W 1 - KOMÓRKOWA BUDOWA ORGANIZMÓW. PORÓWNANIE KOMÓREK PROKARIOTYCZNYCH I EUKARIOTYCZNYCH. ORGANELLA KOMÓRKOWE

Różnorodność organizmów powiązana z taksonomią

Organizmy modelowe:

- krótki cykl życiowy; łatwe w hodowli, mało chromosomów

• Muszka owocówka (Drosophila melanogaster) - ma mało chromosomów

• Nicień (C. Elegans ) - łatwy w hodowli; hermafrodyczny, ma dokładnie 959 komórek

• Mysz - tworzenie modeli chorób genetycznych

• Xenopus levis - duże jaja; łatwo indukować rozmnażanie

• Arabidopsis- rzodkiewnik - mały genom; krótki cykl życiowy

Poziomy organizacji: organelle>> komórki>> tkanki

Grupy komórek: bakteryjna; roślinna, zwierzęca

Teoria komórkowa:

1670 - R. Hooke- jednostki budujące korek u roślin to komórki

1838 - teoria komórkowa - Schleiden i Schwann

1 - komórka stanowi jednostkę struktury, funkcji i organizacji wszystkich organizmów

2 - kom. pozostaje odrębną jednostką budulcową

3 - kom. tworzy się spontanicznie

1855 - R. Virchow „omnis cellula e celula”> każda komórka powstaje z komórki

Współczesna teoria:

• wszystkie organizmy z komórek

• najprostsza strukturalna i funkcjonalna jednostka

• powstają jedynie z innych żywych kom.

• mają materiał gentyczny, dziedziczony

• ślady życia pochodzą od pierwszych komórek, dlatego jest to podobieństwo na szczeblu

Ograniczenia rozmiarów:

• kom. nie może rosnąć w nieskończoność. Wzrost powierzchni nie jest tak szybki jak wzrost objętości 2x średnica 4x powierzchnia 8x objętość

Kształty:

-cienkie, płaskie, kanciaste, owalne, okrągłe, nieregularne, dyskowate, sześcienne, wrzecionowate itd...

• kom. Lactobacillus - kilka nm długości>> jajo żaby - kilka mm

• ludzie: - na ogół 10 -15 nm>>> kom. jajowa 100 nm>> kom. nerwowa ok. 1 m.>> kom. mięśniowa ok. 30 cm.

• kształty komórek są bardzo różne, inaczej wyglądają i są inaczej zbudowane.

PROKARIOTYCZNE - proste komórki bez organelli; należą tu Bakterie i Archeony (grupa oddzielona od wspólnego pnia ale zachowała budowę); są 10 do 100 razy mniejsze nić kom. zwierzęce i roślinne

EUKARIOTYCZNE - mają organelle oraz jądro kom.; wiele wielokomórkowców to eukarioty; jednokomórkowce to Protisty

BAKTERIE

• ziarniaki, krętki, pałeczki

• tylko haploidalne (1n)

• replikacja aseksualna - szybki podział bez mitozy

• bez organelli (chloroplastów, mitochondriów, jądra, ER)

• występują: cytoplazma, nukleoid, rybosomy

• nukleoid i w tym obszarze są cząsteczki kolistego DNA

• mają ścianę kom. >> macierz zewnątrzkomórkowa

ZWIERZĘCA

• mitochondria, ER gładkie i szorstkie, centriole, rybosomy, aparat Golgiego, jądro; brak chloroplastów; mobilny kształt

ROŚLINNA

• ściana kom., wakuola, chloroplasty; kształt stabilizowany ścianą

Pojedyncze błony mają:

• aparat Golgiego

• ER

• Błona kom.

• Lizosomy i peroksysomy

Podwójną błonę mają:

• jądro kom.

• mitochondria

• chloroplasty

cytoplazma = cytozol + organelle + różnego rodzaju cząsteczki

cytozol (płynna faza cytoplazmy)= przedział od błony kom. do wnętrza kom. ; ciecz o konsystencji półpłynnej bez organelli; skład: lipidy, kw. Nukleinowe, węglowodory, białka

Rybosomy- zbudowane z RNA i białek; są miejscem syntezy białek; nie posiadają błony; występują w cytozolu lub na powierzchni ER

Błona kom.

• określa granice komórki

• nie jest błoną symetryczną, tylko asymetrzyczną; jest półprzepuszczalna, nie jest homogenna

• jest płynną mozaiką- struktury błonowe są często w stanie dynamicznej płynności>> białka zmieniają swoje położenie

• określenie , że jest asymetryczna oznacza, że część zewnętrzna ma doczepione cukry, czego nie ma część wewnętrzna

• dwuwarstwa białkowo-lipidowa

funkcje:

1. nadanie komórkom cech indywidualnych i kontrola środowiska wewnętrznego

2. komunikacja między- oraz wewnątrzkomórkowa

3. uczestniczenie w tworzeniu połączeń międzykom. > powstanie tkanek

4. nadaje kształt komórce

Białka:

- integralne

- peryferyczne

• cytoszkieletu błonowego

Transport:

• bierny - zgodny z gradientem stężeń; nie wymaga ATP (dyfuzja prosta- małe cząsteczki gazowe; dyfuzja ułatwiona - dzięki przenośnikom)

• aktywny - niezgodny z gradientem stężeń, np. pompa sodowo- potasowa; wymaga ATP,za pośrednictwem przenośników, kanałów

• reguluje potencjał kom.

• utrzymuje potencjał błonowy

Funkcje białek błonowych:

• receptory

• wtórne przekaźniki

• enzymy

• białka kanałów błon.

• Nośniki

• Białka motoryczne

• Cząsteczki adhezji komórkowej

Retikulum endoplazmatyczne

• jest miejscem wejścia dla białek, później następuje poprzez pęcherzyki

• Szorstkie > związane z syntezą białek, zakończenie syntezy białek, transport białek do aparatu Golgiego

• Gładkie > związane z syntezą lipidów (i nie tylko)glicerolofosfolipidy; sfingolipidy i ceramidy; cholesterol>> zwiększenie powierzchni działania>> w kom. wątroby- miejsce metabolizowania glikogenu>> w gonadach - metabolizm hormonów

• Białka które są syntetyzowane muszą mieć odpowiednią sekwencję...

• gdy synteza białka nie jest zakończona - dochodzi do transportu > polipeptyd łączy się z SRP - rozpoznaje receptor w błonie ER i białko dalej może się przemieszczać do ER; sekwencje sygnałowe odciete

• białka STOP-TRANSFER - nie przechodzą do światła ER tylko budują błonę ER

Aparat Golgiego

• system cystern

• ilość AG zależy od typu komórek >>w kom. wydzielniczych (hepatocyty, kom. trzustki) kilka warstw

• jest spolaryzowany na strony cis i trans

• funkcja> modyfikacja białek i lipidów np. poprzez glikozylację

• składanie proteoglikanów

• sortowanie przed transportem

• droga>> ER>aparat Golgiego>pęcherzyki> błona kom.

• polarność struktury>> CIS- fuzja pęcherzyków ; TRANS- paczkowanie pęcherzyków

• kontrola sekrecji różnego typu białek w a. Golgiego

Lizosomy

• otoczone pojedynczą błoną

• zmienne w kształcie; są „śmietnikami” komórki

• pochodzą z aparatu Golgiego, nie ulegają podziałowi

• funkcja - trawią niepotrzebne związki

• lizosomy pierwotne - zamykają w sobie bakterie

• lizosomy wtórne (autofagosomy)- zamykają w sobie zdegenerowane organelle

Peroksysomy

• zwykle między chloroplastami a mitochondriami

• nie są tworzone w a. Golgiego

• peroksydaza, katalaza

• ulegają podziałowi

• pozbywają się związków toksycznych i wolnych rodników

Jądro kom.

• otoczka z porami

• matrix jądrowa

• chromatyna

• jąderko

• otoczka jądrowa - 2-warstwowa (2 błony)> błony zlewają się w niektórych miejscach tworząc pory> transport z jądra i do jądra

• jąderko - brak błon; miejsce syntezy rRNA przy udziale polimerazy I; niezależna całość, strukturalna odrębność;ma organizator jąderkowy (kawałek DNA); jest miejscem tworzenia się prekursorów rybosomów

• matrix - nadaje kształt jądru; organizuje wewnątrzjądrowe domeny chromatyny; podtrzymuje strukturę jąderka

• chromatyna - włókno nukleosomowe> włókno solenoidowe >>>> chromatyna interfazowa i metafazowa >>> euchromatyna - aktywna transkrypcyjnie; heterochromatyna- nieaktywna transkrypcyjnie, max. Kondensacja.

