12. SYSTEM OCHRONY INTEGRALNOSCI GENOMU U EUKARIOTOW.

Plastycznosc sekwencji nukleotydow w DNA w trakcie ewolucji jest niezbedna dla zapewnienia adaptacji gatunkow do zmieniajacego sie srodowiska. Jednak akumulacja zbyt wielkiej ilosc zmian sekwencji w czasie jednego pokolenia jest zdecydowanie niekorzystna. Nienormalnie wysoka czestosc mutacji nazywa sie niestabilnoscia genetyczna. Wyroznia sie specyficzne formy niestabilnosci takie jak np. niestabilnosc mikrosatelitarna czy niestabilnosc dotyczaca calych chromosomow badz tez duzych segmentow chromosomow ktora nazywa sie niestabilnoscia chromosomalna. Szczegolna forma niestabilnosci jest niestabilnosc epigenetyczna,. Komorki posiadaja bardzo rozbudowane systemy reperacji uniemozliwiajace gromadzenie sie mutacji w genomie. Systemy te wykrywaja uszkodzenia, powoduja ich usuniecie i odtworzenie orginalnej sekwencji. W przypadku, gdy jest to niemozliwe, ze wzgledu na rodzaj lub rozmiar uszkodzenia, komorka aktywuje programowana autodestrukcje (apoptoze) Ryc. 12 - 1.

O najwazniejszych typach uszkodzen w DNA oraz o sposobach ich naprawy byla mowa poprzednio. Obecnie omowiony zostanie uklad integrujacy rozne aspekty odpowiedzi komorki na uszkodzenia DNA. Od pewnego czasu stalo sie bowiem jasne, ze procesy naprawcze DNA regulowane sa przez skomplikowany system obejmujacy oprocz samych mechanizmow naprawy uszkodzen rowniez mechanizmy sluzace ich wykryciu oraz mechanizmy przekazywania sygnalow uruchamiajacych, badz zatrzymujacych funkcjonowanie pewnych sciezek metabolicznych.

Jedna z cech charakterystycznych tego systemu jest to, ze reagujac na uszkodzenie DNA zamyka on bramki cyklu komorkowego co powoduje zatrzymanie sie cyklu. To z kolei dramatycznie zmienia liczne procesy fizjologiczne : profil ekspresji genow, synteze bialek i ich degradacje oraz transdukcje sygnalow w komorce. Aby te zmiany nie doprowadzily do szkodliwych i nieodwracalnych skutkow sygnal alarmowy aktywowany przez uszkodzenie DNA musi byc szybko i precyzyjnie przekazany do licznych elementow maszynerii komorkowej. Zaburzenia systemu zintegrowanej odpowiedzi komorek na uszkodzenia DNA powoduja wystapienie nieprawidlowosci, ktore u czlowieka przejawiaja sie w postaci bardzo powaznych zespolow chorobowych ( patrz tabela 11 - 1). Wyrazaja sie one degeneracja tkanek (w szczegolnosci w systemie nerwowym i immunologicznym), uwrazliwieniem na czynniki uszkadzajace DNA oraz sklonnoscia do zapadania na choroby nowotworowe. Ich wspolna cecha jest to, ze w komorkach z zaburzona koordynacja regulacji mechanizmow reperacyjnych obserwuje sie niestabilnosc genetyczna.

TABELA 12.1 Zespoly chorobowe charakteryzujace sie niestabilnoscia genetyczna.

