Biotechnologia w ochronie środowiska

Materiały nr 1.

Biodegradacja materiałów organicznych i syntetycznych przez drobnoustroje glebowe

1. Struktura gleby

Gleba to biologicznie czynna powierzchniowa warstwa skorupy ziemskiej, powstała z utworu geologicznego, zwanego skałą macierzystą, w wyniku wietrzenia fizycznego, chemicznego i biologicznego. W jej skład wchodzą następujące frakcje:

• substancje mineralne (45%), powstałe w wyniku wietrzenia skał, występujące w formie koloidów złożonych z glinokrzemianów, uwodnionej krzemionki oraz wodorotlenku glinu i żelaza,

• związki organiczne (5%), głównie związki humusowe, powstałe w wyniku biologicznego rozkładu resztek roślinnych i zwierzęcych, występujące w postaci koloidalnej,

• woda (30%), tworząca wraz z rozpuszczonymi w niej związkami organicznymi i nieorganicznymi roztwór glebowy o zmiennym składzie i właściwościach buforowych pozwalających na ograniczenie nadmiernego zakwaszenia lub alkalizacji gleb,

• faza gazowa (20%), wypełniające wolne przestrzenie między cząstkami, zawiera przede wszystkim N₂, O₂, NH₃, CO₂ i w mniejszej ilości H₂S i CH₄. Zawartość tlenu w fazie gazowej wynosi 10-15%, a może zmniejszać się nawet do 2%, natomiast zawartość CO₂ waha się od 10 do 20%, dochodząc do 30% w miejscach aktywnego rozkładu substancji organicznej,

• organizmy żywe (archeony, bakterie, grzyby, glony, pierwotniaki, robaki, drobne, ssaki, korzenie i kłącza roślin),

• organizmy martwe (szczątki roślinne i zwierzęce, martwe mikroorganizmy).

Gleba jest środowiskiem niejednorodnym, w którym występują znaczne różnice w składzie i właściwościach. Ma ona zwykle strukturę gruzełkowatą, złożoną z granul elementarnych o wymiarach od 0,5 do 5 mm, które powstają z cząstek mineralnych zlepionych przez substancje humusowe oraz śluz. Granule elementarne tworzą większe agregaty, z kanalikami i otworami wypełnionymi roztworem glebowym i fazą gazową. Ilość agregatów zależy od zawartości wody glebie. Drobnoustroje są adsorbowane na powierzchni agregatów, bytują w substancjach humusowych, kompleksach organiczno-mineralnych i na częściowo rozłożonych cząstkach materii organicznej, tworząc mikrokolonie. Sposób ich rozmieszczenia zależy od struktury gleby i powierzchniowego ładunku koloidów glebowych. Na zewnętrznej warstwie agregatów grupują się bakterie przetrwalnikujące, promieniowce i większość grzybów strzępkowych. Wewnętrzną część agregatów glebowych zajmują natomiast bakterie asymilujące jony amonowe, niektóre bakterie gramujemne oraz grzyby z rodzaju Fusarium.

Struktura gleby - schemat

2. Mikroorganizmy glebowe

Ze względu na skład chemiczny i właściwości fizyczne gleba stanowi dogodne środowisko do rozwoju różnorodnej mikroflory, której ilość zależy od struktury gleby, wilgotności, składu fazy gazowej, zawartości składników odżywczych, kwasowości, temperatury oraz strefy geograficznej.

Mikroorganizmy w glebie żyją na granicy dwóch faz, na powierzchni koloidów. Jest to układ dynamiczny, którego skład ilościowy i jakościowy zmienia się w czasie, w zależności od czynników środowiskowych.