• rybosomy - z zewnętrzną błoną >> wewnętrzna błona - białka laminy do rozpadu otoczki jądrowej

Cytoszkielet

• cytoplazmatyczny system białkowych filamentów; występuje tylko u Eukariota

• elementy: mikrofilamenty, filamenty pośrednie, mikrotubule

funkcje:

• umiejscowienie organelli w komórce (rusztowanie)

• biorą udział w ruchu komórkowym

• ruch wici i rzęsek (rzęska 9+1)

• skurcz mięśni

• ruch kom. w środowisku

• transport organelli

• proces cytokinezy

Podstawą ruchu jest:

1. proces polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul i mikrofilamentów

2. współdziałanie tych elementów z białkami motorycznymi

Mitochondria i chloroplasty - dziedziczone wraz z cytoplazmą gamety żeńskiej

Chloroplasty:

• 2 błony

• kanały tylakoidu

• białka kompleksowe

Mitochondria

• tu cykl Krebsa i transport elektronów wytwarzających energię w oddychaniu tlenowym

• materiał genetyczny jest użyteczny w badaniu chorób mitochondrtialnych

* mitochondria i chloroplasty są SEMIAUTONOMICZNE- zależne od jądra ale maja pewną część genów potrzebnych do syntezy własnych białek

Wakuola

• funkcje> magazynuje wodę i roztwory różnych substancji

• Nukleoid jest miejscem w komórce - nie mylić z DNA

• U prokariota mezosom= odpowiednik mitochondrium

• U prokariota odcinki DNA głównie kodujące,

W. 2 CYTOPLAZMA; CYTOSZKIELET I RUCH KOMÓRKI;

ELEMENTY MACIERZY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ

Skład cytozolu:

Węglowodany (cukry proste, skrobia)

Lipidy (tłuszcze, oleje, woski, fosfolipidy, steroidy)

Białka

Kwasy nukleinowe (RNA, DNA)

„cząstki życia”- wspólne cechy; makroelementy C, H, O, P,N > składają się z powtarzających się modułów

Węglowodany zbudowane z C, H, O (1:2:1) > najbardziej powszechne cząstki życia>cukry proste, dwusacharydy,polisacharydy> rozpuszczone lub w postaci ziaren skrobi> długie łańcuchy> funkcja- magazyn energii

Lipidy- złożone z C,H, O>> tłuszcze złożone z cząsteczki glicerolu i kwasów tłuszczowych>> nie rozpuszczają się w wodzie> budują błony i stanowią materiał zalasowy

Białka - kompleksy aminokwasów; zbudowane z C,H,O, S,N >> funkcje: budulcowa, transportująca, enzymatyczna

Kwasy nukleinowe- C,H,O,P,N>> podstawowa jednostka to nukleotyd> przekazują informację> źródło energii z ATP

Ruchliwość (dotyczy komórek lub organelli)- zdolność do wykonywania pracy mechanicznej kosztem energii metabolicznej

Cytoszkielet- cytoplazmatyczny system białkowych filamentów w cytoplazmie tylko kom. eukariotycznych

Funkcie:

• rusztowanie

• organizacja przestrzenna

• ruch wewnątrzkomórkowy> m. In. Rozdzielanie chromosomów w czasie mitozy, rozdzielanie kom. zwierzęcych i roślinnych podczas cytokinezy

• ruch kom. w środowisku

• skurcz kom. mięśniowych

• ruch wici i rzęsek

Elementy

mikrotubule - (najgrubsze) zbudowane z tubuliny (alfa i beta tworzą dimer) GTP- z nim połączona alfa tubulina; GDP - z nim połączona beta tubulina

• pojedynczy rząd mikrotubul - protofilament>> dublety, triplety, ale zazwyczaj pojedyncze

• rurki puste w środku

• >>> wydłużanie - dobudowywanie dimeru>> polimeryzacja> na początek musi dojść do nukleacji- gromadzenia i łączenia dimerów i tworzenia mikrofilamentów>> polimeryzacja - koniec (+), depolimeryzacja (-)>> równowaga tych procesów>> tworzy się czapeczka z GTP- alfa-tubulina jest kończącą fubuliną

Funkcie mikrotubul:

• cytoszkielet komórki

• ruch chromosomów

• cytokineza w kom. roślinnych

• budowa wici i rzęsek

• transport pęcherzyków

• w kom. zwierzęcych centriole tworzą centrosomy na biegunach wrzeciona podziałowego>> centrioli brak w kom. roślinnych

Dynamika mikrotubul:

• odciąganie chromosomów

• w pobliżu centrów organizacji- promieniste mikrotubule i m. Kinetochorowe łączące kinetochor z biegunem kom.

• dzięki polimeryzacji i depolimeryzacji może odbywać się ruch

Cytokineza w kom. roślinnej:

1. przegroda piewotna

2. ściena >> dzięki ułożeniu wrzeciona po mitozie- proces podziału kom. > pęcherzyki w płaszczyżnie równikowej zlewają się ze sobą - błona - ściana kom.

Mikrotubule stabilne:

• w mitozie mikrotubule dynamiczne

• w budowie wici i rzęski mikrotubule muszą być stabilne>>

• wić - dośrodkowy ruch

• rzęska - rytmicznie uderzają w określoną stronę

• >> w centrum 2 centralne mikrotubule; na obrzeżach dublety mikrotubul

• połączenie mikrtotubul jest dzięki białkom związanym z mikrotubulami - dyneina i heksyna - łączą dublety

• ciałko podstawowe - z tripletów > tu tkwi wić/rzęska - nie ma centralnych 2 mikrotubul

- DOC- centrum organizacji mikrotubul

• centriole - zbudowane z mikrotubul>> mają triplety mikrotubul

• mikrotubule tworzą wrzeciono kineryczne >> wrzeciona 1- odchodzą do chromosomów 2- odchodzą od bieguna do bieguna

• dzięki polimeryzacji i depolimeryzacji mogą być dołączane lub odłączane mikrotubule

Ruch wici/ rzęski- polega na wzajemnym ruchu dubletów mikrotubul między sobą > nie polega na polimeryzacji lub depolimeryzacji.

Białka motoryczne - też uczestniczą w ruchu organelli w komórce

Kinezyny- transportują czastki po mikrotubulach od końca (-) do (+)

Dyneiny- transportują cząstki po mikrotubulach od (+) do (-)

Filamenty pośrenie

• wytrzymałe

• zabezpieczają kom. przed stresem mechanicznym

• nie biorą udziału w ruchu

• są stabilniejsze od mikrotubul i mikrofilamentów

• nie ulegają polimeryzacji i depolimeryzacji

Jest szereg kategorii filamentów pośrednich

• włókna keratynowe(np. a kom. nabłonka)

• desminy (kom. mięśniowe, glejowe)

• NF-L /M/H ( w kom. nerwowych podczas rozwoju systemu nerwowego)

• laminy (we wszystkich kom.)- podściółka pod otoczką jądrową; odbudowywane po mitozie i degradacja

Bialka współdziałające z f. Pośrednimi - tworzą zwykle połączenia np. desmosomy, hemidesmosomy

Np. blakobilina i desmoplakina - łączą f. Pośrednei z błoną kom. i innymi strukturami

>> budowa desmosomu - poszczególne elementy współdziałają np. Filamenty pośrednie współdziałają z mikrotubulami> wzmocnienie komórki

Filamenty aktynowe

• zbudowane z monomerów- dobudowując się umożliwiając polimeryzacje

• składają się z 2 łańcuchów G-aktyny skręconych wokół siebie

• bieguny + i -

• do polimeryzacji konieczna hydroliza ATP

• znakowana miozyna pozwala odróżnić bieguny + i -

Funkcje mikrofilamentów aktynowych:

• ruch wewnątrzkomórkowy

• przemieszcanie się całych komórek

• fagocytoza

• cytokineza w kom. roślinnych (składnik fragmoplastu)

• cytokineza w kom. zwierzęcych (skł. Pierścienia kurczliwego)

• ruch aksoplazmatyczny (na terenie synapsy)

Białka wiążące się z aktyną :

• fascyna - współdziała z aktyną w filopodiach; fibroblasty; kom. ameboidalne>> fascyna wiąże ze sobą filamenty tworząc sieć

• vikina- w kom. erytrocytów

• spektryna - w sieci kortykalnej> łączy f.aktynowe z błoną erytrocytu

• dystrofina - w kom. mięśniowych> łączy filamenty z błoną

• filamina - w płytkach krwi; występuje w pseudopodiach i filopodiach

Ruch wewnątrzkomórkowy

• dzięki połączeniom mikrofilamentów organella przesuwają się w cytoplazmie

• ruch w środowisku>> pseudopodium- dzięki f.aktynowym wypychanie do przodu części komórki>> polimeryzacja i depolimeryzacja aktyny i białek miozyny; przesuwanie się względem siebie

Ruch ameby - skurcz w tylnej części wypycha pseudopodia do przodu

Miozyna współdziała z aktyną

1. związane z ruchem

2. niezwiązana z ruchem (w cytokinezie kom. zwierzęcych)

Mikrofilamenty aktynowe i filamenty pośrednie połączone białkami współdziałają ze sobą.

Cytokineza w kom. zwierzęcej:

- zakłąda się pierścień aktynowy i zaciska się> kom. dzieli się >> elementy aktynowe i miozynowe biorą udział>> transport pęcherzyków za pomocą kinezyn

Pierścień kurczliwy - zbudowany głównie z mikrofilamentów aktynowych, ale także z miozyny (choć to zależy od rodzajów komórek)

Skurcz mięśnia > aktyna + miozyna> główki miozynowe przesuwają się po mikrofilamentach aktynowych

Transport możliwy dzięki: - mikrotubulom i mikrofilamentom aktynowym

Podstawą ruchu jest:

1. proces polimeryzacji i depolimeryzacji

2. współdziałanie tych elementów szkieletowych z białkami motorycznymi; które przekształcają ATP w energię mechaniczną

MACIERZ ZEWNĄTRZKOMÓRKOWA (ECM)

ECM- ściana u bakterii, roślin i grzybów

ECM - u zwierząt- substancja międzykomórkowa; wpływa na rozwój, kształt, uczestniczy w procesach różnicowania i morfogenezy

Peptygoglikan - mureina - z niego zbudowana jest ściana kom. bakterii

• G+ - to co na zewnątrz 1 błona i ściana

• G - dodatkowo jest zewnętrzna błona (cieńsza ściana z peptydoglikanu)

Lipopolisacharydy - na zewnętrznej błonie u bakterii gram (-)

>> intensywność zabarwienia bakterii zależy od grubości i budowy ściany

Chityna - główny składnik ściany grzybów

Ściana kom. roślin:

• chroni i podtrzymuje kom.

