Tworzenie mono- multiwarstw związków organicznych i biomateriału

• Polimery przewodzące do unieruchomienia enzymu by nie stracił aktywności

• Unieruchomienie enzymu w membranie

• Łączenie enzymu z elektrodą poprzez nanocząstki i nanorurki

BIOOGNIWO

• nowe źródło energii

• na 1 elektrodzie enzym (oksydaza glukozowa) utlenia glukozy do glukuronianu H2O2 utleniany do tlenu (drugi substrat) ANODA - utlenianie

• na KATODZIE - proces z udziałęm lakazy i mediatora

• utlenianie cukru

• elektrody w jednym roztworze

• kataliza enzymatyczna na elektrodzie

• elektroda trudno redukuje lakazę potrzebny mediator do przekazywania elektronów do środka białka

• O2 + 4H+ + 4 e 2H2O

• Mała energia z tych procesów stosuje się do zasilania czujników

SWCNT - nanorurki; rurka z przekaźnikiem; na końcu ziązane centrum aktywne enzymu

• konstrukcje na anodach bardziej zaawansowane

• czynniki wiążące - polianilina; polimery łączenie by enzym nie zdenaturował się

• można umieścić warstwę (membranę) i tam mediator i enzym proces utleniania substratu

• najefektywniejszy system wiązania warstwa jest polimerem. Do niego kompleks osmu transportuje elektrony

• ciekłokrystaliczne matryce biokompatybilna

• przezroczysta - badanie spektroskopowo

• enzym jako czujnik do mierzenia poziomu O2

• można wiązać bezpośrednio białko z elektrodą problem- lakaza jest dużą cząsteczką i można przyłączyć bardzo mało cząsteczek warstwa mało aktywna bo mało katalizatora

• mikroskopia skaningowa i elektronowa moc bioogniwa

5 TRANSPORT JONÓW METALI W ORGANIZMACH ŻYWYCH

zakres użytecznysą toksyczne jony np. Cd muszą być usuwane- stężenie krytyczne (bez wpłwu) ale wyższe niż to jest toksyczne

Mechanizmy regulujące:

1 - transport jonow do komórek

2 - przechowywanie jonów

3 - wydalanie jonów

Fe (3-4 g) :

• 70% hemoglobina, mioglobina

• 0,7 % enzymy wewnątrzkomórkowe

• 29,3% postać magazynowana

- pH fizjologiczne w pH 4 wytrąca się wodorotlenek żelaza i białka nie dopuszczja...

• żelazo magazynowane w formie białek - transferyna lub ferrytrynaFe wprowadzone a w środku micele ortofosforanu

• transferyna - Fe łączone w ukłądzie oktaedrycznym

• bariera to błona kom. Fe wiązane z białkiem i w nim przedostaje się do komórki i uwypukla się część błony i odrywa w formie liposomu (modelowane) układać warstwę; usuwanie żelaza - potrzebna energia

• wchłonięcie liposomu i uwolnienie białka i oczekuje na następną cząsteczkę ligandu (hydrofobowe biało przenosi i ... w postaci liposomu)

• kompleksy działające jako przechowalnie metali (tworzone układy podobne ferytrynie) ochrona środowiskamagazynowanie żelaza w nośnikach związek do wody i wiąże on Fe

• Fe 2+ wnika do apoproteiny reakzja Fe2+ Fe3+ się wytrąca i może tam trwać; reduktory (związki tiolowe) przeprowadzją Fe 3+ w Fe2+

Transport Fe

• syderofory - układy wiążące jony metali (Fe, Pn) przekazywanie radioaktywnych metali

1 - pochodne kwasów hydroksyamowych

2 - pochodne katecholi

• jon chromianowy łączy się z DNA (zmiany nowotworowe)związanie cykliczne i liniowe

• transportujemy w Formie Fe(III) - redukują do Fe(II) i uwalniane

• Fe tworzy labilne kompleksy labilność uniemożliwia badanie kompleksów i zastępuje się Fe Chromem (inertnym)

• Mg, Zn - labilne ; trudne do badania

Magazynowanie i transport Cu

• cytoplazma - składnik miedziowy we krwi; synteza w wątrobie; redukcja tlenu

• albumina - przenośnik miedzi we krwi żylnej, białko ma 600 reszt aminokwasowych opary rtęci lek odtruwający

• choroba Willsona nadmiar miedzi w organizmie !!!