Drobnoustroje bytujące w glebie można podzielić na dwie grupy:

• mikroorganizmy autochtoniczne, które występują zawsze, nawet w glebach nieuprawianych,

• mikroorganizmy zymogenne, które bytują w glebie okresowo i rozwijają się po wprowadzeniu do gleby substancji organicznej

• Okresowo mogą występować mikroorganizmy chorobotwórcze (w glebie zanieczyszczonej odchodami lub szczątkami zwierząt i roślin oraz ściekami)

Średnia liczba mikroorganizmów drobnoustrojów glebie uprawnej do głębokości 25cm

Wśród mikroorganizmów glebowych wyróżnia się też specyficzną grupę drobnoustrojów określanych jako „żywe, lecz niezdolne do hodowli" VBNC (ang. viable but nonculturable). Niektóre organizmy glebowe mogą przechodzić do formy VBNC w niekorzystnych warunkach środowiskowych. Organizmy te nie rosną na pożywkach mikrobiologicznych, jednak ich obecność stwierdza się podczas badań specjalnymi technikami mikroskopowymi lub metodami genetycznymi. Szacuje się, że jedynie od 0,1 do 10% mikroorganizmów glebowych ujawnia się podczas hodowli metodą płytkową, pozostałe to komórki VBNC.

Rola drobnoustrojów w glebie jest głównie zawiązana z:

• rozkładem i mineralizacją związków organicznych, co wprowadza pierwiastki występujące w przyrodzie w ponowny obieg, - właściwe tempo degradacji materiałów organicznych świadczy o zdrowotności gleby (np. stanowi wskaźnik efektywnej bioremediacji),

• tworzeniem biomasy własnych komórek w wyniku metabolizmu i rozmnażania,

• nagromadzeniem metabolitów do uzupełniania zasobów substancji próchniczych,

• poprawą struktury gruzełkowatej gleby przez tworzenie próchnicy oraz metabolitów w postaci śluzu.

3. Biodegradacja

Biodegradacja jest to proces biochemicznego rozkładu lub transformacji substancji przez mikroorganizmy żywe lub ich enzymy. Biodegradowalność jest więc podatnością substancji na rozkład pod wpływem mikroorganizmów do produktów końcowych, zwykle nieszkodliwych dla środowiska naturalnego.

Rozróżnia się biodegradację pierwotną (częściową) i ostateczną (całkowitą). W przypadku biodegradacji pierwotnej część składników badanego preparatu jest nierozkładalna. Biochemiczny rozkład nie kończy się mineralizacją; powstają produkty pośrednie, które nie ulegają dalszym przemianom. Mogą one być bardziej toksyczne dla roślin i zwierząt wodnych niż związek wyjściowy. Biodegradacja pierwotna polega na zmianie strukturalnej (transformacji) badanej substancji, w wyniku czego traci ona swoje specyficzne właściwości. W przypadku rozkładu węglowodorów, biodegradację pierwotną ocenia się na podstawie zmian w absorbancji wiązań C-H grup CH₂-CH₂ w podczerwieni.

Mianem biodegradacji ostatecznej określa się przemianę, gdy cała substancja zostanie zużyta przez mikroorganizmy z wytworzeniem produktów obojętnych dla środowiska — dwutlenku węgla (lub metanu, gdy proces prowadzony jest w warunkach anaerobowych), wody, związków nieorganicznych i nowej biomasy. Przy biodegradacji ostatecznej mierzy się najczęściej objętość wydzielonego dwutlenku węgla (lub metanu) albo objętość zużytego tlenu. Czasami stosuje się też termin „biodegradacja akceptowalna", który oznacza rozkład substancji w stopniu umożliwiającym usunięcie pewnych niepożądanych właściwości produktu, takich jak zdolność do pienienia się lub toksyczność.