• zbudowana z celulozy

• przepuszczalna dla wody i innych cząsteczek

• pierwotna ściana>> tworzona jest najbardziej zewnętrzna warstwa;

• wtórna ściana>> odkładana do wewnątrz

• Blaszka środkowa >spaja sąsiednie komórki

• Celuloza>>ok. 36 łańcuchów celulozy tworzy 1 mikrofibrylę

• Skład ściany: celuloza, hemiceluloza, inne cukry, pektyny

• Hemicelulozy - (glikany wiążące) - b. Podobne strukturalnie do celulozy

• !!! jest różnica w budowie ściany kom. roślin jedno- i dwuliściennych

• apoplast - część martwa; symplast - część żywa

Budowa:

- monosacharydy i ich pochodne kwasowe wchodzące w skład ściany kom. >> celuloza głównym polisacharydem budującym ściany>> cząsteczki celulozy składają się na mikrofibrylę (ok. 36 łańcuchów)>>> ściana budowana jest na zewnątrz- syntaza celulozy, która układa mikrofibryle w pasma>> oplatanie warstwami mikrofibryli komórek>> pektyny wypełniaja przestrzeń między celulozą a hemicelulozą, wypełniają matrix jednocześnie>> u jdnoliściennych brak tych białek u dwuliściennych są białka ekstensyny

Aparat Golgiego- fabryka składników ściany ( roślin)

Macierz zewnątrzkomórkowa u zwierząt zbudowana jest z proteoglikanów

Funkcje ECM:

• mechaniczna - wytrzymałość i elastyczność

• ochronna - zatrzymanie wody, ochrona przed zmianami zewnątrzkomórkowymi

• organizacyjne - kontrola zachowana poprzez wiązanie czynników wzrostowych i interakcje z receptorami na powierzchni

Glikozaminoglikany (GAGS)

Proteoglikan = białko + glikozoaminoglikan np. agrekan >>- białko bogate w serynę, połączone z resztami siarczanowymi GAG's

Kolagen - składnik ECM

• jest 12 typów >> 1 typ nie tworzy struktury włóknistej

• najpowszechniejsze 3 pierwsze typy (I, II, III)

• najczęściej występuje w formie kolagenu I (skóra kości i inne)

• białko włókniste, 3-łańcuchowe, skręcone w potrójną helisę

• kolagen IV nie tworzy włókien !!!- główny składnik błony kom. tworzy sieć.

Białka niekolagenowe ECM: - komórki wiążą się z ECM poprzez fibronektynę i laminę

Błona podstawna:

• warstwa ECM o grubości 20-200 nm jest podściółką komórek nabłonkowych, śródbłonkowych, otacza kom. mięśniowe, nerwowe, tłuszczowe

• pełni rolę strukturalną

• składniki : lamina, kolagen

Lamina- trimer o kształcie szabli , dł. 100nm

Kolagen IV- główny składnik błony podstawnej, nie tworzy włókien

Nidogen- (entaktyna) - tworzy mosty pomiędzy warstwami laminy i kolagenu IV

Perlekan - białka błony podstawnej

Integryny - receptory błonowe, inne niż hormonalne, mają niższe powinowactwo do swoich ligandów; wymagają obecności Ca 2+ i Mg 2+

Połączenie integryn z błoną podstawną:

• bezpośrenie

• poprzez interakcję z aktyną i filamentami pośrednimi

W. 3 BŁONA KOMÓRKOWA- STRUKTURA I FUNKCJE. TRANSPORT PRZEZ BŁONY; EGZO- I ENDOCYTOZA; KONTAKT MIĘDZYKOMÓRKOWY; KONTAKT ZE ŚRODOWISKIEM

• wnętrze komórki podzielone jest na podjednostki; w przedziałach mogą zachodzić różne reakcje

• błona - ograniczona przepuszczalność; regulowany transport metabolitów>> jest dwuwarstwowa- częśc egzoplazmatyczna i endoplazmatyczna >>> w mitochondriach część egzoplazmatyczna jest wewnątrz

skład: - lipidy właściwe, fosfolipidy, białka, lipoproteiny, glikoproteiny

Lipidy złożone:

Fosfolipidy: - glicerofosfolipidy (estry kw. Fosforowego, glicerolu, kw. Tłuszczowych) - sfingolipidy (estry kw. Fosforowego i sfingozyny)

Glikolipidy: - glikoglicerolipidy (cz. Cukrowa + lipid) - glikosfingolipidy (cz. Cukrowa + sfingozyd)

Błona nie jest jednolita, komórki mogą różnić się składem błon.

Fosfolipidy- budują błony; są to estry kwasu fosforowego, gliceryny i kwasów tłuszczowych

-hydrofilowa głowa i hydrofobowy ogon

>> amfifilowe - inne powinowactwo do wody i tłuszczy

• polarność wpływa na właściwości błony

• cząsteczka apolarna>> nie oddziałuje z dipolami wody> będzie odpychać wodę

• cząsteczka polarna (np. aceton) będzie oddziaływała z dipolami wody>>

• nie zawsze lipidy są zbudowane z 2 łańcuchów >> sfingomielina - zamiast 1 kwasu tłuszczowego i glicerolu podstawiona jest sfingozyna i oddziałuje z drugą cząsteczką kw. Tłuszczowego

• części apolarne zbliżają się i zlokalizowane są w środku dwuwarstwy>> na zewnątrz części polarne tworzą sieć z dipolami wody

Wyższe kw. Karboksylowe

• im dłuższy łańcuch węglowy tym sztywniejsza błona

• im więcej wiązań podwójnych = tym błona bardziej płynna

micelle - składają się z jednej warstwy lipidów

liposomy - pęcherzyki wypełnione lipidami

Davison & Danielli - MODEL KANAPKI

• 10- krotna różnica między napięciem powierzchniowym białka a sztuczną błoną z oleju mineralnego; umieszczone na powierzchni roztworu białka zmniejszały napięcie powierzchniowe. Trawienie w proteasomie nie usunęło wszystkich białek.

MODEL PŁYNNEJ MOZAIKI

• białka o charakterze amfiprotycznym mogą oddziaływać z hydro- i lipofilowymi cząstkami

• fosfolipidy mogą się przemieszczać w obrębie błony - to jest płynność

• flipaza - enzym katalizujący przemieszczanie się lipidów w poprzek błony. Flipaza nie przenosi glikolipidów (fuzjujący pęcherzyk może wynieść glikolipid na zewnątrz)>>> flip flop zachodzi bardzo żadko

Siateczka śródplazmatyczna

• synteza lipidów błonowych

• włączanie do błony

• w błonie flipaza katalizuje przemieszczanie się fosfolipidów

• powiększanie się błony

• fosfatydyloseryna i fosfatydyloinozytol - zawsze po wewnętrznej stronie błony

• glikoproteidy - zawsze po zewnętrznej stronie błony

• glikoproteiny - krótkie łańcuchy cukrowe

• proteoglikany- długie łańcuchy cukrowe

Przemieszczanie się białek ograniczają:

• tworzenie agregatów

• wiązania z innymi białkami

Po wymieszaniu detergentu z błoną - rozbija się błona - zastosowanie;

-znakowanie białek

• wykrywanie modyfikacji

Immunoblotting - czy jest dana cyklina czy nie.

Immunoprecypitacja - z przeciwdziałaniem anty np. CDK4

Sekwencjonowanie białek- wycinanie jakiegoś białka trypsyną

• elektroforetyczny rozdział białek w żelu zawierającym SDS

• redukcja mostków disiarczkowych - bo zaburzają migrację białek

• etanol

Białka w błonie komórkowej >> domeny hydrofilowe i hydrofobowe

Białka:

• integralne

• powierzchniowe

• złączone za pośrednictwem innych białek> alfa helisy i beta harmonijki

Funkcja błon:

• transport błon

• aktywnosć enzymatyczna

• przekazywanie sygnałów

• oddziaływania międzykom.

• Kontakt z macierzą pozakomórkową

Przepuszczalność błony lipidowej

• O2 , CO2, N2, benzen >>> dyfuzja

• CH3OH, C2H5OH, H2O >>> dyfuzja >> woda przez akwaporyny

• Aminokwasy, cukry, nukleotydy >> transport, nośniki

• Jony H+, Na+,K+ i inne >>> kanały, nośniki

• Małe nienaładowane cząstki>> swobodne przejście

Transport bierny >> zgodnie z gradientem stężeń>> dyfuzja ułatwiona

Transport aktywny>> niezgodny z gradienem stężeń

Transport bierny:

• nośniki = miejsce wiązania podobne do tego co w substrat-enzym; transport wymusza zmiany konformacji nośnika

• kanały= opierają się na rozmiarach i ładunku jonu; otwarty kanał pozwala na przechodzenie jonów i cząsteczek wody

Otwarcie kanału jonowego:

• impuls elektryczny (Na +, Ca 2+ )

• ligand zewnątrzkomórkowy (receptor acetylocholiny, GABA, gliceryna, ATP)

• ligand wewnątrzkomórkowy (cAMP, cGMP, Ca2+, białka G, fosforylacja)

• naprężenie (drgania akustyczne)

neuron>>impuls elektryczny> otwarcie kanału sodowego>>depolaryzacja>> otwarcie kanału potasowego>> wewnątrz wysokie stężenie K+> pompy wciągają K+ do wnętrza

glukoza- transport bierny - dyfuzja ułatwiona zgodnie z gradientem stężeń

energia do transportu aktywnego pochodzi z hydrolizy ATP

Transport białek

• przez pory w otoczce jądrowej

• przez błony

• przez pęcherzyki

• endocytoza i egzocytoza

Białka z rodziny SNARE

V-SNARE - na pęcherzyku

t- SNARE - na błonie z którą fuzjuje pęcherzyk (t-target)

SNAP- 25

NSF

VAMP

Endocytoza - makrofagi; protisty

Fagocytoza bakterii przez makrofaga wymaga obecności receptorów. Bakterie są opatrzone przeciwciałem, które łączy się z receptorem na powierzchni makrofaga

Fagosomy mogą mieć 250 nm długości

Zaangażowane są: filamenty aktynowe (polimeryzacja, depolimeryzacja)

Lizosomy fuzjują z fagosomami.