Zespol chorobowy	Objawy kliniczne	Mutacja w genie	Aktywnosc bialka
AT (Ataksja Telangiektazja NBS (Nijmegen breakage syndrom) Zespol Wernera Zespol Blooma FA (anemia Fanconiego) XP (Xeroderma pigmentosum) CS (zespol Cockayne) TTD (Trichotiodystrofia) ATLD (AT - like disorder) Zespol Li - Fraumeni	neurodegeneracja, przedwczesne starzenie sie, wrazliwosc na promieniowanie, sklonnosc do zapadania na nowotwory, niedobor odpornosci mikrocefalia i niedorozwoj umyslowy, wrazliwosc na promieniowanie, nowotwory przyspieszone starzenie sie, niedobor odpornosci niedobor odpornosci, przedwczesne starzenie, nowotwory wady rozwojowe, niesprawnosc szpiku kostnego, nowotwory wrazliwosc na UV, starzenie skory, nowotwory skory karlowatosc, niedorozwoj umyslowy, wrazliwosc na UV wrazliwosc na swiatlo, uposledzenie umyslowe, suchosc skory, lamliwosc wlosow degeneracja mozgu, wrazliwosc na promieniowanie nowotwory typu sarkoma, osteosarkoma, rak piersi, mozgu, bialaczki...	ATM NBS1 WRN BLM FANC-A, B, C, D1, D2, E, F, G XPA, B, C, D, E, F, G CSA, CSB, XAB2 XPB, XPD Mre11 p53 CHK2	kinaza bialkowa transmisja sygnalu DNA helikaza & 3'-5' nukleaza DNA helikaza rozne skladowe kompleksu reperacji DNA przez wycinanie nukleotydow (NER) skladowe kompleksu NER sprzezonego z transkrypcja. helikazy zaangazowane w replikacje DNA NER egzo/endonukleaza czynnik transkrypcyjny kinaza aktywujaca p53

Przeciecia dwuniciowe w DNA. System zintegrowanej odpowiedzi komorki na uszkodzenia DNA poznany zostal przy okazji badan nad sposobem w jaki komorka reaguje na potencjalnie bardzo szkodliwe dwuniciowe przeciecia DNA. Przeciecia takie sa generowane w niektorych typach komorek w wyniku procesow fizjologicznych. W komorkach linii zarodkowej jednym z pierwszych etapow rekombinacji mejotycznej sa wlasnie takie pekniecia, o czym poprzednio byla mowa. Rekombinacja, poprzedzona tworzeniem dwuniciowych pekniec w DNA, zachodzi rowniez w komorkach ukladu immunologicznego. W jej wyniku nastepuje utworzenie funkcjonalnych genow kodujacych receptory (w komorkach T) oraz przeciwciala (w komorkach B) tego ukladu. Rekombinacja mejotyczna czy tez rekombinacja zachodzaca w komorkach ukladu immunologicznego sa w pewnym sensie wyspecjalizowanymi sposobami naprawy dwuniciowych pekniec DNA. Niezaleznie od tych wyspecjalizowanych komorek wiekszosc, jesli nie wszystkie komorki somatyczne posiadaja uklad rekombinacyjnej reperacji dwuniciowych pekniec ktore powstaja w wyniku uszkodzen DNA przez czynniki zewnetrzne lub przez produkty normalnego metabolizmu komorki, takie jak np. wolne rodniki.

Dwuniciowe pekniecia w DNA sa naprawiane przez jeden z dwoch systemow naprawczych. Jednym z nich jest NHEJ (Non Homologous End Joining, Fig. 11 - 2). System ten jest aktywowany w ten sposob, ze dwuniciowe konce czasteczki DNA, ktore pojawiaja sie w miejscu pekniecia sa wykrywane przez heterodimer KU 70 - KU 80. Ten heterodimer rekrutuje katalityczna podjednostke kinazy bialkowej zaleznej od DNA (DNA - PKcs, co oznacza DNA - dependent Protein Kinase - catalytic subunit). Kinaza ta z kolei rekrutuje i fosforyluje inne podjednostki kompleksu naprawczego. Koncowym etapem naprawy jest odtworzenie wiazan fosfodwuestrowych dokonywane przez kompleks ligazy IV z XRCC 4 (X-Ray Cross Complementing factor). System NHEJ naprawy dwuniciowych pekniec w DNA nie zapewnia wysokiej wiernosci tej naprawy, ale jest stosunkowo prosty, i moze szybko reagowac na uszkodzenia. Ponadto nie wymaga on obecnosci chromatydy siostrzanej, wiec moze funkcjonowac w komorce w fazie G1 gdy nie nastapila jeszcze synteza DNA.