Wydalanie jonów metali:

nadmiar; odpowiedzialne są Metaloteniny małe peptydy i 6-7 atomów na cząsteczkę wiąże Zn(II), Cd(II), Cu(I)

• naturalne środki odtruwające; hydrofobowe

• transport jonów przez błonę kom.

Funkcje błon:

• bariera utrzymująca objętość i skład komórki

• matryca dla receptorów (białek) przekazujących bodźce i substancje do komórki

• miejsce przebiegu procesów fotosyntezy

- każdy lipid ma część polarną (cukier-głowa-hydrofilowa- wiąz. Pojedyncze) i niepolarną (łańcuch kwasu- hudrofobowa- wiązei podwójne)

• sfingomielina;

• cholesterol

Oddziaływania między skłądnikami warstwy:

• wiązania wodorowe

• oddziaływania hydrofobowe - siły Van der Waalsa

• oddziaływnia elektrostatyczne

• stworzenie agregatów w obrębie warstwy

Białka błon:

• peryferyjne (cytochrom c)

• integralne (osydaza cytochromowa)

• jonofor - cząsteczka przenosząca jon przez błonę; układ o dużej labilności; proces przypomina katalizę; nośnik zwiększa liczbę obrotów jak w katalizatorze

• białka kanałowe przechodzą przez całą szerokość dwuwarstwy np. Gramicydyna

1. oddziaływania między składnikami membrany

- kompleksy 1: 1 - domeny błonowe

2. równowagi pomiędzy składnikami dwuwarstw a jonami obecnymi w roztworach wodnych

• kanały jonowe - nośniki

• układ fosfatydylocholina - walinomycyna

• transport sodu i potasu

• ATP-aza sodowo-potasowa

• Na - na zewnątrz - K- do środka pompy protonowe działają stale

• ____________________________________________________________

Transport przez błonę komórkową

• dwuwarstwa lipidowa różne układy białek; białka peryferyczne; integralnie związane z błoną

• białka membranowe hydrofobowe ogony

• fosfatydylocholina (lecytyna)

• jonofory- układy transportujące substancje przez błony

• nośnik kompleksuje jon i uwalnia po drugiejs tronie katalizuje się to

• warstwa ma własności ciekłego kryształu

• lipidy wewnątrz może się przemieszczać; swoboda jak w cieczy

• są też domeny błonowe- podobne substancje w błonie zbliżają się do siebie - ubichinol. Likofenol. Fosfatydylocholiny

• kanały jonowe

• nośniki: walinomycyna reorientacja wewnątz błony

Gramicydyna A - dimer kanał

Układ fosfatydylocholina- walinomycyna (wiąże potas , sód i lit)

Walinomycyna - antybiotyk- przenosi potas

Pompa sodowo-potasowa

• energia przechodzi z przemiany ATP w ADP

• wiązanie 3 jonów Na

• ATPADP fosforylacja ATP-azyenergia zmiana orientacji białka w błonie; jony Na uwolnione na zewnątrz; K wprowadzane do środka; uwolnienie fosforany (2 jony K)

• Nadciśnienie pompa sodowo-potasowa nie daje rady

Wypompowywanie i przepompowywanie protonów

Rola związków wanadu jako blokerów miejsc wiążących ATP (amawadine)

Rola wapnia

• pompa wapniowa

• retikulum endoplazmatyczne

• sygnał nerwowy pobudza błonę RE

• uwolnienie Ca 2+ z błony i przyłączenie do miejsc aktywnych włókien mięśniowych wiązanie z białkiem troponiną

• blokada ATP-azy magnezowej- pompującej Ca2+ do retikulum, energia z hydrolizy ATP

• wapń można zastąpić lantanem, który świeci i można zbadać drogę wapnia

• reakcja na bodziec nerwowy- wydzielanie neurotransmitera - acetylocholina

• impuls nerwowy przez szczelinę synaptyczną uwalnia się acetylocholina (w formie liposomu)