W przypadku biodegradacji pierwotnej możliwe jest uzyskanie wyniku 100% pomimo niepełnej mineralizacji badanej substancji, o czym może świadczyć zanik wiązań C-H grup CH₂-CH₂ w oznaczeniu spektrofotometrycznym w podczerwieni. Dla biodegradacji ostatecznej, mierzonej ilością wytworzonego CO₂ lub zużytego O₂, najwyższy wynik wynosi 60%. Dzieje się tak dlatego, ponieważ węgiel, wodór i tlen, będące składnikami badanej substancji, w wyniku procesu biodegradacji przekształcane są w dwutlenek węgla, wodę i biomasę. Zwykle zakłada się, że 60% węgla zawartego w produkcie biodegradowanym przechodzi do dwutlenku węgla i może być zmierzone, pozostała część (40%) przekształcana jest w biomasę. Z tego powodu w większości przypadków maksymalny możliwy do uzyskania stopień biodegradacji ostatecznej, wyrażony w % teoretycznego CO₂ lub O₂, wynosi 60%, przy biodegradacji pierwotnej równej 100%.

Czas badań biodegradacji zawiera się w granicach 1-60 dni. Jako badania kontrolne przyjmuje się oznaczanie rozpuszczonego węgla organicznego (RWO), ogólnego węgla organicznego (OWO), ChZT, BZT, ilości wytworzonego dwutlenku węgla lub zużytego tlenu oraz zaniku związku lub jego charakterystycznej cechy strukturalnej (np. absorbancji wiązań CH₂-CH₂ w podczerwieni).

Na podstawie przeprowadzonych testów biodegradacji Komitet Środowiskowy OECD dzieli badane substancje na trzy grupy:

• łatwo biodegradowalne (o biodegradacji powyżej 80%) — związek rozkładany jest szybko nawet wtedy, gdy mikroorganizmy nie mają zapewnionych optymalnych warunków do adaptacji;

• biodegradowalne — ulegające rozkładowi powyżej 70%; jeżeli biodegradowalność jest niższa niż 70% a wyższa niż 20% w okresie 28 dni, to do procesu biorozkładu niezbędne jest zapewnienie dogodniejszych warunków, niż w poprzednim przypadku (np. zwiększenie inokulum);

• niebiodegradowalne — jeśli taki związek znajdzie się w środowisku naturalnym, to udział biologicznych procesów w jego usuwaniu jest pomijalny.

4. Syntetyczne polimery

Dynamiczny wzrost zużycia polimerów, zwłaszcza w przemyśle opakowań, stwarza realne zagrożenia dla środowiska naturalnego wynikające z dużej objętościowo ilości odpadów. Z tego powodu trwają intensywne poszukiwania takich układów polimerowych, których odpady poużytkowe będą mogły być usunięte np. metodą biodegradacji. Biodegradacja polimerów może zachodzić z udziałem mikroorganizmów — bakterii lub grzybów — w warunkach sprzyjających ich rozwojowi.

Opakowania wykonuje się przede wszystkim z polimerów produkowanych masowo, takich jak polietylen, polipropylen, polistyren, poli(chlorek winylu) i poli(tetraftalan etylenu). Właściwości tych polimerów uważanych za niedegradowalne lub słabo degradowalne można modyfikować przez zmniejszenie ciężaru cząsteczkowego, napełnienie polimerami naturalnymi, np. skrobią, celulozą, chitozanem, lub polimerami syntetycznymi, zawierającymi w łańcuchu głównym grupy wrażliwe na hydrolityczny atak mikroorganizmów. Należą tu grupy: estrowe, karboksylowe, hydroksylowe, eterowe.

5. Biopolimery

W trosce o stan środowiska podjęto wiele prac badawczych związanych z poszukiwaniem biologicznych polimerów biodegradowalnych, alternatywnych do tworzyw sztucznych. Zyskują zatem na znaczeniu bakteryjne polimery biodegradowalne. Dotyczy to zwłaszcza polimerów kwasu poli-3-hydroksymasłowego i jego kopolimerów.