Pinocytoza - małe cząsteczki w małych pęcherzykach

Pompa sodowo- potasowa

1 - związanie jonów sodu powoduje fosforylacje

2 - fosforylacja prowadzi do zmiany konformacji pompy

3 - sów uwalniany jest na zewnątrz

4 - potas może wiązać się wewnątrz pompu

5. defosforylacja pompy

6. zmiana konformacji

7. przeniesienie potasu do wnętrz komówki

pompa protonowa>> jony H+ na zewnątrz komórki - ma miejsca wiążące protony - wymaga nakładów energii

3 rodzaje transportu:

UNIPORT - 1 cząsteczka transportowana biernie (glukoza,aminokwasy)

SYMPORT - transport aktywny; 1 rodzaj jonu generuje energię (sód i glukoza)

ANTYPORT- do wewnątrz i na zewnątrz; pompa sodowo-potasowa (Na+/ H+ Na+/Ca2+)

Hipertonic - woda ucieka z komórki kom. kurczy się

Hypotonic - woda wnika do komórki - zwiększa swóje rozmiary

Glukoza może być też transportowana aktywnie - symport

• związanie 1 substancji zwiększa powinowactwo 2 substancji>> brak 1 uniemożliwia transport drugiego

1. transport przez pory w otoczce jądrowej

2. transport białek przez błony

3. transport przez pęcherzyki

Egzocytoza - komórka musi wydzielić białko na zewnątrz (np. neuroprzekaźnik)> na zasadzie fuzji pęcherzyków z błoną; błona zwiększa swoją powierzchnię

> może wydzielać białka ciągle - np. produkcja kolagenów (fibroblasty) podczas wzrostu; limfocyty produkują przeciwciała

> wydzielanie na żądanie - kom. musi odebrać sygnał i ten sygnał mówi, że pęcherzyk musi sfuzjować z błoną np. enzymy trawienne

> transport zachodzi dzięki mikrotubulom wzdłuż mikrotubul

> system indukujący fuzję - każdy pęcherzyk ma kompleksy białek SNARE - kilka rodzajów> kompleks w błonie i te białka oddziałują z białkami po wewnętrznej stronie błony; dochodzi do powstania kompleksu fuzyjnego> fuzja wymaga energii z GTP do GDP> wydzielenie > por fuzyjny

Endocytoza - powierzchnia błony się zmniejsza> pobieranie substancji z zewnątrz

Mikropinocytoza - pobieranie za pomocą wypustek w błonie

Endocytoza za pomocą pęcherzyków> 1 - okryte klatryną (podściełające) 2- nagie

Fagocytoza - pobieranie organizmów> różne rodzaje makrofagów; pierwotniaki (ameba) odżywianie to wymaga receptorów; organizm produkuje przeciwciała zwalczające bakterie> komórka ma odpowiednie receptory- złapią przeciwciała i unieruchomią bakterie> to indukuje powstanie pęcherzyka (fagosom)> z nim mogą fuzjować lizosomy> fuzja prowadzi do powstania fagolizosomu> może fagocytować np. drobinki węgla - rozpoznaje na zasadzie receptorów> nie zawsze radzi sobie z trawieniem; pozostają resztki lub usuwane są na zewnątrz

Pinocytocytoza - pobieranie mniejszych cząsteczek> mniejsze pęcherzyki> błona się zagłębia

>zależna od receptorów, gdy kom. chce pobrać określoną substancję> pęcherzyki opłąszczone> gromadzi białka klatryny oderwanie pęcherzyków wymaga energii> tworzenie pęchezyka> oddziaływanie subst. Z receptorem> przykład endocytozy zależnej od receptorów> pobieranie LDL > transport cholesterolu> adaptyna>opłaszczony pęcherzyk>jony żelaza łączą się z transferyną> czynnik wzrostu np. EGF

Transcytoza > kom. transportująca istotna istotna u noworodków> przeciwciała do przewodu z mlekiemmatki i przez komórki jelita do krwioobiegu

Endotelium - nabłonek wyściełający naczynia krwionośne> pobierają substancję na zasadzie tworzenia kaweol (zagłębienia)

W. 4 ODDZIAŁYWANIA KOMÓRKA-KOMÓRKA; KOMÓRKA - MACIERZ POZAKOMÓRKOWA.

Białka zaangażowane w oddziaływania międzykomórkowe lub między komórkami a macierzą pozakomórkową.

Aby pełnić funkcję białka muszą być aktywowane

• cząsteczki zależne od Ca2+ - KADHERYNY, SELEKTYNY

• cząsteczki niezależne od Ca 2+ - Ig- CAM, INTEGRYNY

• cząsteczki zależne od innych jonów - INTEGRYNY (głównie Mg)

białka adhezyjne: Ig CAM i integryny

Białka:

1. Ig - CAM

2. INTEGRYNY

3. KADHERYNY

4. SELEKTYNY

5. SYNDEKANY

CAM - cell adhesion molecule

• liczne domeny immunoglobulinowe (pętle w białku)

• 1 lub więcej domen fibronektyny typu B

• większość białek z tej rodziny tworzy dimery, które mogą oddziaływać z ligandami w sąsiednich komórkach

• CAM- Ig mogą oddiaływać z innymi integrynami i macierzą

• Różne tkanki; różne białka adhezyjene >> N-CAM - w nerwowych; V-CAM- w kom. endotelium

INTEGRYNY

Funkcje:

• Zaangażowane w sygnały

• W postaci dimeru (podjednostka alfa i beta)

• Białka transbłonowe

• W części na zewnątrz są sekwencje aminokwasów, które rozpoznają sekwencje w białkach macierzy pozakomórkowej (sekwencje RGD)

• Obecność Mg 2+ zwiększa powinowactwo do białek z którymi oddziałują (ligand - wiąże się z receptorem)

• Rozpoznają białka macierzy i zakotwiczają kom. w środowisku

• adhezja międzykomórkowa

• przekazywanie sygnału do jądra komórki

• migracja

• integryny składająs ię s dwóch podjednostek alfa i beta ( związane są niekowalencyjnie); jest wiele podjednostek jednego i drugiego typu

• cytoplazmatyczny ogon integryn pośrednio lub bezpośrednio łączy się z cytoszkieletem;

• obecność Mg 2+ wpływa na powinowactwo integryn wobec ich ligandów

• związanie integryny z ligandem w błonie podstawnej - płytka przylegania>> aktywacja kinazy FAK (focal adhesion kinase)- kinaza płytek przylegania>> kinaza aktywuje szlaki przekazywania

Transbłonowe receptory tworzące połączenia

Desmosomy>> komórka-komórka>> płytki przylegania

Ligandy:

• fibronektyna, fibryna

• trans-glutaminaza

• endostatyna

• ADAM-15

Różne tkanki syntetyzują różne integryny

• integryny z aktyną łączą się za pośrednictwem alfa-aktyny lub taliny, filaminy lub winkuliny

Udział integryn w przekazywaniu sygnału:

• związanie integryny z ligandami w błonie podstawnej; płytka przylegania; aktywacja kinazy FAK (focal adhesion kinase) - kinaza płytek przylegania, połączenie z kinazą

Aktywacja kinazy:

• migracja komórek

• poliferacja

• apoptoza

• różnicowanie

KADHERYNY

• oddziałują homofilnie

• ich aktywność zależna jest od obecności jonów Ca 2+

• tworzą dimery- domeny wewnątrzkomórkowe

• łączą się poprzez alfa i beta kataniny, plakoglobinę i białko p120 z:

• cytoszkieletem aktynowym (w miejscach adhezji, komórka - macierz i w desmosomach pasowych)

• filamentami pośrednimi (w desmosomach)

Przekazywanie sygnału do jądra komórkowego - B- kateniny

• E - kadheryna - >swoista dla komórek nabłonkowych; odpowiedzialna za utrzymanie spójności tkanek nabłonka

• Kadheryny łączą się z kadherynami tego samego typu > kadheryna E łączy się z kadheryną E itd.

SELEKTYNY

• funkcjonalnie zależne od Ca 2+

• wiążą reszty cukrowe

• rozpoznają specyficzne reszty cukrowe związane z białkami (glikoproteiny) lub z lipidami (glikolipidy)

• biorą udział w emigracji leukocytów

• często na komórkach endotelium oraz w limfocytach>> oddziaływanie poprzez nacz. Krwionośne do tkanek

• zdolność do wiązania się z białkami

• rozpoznają cukry (glikoproteiny)

• oddziałują z aktyną

• wchodzą w skład struktur łączących komórki

SYNDEKANY

• zbudowane z przecinających błonę domen

• pętle zewnątrzkomórkowe oddziałują z integrynami

• CD8- udział w fuzji błon plemnika i oocytu ssaka

KOMUNIKACJA MIĘDZYKOMÓRKOWA

Typy połączeń:

1 - połączenia barierowe (zamykające) - brak szczelin między błonami

> u niemożliwia rozerwanie

1. styk zwarty; połączenie ścisłe

2. obwódki zamykające

3. plamki zamykające

Integralne białka sąsiadujących błon

2) Połączenia mechaniczne - szczelina szerokości ok. 15-25 nm.

