Elektroforeza białek na żelu poliakrylamidowym w układzie Laemmli'ego oraz blotting białek na membranę PVDF.

Zastosowanie elektroforezy w warunkach redukujących (SDS i 2-merkaptoetanol) do wyznaczania masy cząsteczkowej białek.

WYKONANIE:

1. Przygotowanie żelu rozdzielającego (12% dla białek o masach od 10-100 kDa). APS i TEMED dodać tuż przed wlaniem roztworu między szklane płytki [proporcje na 2 żele w systemie MINI-PROTEAN BioRad]. Nawarstwić na powierzchnię żelu trochę dH₂O i pozostawić do spolimeryzowania.

dH2O	3,35 ml
1.5 M Tris-HCl pH 8.8	2,50 ml
10% SDS	0,10 ml
akrylamid/Bis-akrylamid 30% (29,2 g akrylamid + 0.8 g bisakrylamid/100 ml)	4,00 ml
10% APS (nadsiarczan amonu)	50 μl
TEMED	5 μl

2. Żel zagęszczający 4%

dH2O	3,06 ml
0.5 M Tris-HCl pH 6.8	1,26 ml
10% SDS	50 μl
akrylamid/Bis-akrylamid 30% (29,2 g akrylamid + 0.8 g bisakrylamid/100 ml)	0,76 ml
10% APS (nadsiarczan amonu)	30 μl
TEMED	3 μl

Powierzchnię żelu rozdzielającego należy osuszyć z wody, a następnie na tak przygotowany żel wylać roztwór żelu zagęszczonego, włożyć grzebienie i pozostawić do spolimeryzowania.

3. Bufor do próbek

0.5 M Tris-HCl pH 6.8	0,25 ml
10% SDS	0,4 ml
glicerol	0,2 ml
2-merkaptoetanol	0,1 ml
Bromophenol Blue	Do lekko niebieskiego zabarwiena

4. Bufor elektrodowy: 0,025 M Tris, 0,192 M glicyna, 0,1% SDS.

5. Przygotowanie próbek: próbki zmieszać w stosunku 1:3 z buforem próbkowym i wstawić je do termobloku (100°C) na 5 minut. Identycznie należy postąpić z markerami mas cząsteczkowych białek. Płytki z gotowym spolimeryzowanym żelem zamontować z aparacie do elektroforezy. Do aparatu wlać bufor elektrodowy i wyciągnąć grzebienie, przepłukać studienki buforem elektrodowym. Do studzienek nałożyć wszystkie przygotowane próbki.

6. Elektroforeza: 100 V (do czasu, aż barwnik nie osiągnie żelu rozdzielającego), a następnie 180 V (do czasu aż barwnik nie osiągnie końca żelu).

Barwienie żeli:

I./

Żel utrwalić 30 min. w 50 % metanolu + 10 % kwas octowy.

Barwienie 2 godz. w 0.025 % CBB R-250 w 10 % kwasie octowym.

Odbarwianie w 10% kwasie octowym.

II./

Barwienie: 0,2% CBB-R250; 0,05 G-250 w 40% metanolu + 10% kwas octowy.

Odbarwianie w 40% metanolu + 10 % kwas octowy, a później w 7% kwasie octowym.

Blotting:

Bufor [10x]: 22.13 g CAPS (3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid) w 900 ml wody, doprowadzić NaOH do pH 11 i dopełnić do 1000 ml. Przechowywać w lodówce.
Przygotowanie buforu do elektrotransferu: 100 ml buforu [10x], 100 ml metanolu, 800 ml wody. Membranę PVDF zanurzyć w metanolu i przenieść do buforu elektrotransferowego.

Jeśli żel ma zostać poddany operacji elektrotransferu na membranę to należy to uczynić natychmiast po zakończeniu elektroforezy, bez barwienia. Niewybarwiony żel po zakończeniu elektroforezy należy umieścić w buforze do elektrotransferu na ok. 5 minut.

Przygotowanie "kanapki": (-) gąbka - bibuła- żel - membrana - bibuła - gąbka (+).
Transfer prowadzić przez 1.5 godziny przy natężeniu 170 mA.
Po skończonym transferze membranę zanurzyć na sekundę do metanolu i barwić ok. 1 minutę w 0.1 % Coomassie Brillant Blue R-250 w 40 % metanolu i 1 % kwasie octowym. Odbarwiać w 50 % metanolu, suszyć na powietrzu.

W przypadku barwienia Ponceau S membranę należy barwić 1 minutę w 0.2 % Ponceau S w 1 % kwasie octowym po czym odbarwiać w wodzie.

OPRACOWANIE WYNIKÓW - wyznaczanie masy cząsteczkowej białek

1. Zmierzyć odległość wędrówki barwnika, odległości wędrówek poszczególnych białek markerowych oraz próbki nieznanego białka.

2. Obliczyć względną ruchliwość elektroforetyczną (u) zidentyfikowanych białek.

3. Wykreślić zależność u od log M dla markerów. Na podstawie wykresu określić masę cząsteczkową nieznanego białka.

Analiza instrumentalna - ćwiczenia [BM]

2

---