Ryc. 12 - 2. Dwie sciezki naprawy dwuniciowych pekniec w DNA : Rekombinacja z wykorzystaniem chromatydy siostrzanej lub chromosomu homologicznego oraz polaczenie niehomologicznych koncow czasteczki.

Drugi system naprawy dwuniciowych pekniec w DNA polega na homologicznej rekombinacji przypominajacej rekombinacje mejotyczna (Ryc. 5 - 9 B). W pierwszym etapie nastepuje egzonukleolityczne wytrawienie od konca 5' jednej z nici DNA w miejscu pekniecia (Ryc. 12 - 2) oraz zwiazanie bialka RAD52 z koncem 3'. Nastepuje z kolei utworzenie kompleksu pozostalej nici DNA z innymi bialkami wlaczajac w to BRCA2 (Brest Cancer) sklasyfikowane jako supresor nowotworow, poniewaz w formie zmutowanej traci funkcje co sprzyja nowotworzeniu. Jego obecnosc warunkuje tworzenie filamentu zbudowanego z oligomeru bialka RAD 51 na rusztowaniu, ktorym jest DNA. Bialko RAD 51 jest funkcjonalnym homologiem bakteryjnego bialka RecA. Kompleks ten bierze udzial w inwazji siostrzanej chromatydy oraz w syntezie brakujacego segmentu DNA przy wykorzystaniu tejze chromatydy jako matrycy. W procesie tym biora rowniez udzial polimeraza DNA, helikaza (RAD 54) oraz ligaza.

Kompleks MRN (Mre11/Rad50/NBS - Mitotic recombination, Radiation sensitivity, Nijmegen Breakage Syndrom) jest istotnym elementem obydwu procesow naprawy dwuniciowych przeciec DNA (Ryc. 12 - 3). Mre11 jest nukleaza. Jej zasadnicza aktywnoscia jest wycinanie konca 3' z dwuniciowego DNA, co prawdopodobnie nie jest bezposrednio zwiazane z naprawa uszkodzenia a raczej ma na celu utworzenie jednoniciowego segmentu DNA. Taki jednoniciowy DNA jest silnym sygnalem tego, ze DNA uleglo uszkodzeniu. Rad50 ma aktywnosc ATP-azy i nalezy do bialek typu SMC (Structural Maintenance of the Chromosome). Bialko to posiada polozony centralnie "przegub", z ktorym zwiazane sa ruchome "ramiona". W kompleksie MRN Rad50 jest dimerem.

Ryc. 12 - 3 Skladniki kompleksu MRN. Niebieskie regiony w Mre11 sygnalizuja motywy fosfodwuestaraz a trojkaty wskazuja mutacje znalezione u pacjentow z ATLD (Ataxia - Telangiectasia - Like Disease), Linie pionowe w Nbs1 wskazuja na mutacje u pacjentow z NBS. Typowe motywy wystepujace w tych bialkach to : MBD - Mre11 Binding Motif, BRCT - BRCA1 Carboxy Terminal, FHA - ForkHead Associated.

NBS jest najbardziej tajemniczym skladnikiem kompleksu MRN. Bialko to reaguje z histonem H2AX. Jego domena FHA charakteryzuje sie tym, ze wiaze sie z innymi bialkami w kompleks, ktorego utworzenie jest zalezne od fosforylacji. (Ryc. 12 - 4) Sugeruje to, ze funkcja tego bialka jest przekazywanie sygnalu. Wykazano, ze kompleks MRN gromadzi sie bardzo szybko w miejscu wystapienia dwuniciowych pekniec DNA. Jedna z jego funkcji jest prawdopodobnie przytrzymanie koncow przecietego DNA. Nie bierze jednak bezposredniego udzialu ani w naprawie rekombinacyjnej ani w NHEJ. Bierze natomiast udzial w przekazywaniu sygnalu o uszkodzeniu DNA elementom regulacju cyklu komorkowego, co powoduje zatrzymanie tego cyklu do momentu naprawy uszkodzenia przez odpowiednie systemy naprawcze.