1. desmosom pasowy; obwódka przylegania

2. desmosom dyskowy (plamkowy, punktowy)

3. hemidesmosom (półdesmosom)

3) Połączenia komunikacyjne - szczelina ok. 2 nm.

1. połączenia szczelinowe

Połączenia ścisłe - zamykające

• uszczelniają sąsiednie komórki

• zapobiegają przepływowi cząsteczek między komórkami

• występują w kom. nabłonkowych

• odpowiedzialne za polarność nabłonka w części apikalnej

Obwódka przylegania:

• łączą wiązki aktyny w jednej komórce z podobnymi wiązkami w sąsiednich komórkach

• * KADHERYNY

Desmosom - plamka przylegania

• łączy filamenty pośrednie dwóch sąsiednich komórek * KADHERYNY (ale nie alfa i beta)

Hemidesmosom - półdesmosom

• kotwiczą filamenty pośrednie komórki w błonie

Połączenie szczelinowe komunikacyjne

• pozwalają na przechodzenie małych cząsteczek i jonów rozpuszczalnych w wodzie.

Oddziaływanie homofilowe - takie same z takim samym

Heterofilowe - inne z innym; selektyna z innym

Połączenia:

BARIEROWE

• endotelium

• uszczelniaja komórki

• zapobiega przepływowi cząsteczek między nimi

• w nabłonku

• kom. spolaryzowane

• zależy od okludyny> zonula ocluden> to oddziaływanie > zakotwiczenie mechaniczne

MECHANICZNE

• łączą wiązki aktyny

• kadheryny> za pośrednictwem alfa i beta kateniny łączą się z aktyną

• plamka przylegania w odróżnienu od obwódki nie zakotwicza się w aktynie tylko w filamentach pośrednich

KOMUNIKACYJNE >> gap junction

• pozwalają na przechodzenie małych rozpuszczalnych w wodzie jonów i cząsteczek

• nie zawsze są otwarte

W. 5 PRZEKAZYWANIE SYGNAŁÓW

>> odebranie, przekształcenie, reagowanie; reakcje w zmianach aktywności genomu

> białka enzymatyczne>> zmiana kształtu komórki

> sygnał może działać na swój cel bezpośrednio lub pośrednio.

Bezpośrednio - sygnał transportowany jest przez błonę komórkową do wnętrza komórki i tam oddziałuje na określone białka

Pośrednio - za pośrednictwem receptora>> hormony sterydowe>> na powierzchni komórki musi związać się z cząsteczką za pośrednictwem receptora np. rozpuszczanie w tłuszczach; steryd przenika przez błonę i w komórce musi być receptor

• aktywacja genu

• lipidy nie wiążą się z DNA, dlatego musi łączyć się z receptorem

• >> sygnał pozakomórkowy>> no. Mitogen, ligand wiąże się z receptorem> połączenie stanowi przekształcenie>> to połączenie indukuje przekaźniki które mogą aktywować lub blokować aktywność enzymów>> zmieniać ekspresję genów> oddziałują na białka cytoszkieletu

• Jeżeli sygnałem jest białko, zazwyczaj przekazywane jest pośrednio

• Jeżeli sygnałem są cukry (np. glukoza, laktoza, operon laktozowy, lipidy, hormony sterydowe) - przekaz bezpośredni

Przekazywanie

1. percepcja

2. wzmocnienie

3. transdukcja

4. odpowiedź

>> sprzężenie zwrotne dodatnie lub ujemne

>> wiele lub jedna odpowiedź

Przekazwyanie sygnałów - substancje rozpuszczalne w tłuszczach, np. hormony sterydowe

Sygnał pozakomórkowy> białko receptorowe> białka wewnątrzkomórkowe/cząsteczki przekaźnikowe> enzymy>modyfikacja metabolizmu>

Sygnał> recepcja>transdukcja>odpowiedź

Sygnał dociera do komórek odbiorców:

• endokrynowo

• parakrynowo

• autokrynowo

niskie stężenie przekaźnika> receptory na powierzchni kom.> wysokie stężenie przekaźnika

przekaźniki to „wtórne” cząsteczki informacyjne

• diacyloglicerol

• trójfosforan inozytolu

• cykliczny AMP

• cykliczny GMP

• jony Ca 2+

Sposoby przekazywania:

• z udziałem GTPaz > nieaktywna kiedy związana z GDP; aktywna kiedy związana z GTP

• z udziałem kinaz białkowcych

• z udziałem białek adaptorowych

Przekazywanie sygnałów za pośrednictwem:

1. cząsteczek związanych z błoną - integryny>>> receptory

2. połączeń międzykomórkowych>> integryny; kadheryny

3. wydzielone przez komórki cząsteczki

4. oddziaływania ruchome

AD 1

Integryny

• nieaktywne w błonie> łączy się z macierzą> sygnał może zaindukować łączenie się z macierzą

• nieaktywna>> obok niej receptor sygnału

• połączenie aktywuję integrynę

• związanie z macierzą zaindukuje zmianę

Receptory:

• zmiana w innej cząsteczne wewnątrzkomórkowej

• kinaza może fosforylować cząsteczki i przekazywać sygnał dalej

• receptor wiąże się z czynnikiem wzrostu>> kinaza działa na substancje> powstają przekaźniki i docierają do jądra i aktywują transkrypcję

1. związana z białkami G

2. kinazy tyrozynowe

3. kanały jonowe

4. związanie z kinazami tyrozynowymi

czynniki wzrostu>> pobudzają podziały

CYKLAZY

• jeśli receptorem może być enzym to związanie sygnału powoduje aktywację>>> hydroliza GTP i może pojawić się przekaźnik

• receptory oddziałujące z białkami G>>> kompleks 3 podjednostek alfa, beta , gamma>> aktywacja receptora prowadzi do połączenia z białkami G> oddziałuje na białka efektorowe>> pojawiają się wtórne przekaźniki>> powoduje to reakcję

• cyklaza adenylowa>> powstanie cAMP

Efekt biologiczny:

• masowa fosforylacja białek w kom.

Fosfolipaza c - hydrolizuje ufosforylowane lipazy

• receptory związane z białkami G aktywują wewnątrzkomórkowe białka G, które łączą się z GTP i za pośrednictwem hydrolizy GTP do GDP (uwolnienie energii) wpływają na przebieg reakcji biochemicznych.

• Białka G będą aktywne tak długo jak długo związany jest receptor z sygnałem

• GTP aktywuje białko, które łączy się z GPCR, G proteins comled receptors

• Fosfolipaza - enzym katalizujący hydrolizę fosfolipidów inozytolowych >>> za pośrednictwem białek G aktywacja fosfolipazy C

• Fosfolipaza C = PLC

• IP3 pełni rolę regulatora cytoplazmatycznego stężenia jonów Ca 2+

• PLC - zawira dwie domeny SH2 >> białka zawierające domeny SH2 - to białka uczestniczące w przenoszeniu informacji przez błonę komórkową od receptorów na układy efektorowe, określane jako domeny SH2 i SH3

• Domeny SH2 - sekwencje zbudowane z ok. 100 jednostek aminokwasowych

Przekazywanie sygnałów

Kinazy tyrozynowe - receptory związane z kinazami tyrozynowymi

GEF - Guanine nucleotide Exchange Factors > czynniki stymulujące wymianę składników guaninowych

• GAPs - GTPas Activating Proteins - stymulują RAS do hydrolizy GTP

• Kompleks Ras - GTP ma zwiększone powinowactwo do białek na które oddziałuje ( E-efektor)

SZLAK MAP KINAZY ERK1/ ERK2

MAP kinaza - kinaza aktywowana za pośrednictwem mutagenów

Ras>> Raf>> MEK>> ERK>> do mRNA> DNA

Fosforylacja ERK - aktywacja innych kinaz, białek strukturalnych

Ras>>Raf (MAPKKK)>> MEK1 (MAPKK)>> Erk1/Erk2 (MAPK)>>>RCK, MISS

Przekazywanie sygnałów:

1. stan spoczynku

2. podział

3. różnicowanie

4. apoptoza

Komórka musi mieć receptor, żeby odebrać sygnał. Może nie zareagować na sygnał lub kom. pozostanie w stanie spoczynku. Inne sygnały pobudzają ją do podziału lub powodują różnicowanie.Często gdy nie docierają żadne sygnały dochodzi do apoptozy- programowanej śmierci.

