Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym

Barwienie srebrem

• Azotan srebra stosuje się barwienia zarówno DNA, białek jak i lipopolisacharydów (endotoksyn występujących w błonie zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych )

• W metodzie srebrowej większość białek ulega zabarwieniu na kolor czarny lub brązowy. Lipoproteiny wybarwiają się na niebiesko, a glikoproteiny na brązowo lub czerwono

• Metoda znacznie czulsza od barwienia bromkiem etydyny

• Umożliwia detekcję 1-10 pg DNA na mm ²

• Jest techniką fotochemiczną (reakcja fotochemiczna- reakcja wywołana absorpcją promieniowania elektromagnetycznego w zakresie nadfioletowym, widzialnym lub podczerwonym, które bezpośrednio lub pośrednio (poprzez cząsteczki fotosensybilizatorów) powoduje wzbudzenie elektronowe cząsteczek substratów;, ) podobną do reakcji wykorzystywanych w fotografii

• W zależności od rodzaju wybarwianych związków procedura srebrzenia różni się nieznacznie, jednak ogólny schemat postępowania pozostaje bez zmian

Etapy barwienia srebrem

1)Utrwalanie – polega na odwodnieniu żelu w roztworze etanolu lub metanolu- czynniki odwadniające ( ewentualnie z dodatkiem kwasu octowego)
Żel staje się wtedy bardziej podatny na działanie kolejnych roztworów, a jednocześnie DNA zostaje utrwalony w żelu, co zapobiega jego wypłukiwaniu w dalszych etapach reakcji.
Z żeli denaturujących z mocznikiem należy przed etapem utrwalania wypłukać mocznik, do którego bardzo silnie wiąże się srebro.

2)Utlenianie DNA kwasem azotowym- ten etap stosuje się aby DNA łatwiej wiązał srebro. Kwas azotowy zapobiega dyfuzji cząsteczek kwasów nukleinowych z żelu oraz pomaga w pozbyciu się i neutralizacji niepożądanych odczynników (np. mocznika czy buforu).

Do barwienia stosuje się srebro w formie rozpuszczalnych soli (azotanu srebra).

3)Redukcja srebra do formy metalicznej- następuje przez dodanie formaldehydu do roztworu azotanu srebra (środowisko reakcji zapewnia węglan sodu)
Metaliczne srebro wiąże się z DNA, tworząc nierozpuszczalne sole. Po etapie barwienia należy bardzo dokładnie wypłukać nie związane srebro, którego pozostałości w żelu podczas wywoływania dają silne tło.

4)Wywoływanie – dalsza redukcja srebra węglanem sodowym i formaldehydem ( lub tiosiarczanem sodu) ; pozwala uwidocznić straty. Zredukowane srebro przyjmuje kolor brązowy, czyli na brązowo wybarwia się DNA, z którym srebro zostało związane.
Reakcję wywoływania przeprowadza się stopniowo, do uzyskania odpowiedniej intensywności prążków ( należy pamiętać że sygnał DNA jak i tło wzmocnią się po wysuszeniu żelu)

5)Zatrzymanie redukcji – redukcję zatrzymuje się obniżając pH np. kwasem octowym , który jednocześnie utrwala reakcję barwną

Zalety detekcji srebrem

• Wyższa trwałość uzyskanego wyniku w porównaniu z zastosowaniem bromku etydyny lub radioizotopów

• Metoda znacznie czulsza od barwienia bromkiem etydyny

• Z wybarwionego żelu można ekstrahować DNA do dalszych analiz np. sekwencjonowania, nawet po dłuższym przechowywaniu ( żel po wybarwieniu można wysuszyć na bibule Whatman)

• Metoda tania

• Metodę tę można stosować zarówno w żelach denaturujących jak i niedenaturujących

Wady

• Metoda ta ogranicza się do barwienia DNA w żelach poliakrylamidowych ( w żelach agarozowych czułość srebrzenia jest bardzo niska)

• Duża wrażliwość na zanieczyszczenia nieorganiczne powodujące powstawanie silnego tła (dlatego we wszystkich etapach należy używać wody dejonizowanej)

• Technika za mało czuła w analizach mutacji, gdzie mogą występować tylko niewielkie części badanego materiału jak np. w guzach nowotworowych

Coomassie Brilant Blue (błękit CBB)

• W środowisku kwaśnym cząsteczki barwnika CBB wiążą się do grup aminowych łańcucha polipeptydowego poprzez oddziaływania hydrofobowe

• Po inkubacji z barwnikiem żel przybiera niebieskawą barwę a prążki wskazują lokalizację białek

• Barwnik nie wiąże się z żelem poliakrylamidowym i łatwo go odpłukać, dzięki czemu uzyskuje się wyraźny obraz prążków.

• Czułość metody zależy także od stosowanego protokołu barwienia

Wykonanie barwienia :
Wyjęty żel poliakrylamidowy umieścić w roztworze barwnika na okres około 15-30min. Po tym czasie, zlać barwnik, żel przepłukać wodą a następnie odbarwiać go roztworem odbarwiającym tak długo, aż widoczne staną się rozdzielone prążki białka.

Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków białkowych zawierających około 0,1g białka

Zalety:

• Metoda prosta i tania

• Możliwość łatwego odpłukania barwnika

• Uzyskuje się wyraźny obraz prążków

Wady:

• Metoda mniej czuła niż barwienie srebrem

• Barwienie jest nieodwracalne