Ryc 12 - 5. Pierwsze etapy odpowiedzi na uszkodzenie DNA w drozdzach i u ssakow. U S. cerevisiae uszkodzenie powoduje rekrutacje kompleksu MRX homologicznego do kompleksu MRN ssakow. Kompleksy MRN/X rozszerzaja uszkodzenie przy pomocy nukleazy typu Mre11, co jest niezbedne do zainicjowania reakcji zintegrowanego systemu odpowiedzi na uszkodzenia. U ssakow kompleks MRN aktywuje kinaze ATM, ktora fosforyluje histon H2AX. U drozdzy spelnia te role kinaza Mec1 nalezaca rowniez do klasy ATR (Ataxia Telangiectasia Rad 3 - Related) w kompleksie z Ddc2 (homolog ATRIP - ATR Interactin Protein). Bialko MDC1 pelni funkcje mediatora ktory uniemozliwia nieinstruktywna synteze DNA (zwana RDS dammage-Resistant DNA Synthesis). Rad53 (oficjalna nazwa RAD53) u S. cerevisiae jest homologiem CHK2 (bramka cyklu u Homo aktywna w fazie S, podczas gdy CHK1 jest bramka aktywna w fazie G2. Mechanizm molekularny dzialania bramek wyjasniono ponizej). Bardziej szczegolowy schemat reakcji na uszkodzenia u ssakow patrz Ryc. 11 - 14.

Centralna rola kinazy ATM w odpowiedzi komorki na uszkodzenia DNA. (Ryc. 12 - 5, 12 - 6) Kinaza ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) jest jedna z pieciu kinaz z rodziny kinaz fosfatydyloinozytol-3-owych obecnych w komorkach ssakow. Podobnie jak DNA-PK (DNA dependent protein kinase) jest ona aktywowana przez przeciecia dwuniciowe w DNA. Kinazy ATR i ATX biora udzial w naprawie uszkodzen spowodowanych UV. ATR jest ponadto aktywowana w przypadku zatrzymania sie widelek replikacyjnych. Piata z rodziny kinaza noszaca nazwe mTOR/FRAP nie bierze udzialu w naprawie DNA tylko w reakcji na brak czynnikow odzywczych.

ATM znajduje sie w jadrze komorkowym i charakteryzuje sie tym, ze w przypadku uszkodzenia DNA szybko (w ciagu kilku minut) reaguje fosforylujac wiele roznych substratow co z kolei aktywuje funkcje biochemiczne jednych a inaktywuje inne. W komorkach nieuszkodzonych ATM znajduje sie w formie dimeru i jest nieaktywna. Po uszkodzeniu czasteczki DNA dimer ATM sie rozpada i kazda z podjednostek fosforyluje druga aktywujac sie wzajemnie.