• sygnał odbierany przez białko receptorowe> połączenie> pojawienie się cząsteczek przekaźnikowych>> wzmocnienie za pomocą cząsteczek sygnałowych

• niektóre sygnały docierają bezpośrednio do komórek

Szlak przekazywania za pośrednictwem białek G>> musi być receptor tych białek>> po połączeniu z receptorem to aktywuje białka G

>> podwyższony poziom cAMP, cGMP, Ca2+, DAG, IP3

GPCR - receptor

>> sygnał przekazywany za pośrednictwem białek G gdy są: aminy biogenne; jony, i aminokwasy, lipidy, peptydy, białka, inne: światła, feromony, nukleotydy

• rozpad trimeru na dimer

• otwarcie kanałów jonowych beta i gamma

• cyklazy adenylowa

• alfa- podjednostka stymulująca enzymy

• aktywacja białek G prowadzi do pobudzenia różnych szlaków

przekazywanie za pomocą kinaz tyrozynowych

1. połączenie zygnału z kinazą >> aktywacja kinazy>>fosforylacja innego białka i jego aktywacja

2. aktywacja kinazy powoduje aktywację innej kinazy

3. aktywacja innych enzymów>> fosfolipaza - trawi fosfolipidy

Szlak MAP kinazy

• kinaza aktywowana przez sygnał z zewnątrz> pobudzenie poddziału komórki

• białko RAS - kluczowe dla uruchomienia szlaku MAP kinazy

• kinaza zależna od kalmoduliny

• jony Ca2+ mogą bezpośrednio aktywować kinazę

PKA - kinaza białkowa aktywowana za pomocą białek G>> 4 podjednostki - 2 regulatorowe a 2 katalityczne

Fosfatazy>> usuwają reszty fosforanowe

Kinazy tyrozynowe

• aktywacja bezopośrenida

• aktywacja za pośrednictwem innej kinazy

Różnicowanie

• pluripotencja - komórka może się przekształcić w wiele rodzajów komórek

• specyficzne tkankowo komórki macierzyste

• jak zachować totipotencje>> LIF >>>> NANOG - gen niezbędny by komórka miała niezrównoważony charakter

Ektoderma

• epidermalne kom. macierzyste

Mezoderma

• komórki macierztyste mięśnia sercowego

• komórki macierzyste mięsni szkieletowych

• komórki macierzyste krwi (szpik kostny)

Endoderma

• kom. macierzyste wysepek trzustkowych

• kom. owalne wątroby

Komórki liniii płciowej

• pierwotne komórki płciowe

Kolonie mysich komórek ES

• in vitro - biorą udział w tworzeniu wszystkich tkanek łącznie z komórkami płciowymi

• in vitro - różnicują się w różnego rodzaju komórki łącznie z komórkami płciowymi

• zachowują normalny kariotyp

• przechodzą nieograniczoną liczbę podziałów komórkowych, bez utraty niezróżnicowanego charakteru

• BMP - czynnik morfogenezy kości

• GSS - czynnik stymulujący powstawanie kolonii danego rodzaju

• Wszystkie tkanki mają zdolność podziału ( kanarek co roku uczy się śpiewu godowego > dowód)

Skąd biorą się sygnały:

ENDOKRYNOWO- substancje produkowane w komórce mogą być transportowane za pośrednictwem naczyń krwionośnych do kom. docelowych>> komórka musi mieć receptor na odpowiednie hormony

PARAKRYNOWO - lokalnie kom. produkują substancję odbieraną przez komórkę w najbliższej okolicy; komórka musi mieć receptor

AUTOKRYNOWO - kom. sama pobudza się do produkcji sygnału> sprzężenie zwrotne negatywne

>> Odebranie sygnału nie wystarcza do uruchomienia reakcji> pojawienie się przekaźników drugiego rzędu

>> przekaźnikiem mogą być różne substancje : jony wapnia , nukleotydy, cAMP, cGMP, diacyloglicerol, trójfosforan inozytolu

Drogi przekazywania sygnału:

1. z udziałem GTPaz > enzymy przekształcające GTP do GDP> białko Ras

2. z udziałem kinaz białkowych > enzymy przenoszą resztę fosforanową na białko na wybrane aminokwasy>> serynowo-treoninowe; tyrozynowe>.. kinazy fosforylują białka

3. białka adaptorowe>> receptor zmieni konformację

W. 6 CZYNNIKI REGULUJĄCE PRZEBIEG CYKLU KOMÓRKOWEGO

Faza G1 - chromosomy jednochromatydowe, wzrost,

Faza S - replikacja

Kom. w stanie spoczynku>> faza G0> nie dzieli się

1858- Rudolf Virchow - „Omnis cellula e cellula”

> każda komórka powstaje z komórki macierzystej

• cykl kom. - od podziału do podziału

- powstanie komórek potomnych

• wzrost i rozwój organizmu

• dziedziczenie i ewolucja

> w świecie istot żywych podstawowe cechy cyklu komórkowego są wspólne dla wszystkich.

• komórka musi urosnąć żeby się podzielić>> komórki dzielące się całe życie: nabłonka, kom. macierzyste krwi (powstają w szpiku kostnym), komórki rozrodcze

• punkty kontrolne - mechanizmy kontrolujace prawidłowy przebieg faz cyklu kom.

• R - punkt gwarantuje, że kom. będzie kontynuować zmiany w cyklu> duży poziom białek regulacyjnych> jeśli kom. przekroczy R - rozpocznie fazę S>> mechanizmy sprawdzające replikację> kom. przekroczy punkt fazy S (czy DNA prawidłowo zreplikowane)> faza G2 i mitoza> punkt kontrolny M>> czy prawidłowa kondensacja chromosomów; płytka podziałowa

Regulatory cyklu komórkowego:

• cykliny

• kinazy CDK - kinazy zależne od cyklin

• kinazy serynowo- treoninowe> kinazy fosforylują białka tylko na serynach i treoninach

• oocyty nie rozpoczną mejozy zanim nie podziała na nie progesteron żaby

MPF- M-phase Promoting Factor - czynnik indukujący mitozę i mejozę lub SPF - dla fazy S

- zidentyfikowane białka w drożdżach - geny z drożdży cdc 28 cdc 2

CDK1 - pierwsza kinaza serynowo-treoninowa

(p34 cdc2) białko - p masa w kilodaltonach- 34 cdc2- nazwa genu kodującego

• pierwsze cykliny odkryte u jeżowca>> w cytoplazmie zarodków pojawia się i znika białko cykliczne

Mechanizm regulacji aktywności kinaz CDK - cyklina

1. synteza cykliny

2. utworzenie kompleksu CDK z cykliną

3. ufosforylowanie tyrozyny 161 - kinaza CAK ( CDK7 - cyklina - 4-MAT-1)

4. defosforylacja treoniny 14 i tyrozyny 15 > fosfatazy z rodziny cdc 25

5. odłączenie inhibitorów ( CKI/ CINK4/ CIP/KIP)

- kompleks przyłącza inhibitory

• potrzebne jest > ufosforylowanie jednego z aminokwasów

• CAK - kinaza też CDK zależna od cykliny

• CDK1 jest fosforylowana przez inne kinazy na resztach aminokwasowych

• Fosfatazy - defosforylują

• >>> jeśli spełnione jest tych 5 warunków to pojawia się aktywny enzym; przed fazą S lub M

• cykliny są niszczone podczas podziału

CYKLINY:

• sekwencja „cyclin box” - domena odpowiedzialna za wiązanie z CDK - kinazą

• białko ma n-koniec i c-koniec

• na n-końcu na którym NH3+ zawierają domenę D „destruction box”- sekwencja odpowiedzialna za destrukcję >> gwałtowna degradacja w mitozie>> jeśli usuniemy tę domenę to aktywność CDK1 będzie na tym samym posiomie

• różne sygnały np. CRS - białko powinno pozostawać w cytoplazmie; fosforylacja powoduje że białko idzie do jądra

• cykliny A i B - mitotyczne >>> D na n - końcu

• cykliny D i E - interfaza>> nie mają domen D tylko sekwencję PEST- odpowiedzialna za destrukcję na c-końcu; mówią, że degradacja w fazie S, G1

• poziom cykliny B rośnie i spada w interfazie

• podobny poziom inne cykliny

• wyjątkiem cykliny D - poziom wysoki przez cała interfazę, tak długo jak działają czynniki wzrostu>> cyklina pojawia się pierwsza> aktywuję kinazę

• NIS - usuwa cyklinę z jądra komórkowego „Nuclear Import Signal”

• Cykliny sieroce - nie znamy funkcji ani partnera

KINAZY Z RODZINY CDK - CECHY:

• przy c-końcu domena odpowiedzialna za oddziaływanie z cykliną

• kompleks zależny od cykliny D aktywny tylko w przejściu G1/S

• kinacy cdk posiadają domenę, za pomocą której oddziałują z domeną cyklinową

kinaza cdk faza

A cdk2 S

A cdk1 M

B cdk1 M

D cdk4 G1

D cdk6 G1

E cdk4 S

C cdk3 G1

H cdk7

MAT1

CAK - główny enzym aktywujący inne kinazy

Inne białka mogą aktywować cykl komórkowy

Np. 1) - cykliny wirusowe>> mięsak Kapossiego> cyklina k zastępuje cykliny D i aktywuje kinazy; nie można ich wyłączyć

>> mysi homolog cyklin> guzy mięsaki

>> aktywacja kompleksu zależy od fosfataz, które usuwają reszty fosforanowe>> kinacy mają charakterystyczne fosfatazy

2) białka p35 i p39 > aktywują CDK5 w mózgu- istotna rola w komórkach nerwowych, które przestały się dzielić

3) białka RINGO/ speedy

CAK kinaza wszystkich kinaz>>> życie we trójkę>. Kinaza CDK działa we trójkę ( cyklina H, cdk7 i MAT1)

Po co fosforylacje/ defosforylacje?

• wolny CDK - pętla T blokuje dostęp substratu do enzymu

• CDK + cyklina - przemieszczanie się pętli T

• Fosforylacja> kinaza aktywna

• >>> pętla T - blokuje dostęp substratu do enzymu> związanie z cykliną powoduje przemieszczenie pętli T>> fosforylacja powoduje dalsze przemieszczenie pętli T

INHIBITORY

INK- p16 (specyficzne; blokują tylko kinazy zależne od cykliny D) oraz KIP/CIP - p25 kip1 (blokują pozostałe kinazy)

>> mutacje w genie INKa w wielu nowotworach; komórka ciągle się dzieli

>> cykliny wirusowe> łączy się z enzymem> kompleks jest niewrażliwy na inhibitor> rozwój guzów

>> białko pR6- produkt genu supresorowego nowotworu retinoblastoma>> nowotwór siatkówczak> agresywny; złośliwi; jeśli nie usunięty powoduje śmierć>> przerzuty do kości czaszki,kończyn, wątroby rdzenia kręgowego>> objawy: biały odblask z dna oka.zez.