Z informacji literaturowych wynika, że liczne mikroorganizmy wykazują zdolność do biosyntezy polimerów kwasu poli-3-hydroksymaslowego (PHB). Związki te, magazynowane wewnątrz komórki w postaci granul, stanowią ważny czynnik wpływający na przeżywalność bakterii w warunkach niedoboru pokarmu w środowisku, stanowiąc źródło węgła i energii. Niektóre organizmy mogą kumulować PHB w znacznych ilościach (80% suchej masy bakterii), gdy źródłem węgla i energii w pożywce są cukry. Stwierdzono również, że eliminacja azotu z pożywki wpływa na zwiększenie wydajności procesu syntez; PHB.

Główną jego zaletą jest termoplastyczność oraz podatność na biodegradację.

Kwas poli-3-hydroksymasłowy należy do jednych z najbardziej rozpowszechnionych u bakterii materiałów zapasowych. U większości bakterii biopolimer ten syntetyzowany jest z prekursora, którym jest acetylo-CoA, w sekwencji trzech reakcji enzymatycznych. Badania prowadzone nad syntezą PHB wykazały, że drobnoustroje mogą wytwarzać też wiele jego kopolimerów należących do licznej rodziny poli-3-hydroksyalkanów (PHA). Kopolimery PHB ze względu na lepszą termoplastyczność związaną z niższą temperaturą topnienia oraz łatwiejszą biodegradacją stanowią bardziej cenny materiał polimerowy niż czysty PHB. Bakteryjne polimery kwasu poli-3-hydroksymasłowego oraz jego kopolimery należą do grupy polimerów ekologicznie bezpiecznych i mogą być stosowane jako materiały o specjalnych właściwościach w produkcji opakowań, medycynie i farmacji.

6. Metody oceny biodegradowalności materiału

a) Rozkład materiałów w glebie

Badany materiał naturalny lub syntetyczny jest zakopywany w glebie (badanie może być prowadzone w warunkach laboratoryjnych - metoda wazonowa lub też w środowisku naturalnym. Czas inkubacji zależy w głównej mierze od typu materiału. Badany materiał podaje się ocenie:

• wizualnej

• parametrów fizykochemicznych (zmiana masy, rozciągliwości)

• mikroskopowej (np. mikroskopia elektronowa umożliwia lokalizację miejsc adsorpcji enzymów celulolitycznych do substratu i zmiany strukturalnej włókien celulozy).

Metoda ta uwzględnia wpływ drobnoustrojów VBNC w warunkach laboratoryjnych, umożliwia próbę izolacji drobnoustrojów odpowiedzialnych za biodegradację.

b) Rozkład materiałów podczas hodowli na podłożach mikrobiologicznych

Badany materiał jest umieszczany na odpowiednich podłożach mikrobiologicznych na szalkach Petriego i następnie zaszczepiany ściśle określoną ilością komórek bakterii lub zarodników grzybów. Inkubacja jest prowadzona określony czas w warunkach laboratoryjnych (regulacja temperatury, wilgotności, naświetlenia). Badany materiał podaje się podobnej ocenie jak parametrów przypadku badania rozkładu parametrów glebie.

Przykładowa skala oceny wizualnej

0 = Brak widocznego pod mikroskopem wzrostu grzybów na próbce

1 = Wzrost grzybów na próbce słabo widoczny nieuzbrojonym okiem, ale dobrze widoczny pod mikroskopem

2 = Wzrost grzybów na próbce widoczny nieuzbrojonym okiem, ale mniej ni 25% powierzchni pokryte grzybem

3 = Wzrost grzybów na próbce widoczny nieuzbrojonym okiem i ponad 25% powierzchni pokryte grzybem

Literatura

1. Mikrobiologia techniczna, tom 1. red. naukowa: Zdzisława Libudziasz, Krystyna Kowal, Zofia Żakowska. 2009. Wydawnictwa Naukowe PWN

2. Ekologia z ochroną środowiska, Ewa Pyłka - Gutarowska. 2004. Wydawnictwo „Oświata”

---