Jednym z najwazniejszych substratow ATM jest bialko p53 (Ryc. 12 - 6, oficjalna nazwa genu TP53 - Tumor Protein 53), ktore jest czynnikiem transkrypcyjnym (nie mylic z bialkiem RAD53, ktore jest kinaza pelniaca role bramki fazy S cyklu komorkowego u drozdzy, odpowiednikiem CHK2 u Homo) obecnym we wszystkich normalnych komorkach w niewielkiej ilosci z powodu krotkiego okresu poltrwania (ok. 20 min.). W 50% nowotworow u czlowieka gen kodujacy ten czynnik jest zmutowany a niezmutowany allel ulega z reguly delecji. Heterozygoty posiadajace zarowno zmutowany jak i niezmutowany allel p53 choruja na choroby nowotworowe w okolo 95% przypadkow, czesto w mlodym wieku. Jest on typowym supresorem nowotworow. ATM w odpowiedzi na uszkodzenie DNA fosforyluje Ser 15 w p53, co powoduje jego aktywacje jako czynnika transkrypcyjnego. ATM fosforyluje rowniez kinaze CHK2, ktora z kolei fosforyluje Ser20 w p53, co uniemozliwia ubikwitynacje tego bialka przez ligaze ubikwitynowa MDM2. ATM fosforyluje tez samo bialko MDM2, co uniemozliwia transport kompleksu MDM2 - p53 z jadra. Tak wiec dzialanie ATM na p53 jest wielokierunkowe powodujac jego aktywacje lub uniemozliwiajac inaktywacje co skutkuje szybkim wzrostem stezenia aktywnej formy p53 w komorce. Mechanizm molekularny aktywnosci bialka p53 polega na tym, ze staje sie ono aktywatorem transkrypcji kilku bialek kluczowych dla obrony komorki w sytuacji stressu. Miedzy innymi p53 aktywuje transkrypcje WAF (inne nazwy to CIP1 i p21, spotyka sie tez symbol p21^WAF/CIP), ktory jest inhibitorem kompleksu kinazy Cdk2 z cyklina E oraz kinazy Cdk4 z cyklina D1. Poniewaz kompleksy te musza byc aktywne aby umozliwic przejscie komorki z fazy G1 do fazy S m.in. fosforylujac bialko Rb (patrz wyzej). fosforylacja aktywujaca p53 skutkuje zatrzymaniem sie cyklu na granicy G1/S. Czynnik transkrypcyjny p53 aktywuje ponadto synteze bialek stymulujacych proces reperacji DNA przez wycinanie nukleotydow (NER) a takze bialek inicjujacych apoptoze w niektorych typach komorek.

Oprocz kinazy CHK2, ATM fosforyluje rowniez kinaze CHK1. Kinazy te fosforyluja fosfatazy CDC25A i CDC25C, co pociaga za soba ich degradacje, co z kolei skutkuje zatrzymaniem sie cyklu komorkowego. Fosfatazy te bowiem maja za zadania defosforylacje (i tym samym aktywacje) kinazy p34^cdc2 i kinazy Cdk2 ( oznaczonych odpowiednio CDK1 i CDK2 na Ryc. 12 - 6). Pierwsza z nich (w kompleksie z cyklina B) jest glowna kinaza mitotyczna, natomiast druga (w kompleksie z cyklina E) przeprowadza cykl komorkowy przez bramke G2/S oraz ma znaczenie dla progresji fazy S. Jak wspomniano wyzej kinaza p34^Cdc2 dla osiagniecia aktywnosci musi zostac defosforylowana w pozycjach Thr14 i Tyr 15 (Ryc 11 - 4). Ta aktywujaca defosforylacja jest dokonywana wlasnie przez fosfataze CDC25C. Dotyczy to rowniez kinazy Cdk2, ktora jest defosforylowana przez fosfataze CDC25A. Tak wiec fosforylacja (i nastepujaca w wyniku tej fosforylacji degradacja) fosfataz CDC25A i CDC25C utrzymuje kompleksy Cdk-cyklina, odpowiedzialne za przejscie bramek cyklu, w formie nieaktywnej. Powoduje to zatrzymanie sie cyklu w fazie G1 i na granicy fazy M. Zatrzymanie to nie jest zalezne, tak jak w przypadku sciezki implikujacej czynnik transkrypcyjny p53 od syntezy bialka.

ATM fosforyluje rowniez NBS1 - skladnik kompleksu MRN (patrz wyzej), SMC1 - skladnik kompleksu kohezyny, oraz bialko FANCD2. Fosforylacja tych bialek powoduje uruchomienie bramek zatrzymujacych cykl komorkowy w fazie S.