E2F (+PRB) - czynniki transkrypcyjne - regulują transkrypcję genów związanych z dalszymi etapami. Jeżeli dojdzie do aktywacji szlaku. Ufosforylowanie retinoblastoma. PRB traci powinowactwo do E2F i mogą stymulować transkrypcję . są uwolnione

KOMPLEKS CYKLINA E I CDK2

• rospoznaje substraty

• fosforyluje własne inhibitory i aktywuje fosfatazt

• aktywuje czynniki transkrypcyjne i odpowiedzialne za biosyntezę histonów

• reguluje składanie mRNA

• reguluje transkrypcję

• inicjuje biosyntezę histonów

• duplikacja centrosomów (na biegunach wrzeciona 1 centrosom w kom. potomnych> gdy 2 centrosomy- dwubiegunowe wrzeciono)

Podziały kom. inicjowane przez mitogen

Punkt restrykcyjny - czynnik mitogenny musi działać odpowiednio długo aby komórka mogła przejść ten punkt - to umożliwia wzrost cykliny D

Główni gracze:

• cykliny

• kinazy CDK (Cyclin Dependent Kinase)

• kinazy serynowo-reoninowe

>>> Dr Mashi wykrył białko potrzebne do dojrzewania oocytów oraz podziałów zarodka żaby (Rana pipiens) które nazwał MPF>> wykazał, że w cytoplazmie komórek znajdujących się w fazie M znajduje się czynnik indukujący fazę M, po fuzji komórki w fazie M z komórką w fazie G1 lub G2

>później wykazano że MPF znajduje się także w oocytach myszy>> cytoplazma z dzielącej się komórki+ niedojrzały oocyt> pobudzenie do rozwoju tego oocytu dzięki obecności MPF

REPLIKACJA DNA

• każdy łańcuch jest polarny > grupa 3' - hydroksylowa i 5' - fosforanowa

• nici są antyrównoległe

• komplementarne łańcuchy polinuklotydowe (A-T G-C)

• oktamery z 4 różnych histonów

• rolę stabilizującą pełni histon H1> to w jaki sposób H1 oddziałuje to warunkuje układ chromatyny

• genom, człowieka 22 autotomy i 2 chromosomy płci > 46 chromosomów

• mechanizmy replikacji podobne u prokariotów

• eukariota - większy genom> bakterie 1 cząsteczka

• replikacja w określonych miejscach - ORI- start replikacji

• u bakterii 1 ori u człowieka bardzo wiele ori

• bakterie i eukariota>> silna kontrola mechanizmów regulujących cykl komórkowy

• ważny jest kompleks ORC - zapewnia że każdy replikon będzie replikowany tylko jeden raz

ENZYMY REPLIKACYJNE (ETAPY)

1. lokalne rozplecenie helisy, musi dojść do „stopienia” helizy>> HELIKAZY - korzystając z energii pochodzącej z ATP - rozplatają helisę; przesuwają rozpleciony region

2. naprężenia są redukowane przez TOPOIZOMERAZY

3. repikacja bardzo dokładna i szybka

4. DNA replikują POLIMERAZY

5. Końcówki nici - TELOMERY powielane są przez TELOMERY

6. Rearanżacją genomu katalizują REKOMBINAZY

7. enzymy naprawiające uszkodzone DNA

8. LIGAZY - łączą końce DNA w rejonach dwuniciowych

Rozplatanie podwójnej helisy:

TOPOIZOMERAZY odpowiedzialne są za relaksacje struktur superhelikalnych; enzymy katalizujące przecinanie i łączenie nici DNA

>> topoizomerazy typu IA, IB - przecinają jedną z nici DNA - ligacja> liczba skrętów łańcucha zmniejsza się o jeden

>> topoizomerazy typu II - przecinają jednocześnie oba łańcuchy- zmiana liczby skrętów o dwa >> topoizomeraza II z E. Coli, eukariotyczne topoizomerazy II i IV

Replikacja > przygotowywanie do replikacji z ori łączą się kompleksy białkowe

ORI > białka rozpoznające miejsca ori ( origin recognisation complex)>> łączą się z DNA > połączenie niestabilne do momentu połączenia cdc6 > stabilizator połączenia>> po utworzeniu kompleksu pojawiają się MCM - białka licencjonujące replikację, dopiero teraz może się zacząć

SCDK - kinazy fazy S

CDK2 - czynnik fosforyluje cdc6

MCM - umożliwia oddziaływanie polimerazy z DNA

GO- nie ma białek

G1 - synteza MCM i ich związanie z chromatyną

S - ORC; rozwijanie chromatyny; MCM licencjonuje replikację>> MCM są fosforylowane i tracą kontakt z chromatyną

G2- wiązanie białek MCM z chromatyną aż do następnego cyklu

TOPOIZOMERAZY

I - przecinają DNA w jednym miejscu

II - przecinają DNA w dwóch miejscach

Możliwe rozkręcenie odcinka DNA

ETAPY REPLIKACJI

INICJACJA > rozpoznanie miejsc rozpoczęcia replikacji - ori - kompleksy białkowe> orc, helikazy, łączą się z DNA> białko cdc6 > MCM - licencjonowanie chromatyny>>>> rozplecenie łańcucha - białka inicjujące, białka orc - kompleks licencjonujący replikacji>>> zawierają głównie pary A-T mniej wiązań wodorowych (2) niż G-C (3) łatwiej rozpleść

• u bakterii białka SSB> białka wiążące jednonicowy DNA u niemożliwiają łączenie się odseparowanych nici DNA

• s.cerevisiae - 300 miejsc inicjacji replikacji (co 40 kb DNA); ori - ok. 100-200 par zasad (40 par zasad miejsca wiązania kompleksu rozpoznającogo ORC - origin recognisation complex)

• człowiek 10 000 - 10 000 miejsc inicjacji replikacji (co 150 kb DNA) białka ORC

• u bakterii ori replikacji zakotwiczone w błonie komórkowej

ELONGACJA> wydłużanie nici DNA> polimery DNA; synteza w kierunku 5'>>3'

• nić prowadząca (wiodąca)- kopiowana w sposób ciągły

• nić opóźniona - kopiowana w postaci krótkich fragmentów (fragmenty Okazaki)

• >> polimerazy DNA niezdolne do inicjacji syntezy na jednoniciowej matrycy>> musi istnieć wolny koniec 3' OH - konieczna synteza STARTERÓW

• POLIMERAZY DNA >> synteza 5'>>>3' >> ale takżę aktywność egzonukleazy 3'>>5' (aktywność korekcyjna)>> ale także aktywność egzonukleazy 5'>>3' (bakterie)

TERMINACJA> zakończenie replikacji

WAŻNE

KIERUNEK REPLIKACJI: polimerazy działają tylko 5' >>> 3' niektóre mają aktywność (aktywność korekcyjna) EGZONUKLEAZY >> gdy polimeraza się pomyli to można wyciąć pomyłkę; wycinanie odbywa się 3' >>> 5' u bakterii wycinają w kierunku 5' >> 3'

• jedna nić syntetyzowana ciągle a druga musi być w postaci fragmentów

STARTER - polimerazy nie potrafią rozpocząć syntezy DNA> konieczna jest synteza starterów> polimerazy RNA umieją syntetyzować od nowa; dlatego startery są zbudowane z RNA

PRYMAZY- syntetyzują startery (5-nukleotydów)

Do startera przyłącza się polimeraza DNA >> u eukariota też> polimeraza DNA alfa

>> komplementarne łańcuchy polinukleotydowe, połączone wiązaniami wodorowymi>> deoksyryboza + reszta fosforanowa + zasada azotowa

• chromosomy organizmów eukariotycznych zlokalizowane są w jądrze ; DNA jest silnie upakowany>> rozwinięta nić DNA - kilka centymetrów

• ciemne prążki na chromosomach widoczne są w regionach bogatych w A - T

• oktamer: 2x H2A, 2xH2B, 2xH3, 2xH4

Wygląd chromosomów w fazie:

G1- 1 suwak

G2- 2 suwaki

Rozpoczynanie syntezy - fragmenty STARTERY

• polimerazy DNA - wymagana obecność dwuniciowego DNA

• bakterie> polimeraza RNA - PRYMAZA - startery>> długości 5 nukleotydów

• eukariotyczne - polimeraza DNA - podjednostka o aktywności prymazy

• 10 nukleotydowe startery DNA> polimeraza alfa kontynuuje replikację

• nić prowadząca - 1 starter

• nić opóźniona - wiele starterów

Fragmenty Okazaki

>> bakterie - 1000 - 2000 nukleotydów

>> kom. eukariotyczne - 200 nukleotydów (pojedynczy nukleosom)

Usuwanie starterów:

• bakterie - polimeraza DNA

• kom. eukariotyczne - brak egzonukleazy o aktywności 5'-3' >> endonukleaza FEN1

Widełki replikacyjne

>> polimeraza DNA III syntetyzuje DNA aż do startera - jej łączenie z DNA stabilizowane jest przez podjednostkę beta

>> polimeraza DNA I - aktywność egzonukleazowa 5'>>3' wycina starter RNA i kontynuuje syntezę DNA

>> ligaza łączy fragmenty DNA nici opóźnionej

>> polimeraza alfa - nie łączy się z nią żadne białko stabilizujące jej oddziaływanie z DNA, synteza primerów i krótkich odcinków DNA (30 nukleotydów)

>> polimeraza beta - główny enzym elongacyjny; jego oddziaływanie z DNA stabilizowane jest przez białko PCNA>> korekcja błędów - aktywność egzonukleolityczna 3'-5'

>> usuwanie starterów - endonukleaza FEN 1

>> telomeraza wydłuża nić opóźnioną

* genomy bakteryjne

• rozpoczęcie zawsze w tym samym miejscu

• zakończenie - sekwencje terminacyjne (terminatorowe)

• E. Coli 7 takich sekwencji - łączą specyficzne białka (Tus)