• acetylocholina wchłania się w błonę kom. i wpływa do kanałów po drugiej stronie kanału są białka receptorowe zawsze receptor zamkniety ale jest zmiana konformacji i się otwiera

• jeśli bodziec zanika to acetylocholina dysocjowana na octan przez esterazę symetryczna reakcja na dwóch miejscach aktywnych

Reakcja na bodziec elektryczny

• komórka w stanie spoczynku ma -90mV

• powstaje potencjał czynnościowy w komórce wpływają jony i zmienia się potencjał depolaryzacja do -20mV

• po zaniku bodźca repolaryzacja (EKG)

Symport 2 związki transportowane w jednym kierunku

Uniport - 1 składnik jest transportowany w 1-nym kierunku

Antyport- 2 różne związki transportowane są w 2 strony

Badanie transportu - mierzenie prądów pikoamperami do komórki przytyka się szklaną pipetą z pompką i wciąg się mała część błonu kom. mikroelektrodę do środka a drugą do pipety i mierzy się przepływajacy prąd jak częstry transport i jak zmienia się transport po lekach

Formowanie układów lipolowych do badań modelowych

Liposom- błona kom. - z roztworem uzyskiwany przez ultradźwięki sztuczna dwuwarstwa glukoza i lipid. Filtrujemy i mierzymy

Czarne błony lipidowe (BCM)- naczynie z przegrodą w której jest dziurka- tam ustawiają się lipidy i tworzy się dwuwarstwa w stronę wody; gęsty układ cząsteczek wygląda jak czarna błona

• pojedyncze warstwy tworzą micele

Metoda Langmuira

• pozwala badać pojedyncze warstwy lipidowe woda z solą na powierzchnie lipid rospuszczony w chloroformie różne połączenia cząsteczek na powierzchni wody; można wymuszać położenie cząsteczek przez bariery

• rejestracja zmian ciśnienia powierzchniowego izoterma - 2 wymiary warstwa pojedyncza

• z izotermy wyznaczamy - wartość współczynnika ściśliwości warstwy (Kg) oraz powierzchnię zajmowaną przez pojedynczą cząsteczkę

BADANIE

• przekłądanie monowarstwy z granicy faz woda-powietrze na substrat hydrofilowy

• przekładanie monowarstwy na substrat hydrofobowy

• przytknięcie się do pierwszej warstwy

Skaningowa tunelowa mikroskopia (STM)

• mikroskop ten ma rozdzielczość cząsteczkową

• przykłąda się stały prąd między ostrze przesuwamy to topografia pwierzchni w rozdzielczości cząsteczkowej

• złota elektroda

• pokryta monowarstwą lipidu lub warstwą mieszaną (lipid- gramicydyna)

• upakowanie heksagonalne lipidów

• można policzyć odległość , wymiary

• histogram rozkłąd najbardziej prawdopodobnych wymiarów

• gramicydyna- antybakteryjny polipeptyd w medycynie przy zaburzeniach transplantacji

Transport ładunku przez błony - aparat fotosyntetyczny

H2O + CO2 < CH2O + O2

112 x 10 ^11 ton CO2 organicznego rocznie asymilowanego w procesie fotosyntezy

• fosforylacja; H2O utlenia się do O2; przemiana ATP w ADP zużywana w cyklu Calvina

• NADP przechodzi w NADPH

PSI i PS II

• kompleksy pochłaniające światło ; wzbudzenie kompleksu pod wpływem światła

• rozdzielenie ładunku w centrum reakcji i sensybilizator oddaje elektrony na przenośnik

• porfiryna - częsty sensybilizator; ulega wzbudzeniu pod wpływem światła

• kompleks rutenowy

• jest donor elektronów w centrum utleniającym

• micelarne rozdzielenei łądunku w środku hydrofobowo; napromieniowanie sensybilizatora, który jest w środku miceli, po adsorpcji...

• dwuwarstwy lipidowe

• fullereny pobierają elektrony; ukłądy zbudowane z węgla; mogą redukować się z wymianą do 6-ciu elektronów

• metalokataliza

---