ATM fosforyluje ponadto BRCA1 w licznych miejscach. Jest to bialko zaangazowane w proces naprawy dwuniciowych pekniec w DNA w ramach kompleksow wielkoczasteczkowych. Fosforylacja BRCA1 powoduje zatrzymanie sie cyklu komorkowego na granicy fazy S i G2. Rownoczesnie ATM fosforyluje, a tym samym inaktywuje inhibitor BRCA1 (bialko CtIP na Ryc 12 - 6). Rola BRCA1 nie zostala zdefiniowana do konca na poziomie molekularnym. Wiadomo, ze niektore mutacje w genie kodujacym to bialko powoduja dziedziczna sklonnosc do zapadania na raka piersi i jajnikow u kobiet i raka prostaty u mezczyzn.

Innym poznanym substratem kinazy ATM jest bialko kodowane przez gen RAD9 u czlowieka. Jest to podjednostka kompleksu klamry (pierscienia) 9-1-1 (Rad9-Hus1-Rad1), ktora ma strukture podobna do klamry PCNA. Kompleks ten jest zaangazowany w odpowiedz komorki na uszkodzenia DNA. Fosforylacja bialka RAD9, podobnie jak fosforylacja bialka RAD17 bedacego aktywatorem tej klamry, powoduje zatrzymanie sie cyklu komorkowego.

Niestabilnoscia chromosomalna nazywa sie zjawisko fluktuacji kariotypu obserwowane w w wiekszosci linii komorek nowotworowych. Czesto obserwuje sie tetraploidyzacje (podwojenie ilosci chromosomow) ktorej towarzyszy utrata calych chromosomow, translokacje i delecje segmentow chromosomow, amplifikacje segmentow chromosomow itp. Niejednokrotnie kazda z komorek w nowotworze ma swoj wlasny kariotyp. Niestabilnosc chromosomalna jest cecha dziedziczna linii komorkowych, z czego wynika heterogenia genetyczna nowotworow. W przypadku nowotworow w ktorych nie obserwuje sie niestabilnosci chromosomalnej stwierdzono niestabilnosc mikrosatelitarna spowodowana mutacjami w genach kodujacych bialka odpowiedzialne za naprawe uszkodzen DNA typu MMR (15% nowotworow jelita grubego) lub NER (nowotwory u pacjentow z XP). Proces nowotworzenia jest wiec zwiazany z jedna lub z druga forma niestabilnosci genetycznej. Cytogenetycznym przejawem niestabilnosci chromosomow bylo zaobserwowane bardzo wczesnie tworzenie "mostkow" podczas mitozy w komorkach nowotworowych (Hansemann, 1890). McClintock zaobserwowala tworzenie takich mostkow u kukurydzy i zinterpretowala ten efekt jako wynik procesu nazwanego cyklem zlamanie-fuzja-mostek (breakage-fusion-bridge). Pierwszym etapem tego procesu jest zlamanie chromatydy, ktore eksponuje koniec chromosomu nieosloniety przez struktury telomerowe. Taki nieosloniety koniec ma tendencje do laczenia sie z inna zlamana chromatyda (ewentualnie, po replikacji, ze swoja chromatyda siostrzana, Ryc. 12 - 7). W rezultacie powstaje chromosom dicentryczny. W czasie anafazy dwa centromery zwiazane z ta sama chromatyda moga przemieszczac sie w kierunku przeciwleglych centrosomow, co pociaga za soba utworzenie mostka, jego pekniecie i odsloniecie kolejnych nieoslonionych koncow chromatyd.

Zlamania chromosomow moga byc skutkiem defektu w maszynerii zapewniajacej segregacje chromosomow podczas mitozy, niesprawnej odpowiedzi komorki na uszkodzenia DNA oraz uszkodzenia systemu zapewniajacego poprawna replikacje telomerow.

Defekt mechanizmu odpowiedzialnego za segregacje chromosomow w czasie anafazy moze przejawiac sie w nienormalnym oddzialywaniu kinetochorow z elementami wrzeciona mitotycznego, obecnoscia wielobiegunowych wrzecion czy przedwczesna segregacja chromatyd. Jak dotychczas nie zidentyfikowano zadnej mutacji w genach kodujacych elementy centrosomu, ktore bylyby odpowiedzialne za nowotwory u czlowieka. Stwierdzono jedynie, ze nadekspresja kinazy "Aurora A", w bialaczkach, w raku jelita grubego i w innych nowotworach, spowodowana amplifikacja regionu chromosomu zawierajaca gen, ktory ja koduje, skutkuje powstaniem wielobiegunowych wrzecion. Enzym ten bierze udzial w organizacji centrosomu, nie zidentyfikowano jednak zadnej specyficznej funkcji, za ktora jest odpowiedzialny. Aurora A fosforyluje histon H3 i jest niezbedna dla inicjacji i postepu mitozy.

Wiecej wiadomo obecnie na temat zwiazku uszkodzen w systemie odpowiedzi komorki na uszkodzenia DNA z niestabilnoscia chromosomalna. I tak np. stwierdzono, ze somatyczne mutacje w genach hBUB1 i hBUBR1 sa niekiedy obserwowane m.in. w nowotworach jelita grubego. Stwierdzono rowniez, ze hMAD2 jest transkrypcyjnie nieaktywny w niektorych rakach sutka. Jak wyzej wspomniano geny te koduja elementy bramki mitotycznej. Istnieje wiec korelacja pomiedzy wadliwym funkcjonowaniem tej bramki i aneuploidia.

Podobnie amplifikacja genu i nadekspresja cykliny E (ktora w kompleksie z Cdk2 reguluje przejscie G1/S) a takze mutacje w genie hCDC4, kodujacym bialko odpowiedzialne za planowa degradacje cykliny B w fazie S, powoduja niestabilnosc chromosomalna. Jak z tego wynika moga ja powodowac uszkodzenia bramek cyklu nawet poza okresem mitozy.

Mutacje w linii zarodkowej w genach kodujacych elementy kontrolujace bramki cyklu ATM, BRCA1, czy BRCA2, NBS1 czy p53 powoduja dziedziczna sklonnosc do zapadania na nowotwory prawdopodobnie wlasnie poprzez generowanie niestabilnosci chromosomalniej. Wniosek taki potwierdzony zostal przez obserwacje myszy "knockout" z delecjami obejmujacymi te geny.

Potencjalnym zrodlem niestabilnosci chromosomalnej sa telomery. Telomery podczas proliferacji komorek, ktore nie posiadaja funkcjonalnej telomerazy ulegaja skroceniu przy kazdym podziale komorkowym (patrz czesc 10). Jednak w tych komorkach, podobnie jak wszedzie konce chromosomu sa zabezpieczone przez kompleks bialkowy przed atakiem nukleolotycznym i przed polaczeniem z innymi dwuniciowymi czasteczkami DNA. Kompleks ten przestaje spelniac swoja funkcje w niektorych typach komorek jesli dlugosc telomeru spadnie ponizej pewnej krytycznej wielkosci. Zaobserwowano ten efekt na myszach transgenicznych, ktorym wycieto z genomu gen kodujacy RNA telomerazy. Po kilku pokoleniach u myszy takich stwierdzono niestabilnosc chromosomow a w szczegolnosci tendencje do fuzji pomiedzy chromosomami. Stwierdzono ponadto, ze w komorkach o znacznie skroconych telomerach zainicjowany zostaje mechanizm rekombinacyjnego przedluzenia telomeru. Mechanizm taki wymaga egzonukleolitycznego wytrawienia jednej z nici DNA na koncu chromosomu. Podejrzewa sie, ze ten proces moze byc zrodlem niestabilnosci chromosomow, ktora obserwuje sie w regionach telomerow a takze fuzji pomiedzy chromosomami powodujacej to, ze chromosom moze wejsc w cykl zlamanie-fuzja-mostek. (Ryc. 11 - 8). Niestabilnosc chromosomalna powodujaca aneuploidie moze byc wczesnym etapem nowotworzenia. Jednak nawet dla komorki nowotworowej zbyt intensywna niestabilnosc chromosomalna moze byc niekorzystna. W tej sytuacji w populacji ewoluuja takie komorki, ktore maja reaktywowana telomeraze. Obecnosc telomerazy zmniejsza te niestabilnosc i powoduje uniesmiertelnienie nowotworowej linii komorkowej.

Porownanie niektorych genow cyklu komorkowego oraz zintegrowanego systemu reperacji uszkodzen

S. cerevisiae Homo sapiens Funkcja bialka

DDC1 RAD9 bialko z domena BRCT (podj. klamry "9-1-1")

RAD17 RAD1 podjednostka klamry "9-1-1"

MEC3 HUS1 podjednostka klamry "9-11"

RAD24 RAD17 aktywator klamry "9-1-1"

MRE11 MRE11 podjednostka kompleksu MRN/X, endonukleaza

RAD50 RAD50 podjednostka kompleksu MRN/X, bialko typu SMC

XRS2 NBS1 podjednostka kompleksu MRN/X, przekaznik

PDS1 Sekuryna inhibitor separazy

ESP1 Separaza aktywator separacji chromatyd

SMC1 SMC1,3 podjadnostki kohezyny typu SMC

SCC1 SCC1,3 podjednostki kohezyny

CHK1 CHK1 "bramkowa kinaza"

RAD53 CHK2 "bramkowa" kinaza z domena FHA

MEC1 ATR kinaza typu fosfatydylinozytol-3-owej

TEL1 ATM kinaza typu fosfatydylinozytol-3-owej

DDC2 ATRIP bialko wiazace kinaze ATR

- MDC1 Bialko z domena BRCT

RAD9 BRCA1 Bialko z domena BRCT

MRC1 MRC1, Klaspina adaptor zwiazany z widelkami replikacyjnymi

CDC28 CDC2 kinaza p34^cdc2

RAD51 RAD51 ortolog RecA

RAD52 RAD52 pierscienowy heptamer = rekombinaza

RAD54 RAD54 helikaza

System ochrony integralnosci genomu

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

184

Ryc. 12 - 1 Schemat reakcji komorki na uszkodzenie i na stress replikacyjny. Uszkodzenia DNA sa wykrywane (i niejednokrotnie modyfikowane) przez kompleksy bialek dzialajacych jako czujniki. Te z kolei aktywuja wzmacniacze i przekazniki sygnalow. W koncowym etapie efektory (najczesciej kinazy) powoduja zatrzymanie cyklu komorkowego, aktywuja systemy naprawy uszkodzen, wznowienie transkrypcji badz apoptoze. W rzeczywistosci sciezki laczace te procesy tworza siec zawierajaca rowniez sprzezenia zwrotne - ten sam kompleks bialkowy moze byc zarowno czujnikiem, efektorem jak i celem modyfikacji.

Ryc. 12 - 4 Architektura kompleksu MRN (u drozdzy MRX) z DNA w miejscu przeciecia DNA. N\X oznacza polipeptyd NBS1, ktory u drozdzy nosi nazwe Xrs2.

Ryc. 12 - 6. Aktywacja bramek cyklu przez kinaze ATM (ATR) u ssakow. Strzalki oznaczaja stymulacje, ⊥ oznacza inhibicje, przekreslone strzalki oznaczaja inhibicje wynikajaca z fosforylacji, DeP oznacza defosforylacje.

Fig.12 - 7. Cykl zlamanie - fuzja - mostek i wynikajace z niego duplikacjz, amplifikacje i delecje segmentow chromosomow.

Ryc. 12 - 8 Model pokazujacy w jaki sposob skrocenie telomeru powoduje niestabilnosc chromosomalna.

---