* genomy eukariotyczne

• wiele miejsc ori - łączenie zreplikowanych fragmentów

TELOMERY

• setki tandemowo ułożonych powtórzeń sześcionukleotydowych sekwencji; jedna nić jest nieco dłuższa - przewaga G; komórki ludzkie AGGGTT (zawijanie regionu na końcu chromosomu)

TELOMERAZA

-transkryptaza zawierająca matrycę RNA

Regulacja replikacji - cykl komórkowych

• mechanizm replikacji podobny u prokaryota i eukaryota

• kom. eukariotyczne> dużo większe genomy; człowiek 23 pary liniowych chromosomów- 6 mld. Par zasad azotowych

• replikacja DNA pod ścisłą kontrolą mechanizmów regulujących cykl komórkowy; kompleks ORC zapewnia, że każdy replikon będzie replikowany tylko 1 raz

W. 7 EKSPRESJA GENÓW - TRANSKRYPCJA I TRANSLACJA

ORC - origin recognition complex> białka specyficznie rozpoznają region początku replikacji (ori)

CDC6 - zwieksza stabilnosć związanego z chromatyną ORC>> konieczne aby z DNA mogły się związać białka MCM 2-7 czyli czynniki licencjonujące replikację

CDT1 - razem z cdc6 konieczne do związania MCM

G0 - komórka w stanie spoczynku, brak syntezy MCM

G1 - synteza MCM i ich związanie z chromatyną

Replikacja DNA>> powstanie kompleksu prereplikacyjnego, początek fazy S

>> MCM rozwijaja chromatynę> zachodzi replikacja>>> MCM są fosforylowane i tracą kontakt ze zreplikowaną chromatyną

G2/M - wiązanie białek MCM z chromatyną jest nie możliwe aż do następnego cyklu >> REPRESJA REPLIKACJI

> Komórki różnią się pod względem aktywności różnych genów, ale kiedy zapada decyzja, które geny będą aktywne nie towarzyszą jej, zmiany w DNA

>> człowiek - 30 000 genów>> w każdej z tkanek niewielka ich liczba będzie bardzo aktywna - intensywna ekspresja (np. geny globinowe w komórkach prekursorowych erytrocytów)

> kilka tysięcy genów umiarkowanie aktywne - housekeeping gens - geny kodujące białka niezbędne dla przetrwania komórki.

> geny nie ulegajace ekspresji znajdują się w nieaktywnym regionie chromatyny - umożliwia to syntezę mRNA

• zmiana ekspresji genów może być wywołana przez bodźce zewnętrzne (mitogeny, hormony, czynniki wzrostu)

Ekspresja genu może być regulowana na wielu etapach:

1. kontrola transkrypcji

2. kontrola dojrzewania RNA

3. kontrola transportu RNA

4. kontrola translacji

5. kontrola aktywności białka ( np. modyfikacje posttranslacyjne- glikozylacja, fosforylacja itd.)

Heterochromatyna konstytucyjna - DNA nie zawierające genów - centromery, telomery

Heterochromatyna fakultatywna - geny nieaktywne - białka biorące udział w ekspresji genów nie mają dostępu do DNA

Euchromatyna - obszary DNA zawierające aktywne geny - białka biorące udział w ekspresji genów mają łatwy dostęp do DNA

Regulacja ekspresji genów - modyfikacje DNA lub histonów

• metylacja cytozyn DNA - heterochromatynizacja

• acetylacja histonów - aktywacja transkrypcji

• >>>metylacja cytozyn - 5 - metylocytozyna>> metylowane są cytozyny w sekwencjach G-C wyspy CpG>> metylacja prowadzi do represji aktywnościi genów

• >> metylacja związana jest z obniżeniem acetylacji histonów - heterochromatynizacja; białka wiążące się z metylowanymi cytozynami być może wpływają na aktywność deazetylaz - inaktywacja genu

metylacja DNA - piętnowanie genomowe - imprinting

>> u ssaków niemożliwa jest partenogeneza

>> inaktywacja chromosomu X >> kotki szylkretowe >> umaszczenie szylkretowe u kotek> koty o takim umaszczeniu mają w chromosomach X geny warunkujące czarną i rudą barwę sierści, lecz na skutek losowej inaktywacji jednego z chromosomów płci w pewnych klonach komórkowych dochodzi do ekspresji barwy ciemnej, a w innych klonach do ekspresji genów barwy rudej. Ponieważ barwę sierści warunkują inne geny, zwykle futerko ma jeszcze białe plamy

>> w euchromatynie są gołe miejsca gdzie może przyłączyć się np. polimeraza

Ułożenie nukleosomów modyfikuje ekspresję danego genu !

EKSPRESJA GENÓW - transkrypcja

>> geny prokariotyczne - bakterie, genomy mitochondriów i chloroplastów

• jeden rodzaj polimerazy RNA aktywowanej różnymi kofaktorami

• operony - jedno mRNA kodując wiele genów >> RNA policistronowe

• >> 5 podjednostek buduje enzymy

Promotor - odcinek DNA położony zazwyczaj powyżej sekwencji kodującej genu od kilkudziesięciu do kilkuset nukleotydów>> sekwencje rozpoznawalne przez polimerazę RNA zależną od DNA

Regulacja transkrypcji:

Pozytywna - coś musi przyłączyć się do promotora aby gen uległ aktywacji

Negatywna - gen jest aktywny aż do czasu kiedy coś się przyłaczy do promotora

• transkrypcja i translacja zachodzą równocześnie

• polisomy np. u E. Coli

egzon- sekwencja kodujaca

intron - sekwencja niekodująca

• minimalny promotor, promotor podstawowy > zawiera miejsce startu transkrypcji i miejsce wiązania kompleksu preinicjacyjnego>> promotor zaczyna się w pozycji 35 par zasad od miejsca startu transkrypcji

• kompleks preinicjacyjny - ogólne czynniki teanskrypcyjne i polimeraza RNA

Położone powyżej elementy promotorowe

• promotory polimeraz I,II, III różnią się od siebie

• polimeraza RNA I - promotor podstawowy + element kontrolny położony powyżej

• polimeraza RNA II zawiera sekwencje TATA, INR

• polimeraza RNA III - znajdują się wewnątrz genów

Geny eukariotyczne, w których transkrypcji bierze udział polimeraza II RNA zawierają elementy takie jak:

• sekwencja TATA (TATA box) - rozpoznawana przez TBP ( białka wiążące TATA) z ang. TBP tata box binding protein>> TBP jest składnikiem ogólnego czynnika transkrypcji TFIID

• sekwencja otaczająca miejsce inicjacji transkrypcji , rozpoznawalna przez białko TAF wchodzące w skład TFIID

• sekwencja OPE - rozpoznawalna przez białka TATA wchodzące w skład TFIID

• sekwencja BRE - rozpoznawalna przez ogólny czynnik transkrypcyjny TFIID

RNA monocistronowe - jedna cząsteczka RNA kodująca jedno białko

• rozdzielenie w czasie i przestrzeni transkrypcji i translacji

• intensywna obróbka RNA - dodawanie czapeczki (cap) na 5' końcu, edytowanie RNA, usuwanie intronów, dodawanie ogona poli A na 3' końcu>> potem usuwanie eksonów

poli A - poliadenylacja - kilkadziesiąt, kilkaset nukleotydów adeninowych przyłaczonych na końcu 3'

CAP - koniec 5' RNA - nukleotyd guaninowy - wiązanie 5'-5 >> ochrona cząsteczki mRNA przed działaniem nukleaz (enzymów rozkładających kwasy nukleinowe)>> umożliwienie transportu mRNA z jądra kom. do cytoplazmy - cząsteczki mRNA pozbawione czapeczki nie opuszczają jądra komórkowego

• polimeraza RNA musi przyłączyć się do promotora - bezpośrednio lub pośrednio

• rozerwanie wiązań łączących pary zadad DNA otaczających miejsce startu

• komórki prokariotyczne - E. Coli:

• polimeraza rozpoznaje blok 35 (podjednostka sigma)>> rozerwanie wiązań wodorowych w bloku - 10 (otwarty kompleks promotorowy)>> podjednostka sigma oddysocjowuje rdzeń enzymu przeprowadza elongację

• rybonukleotydy dodawane są na 3' końcu transkryptu DNA

• pęcherzyk transkrypcyjny

• sekwencje - terminatory transkrypcji - promują dysocjację polimerazu

• terminacja z udziałem białka Rho - helikaza aktywnie rozbijająca połączenia między matrycą a transkryptem

• komórki eukariotyczne - oprócz polimerazy RNA II zaangażowane sa dodatkowe białka

• TFIID - podstawowy czynnik transkrypcyjny złożony z białka wiążącego sekwencje TATA- TBP oraz co najmniej 12 białek oddziałujących z TBP - TAF ( TAF - TBP associated factors) białka te mają zdolność wiązania DNA

• Kompleks preinicjacyjny : TFIIA, TFIIB, TFIIF/polimeraza RNA II, TFIIE, TFIIH

• działa jako helikaza oraz jako kinaza, fosforyluje domene C-końcową największej podjednostki polimerazy RNA II

• CAK - CDK activating kinase>> ale także skłądnik czynnika transkrypcyjnego TFIIH

Regulacja inicjacji transkrypcji - kom. eukariotyczne

• w tworzeniu kompleksu preinicjacyjnego biorą udział białka aktywujące

• aktywatory konstytutywne - działają na wiele genów, prawdopodobnie nie odpowiadają za sygnały zewnętrzne

• aktywatory regulacyjne - działają na ograniczoną liczbę genów i odpowiadają na sygnały zewnętrzne

• aktywatory o właściwościach pośrednich

• białka aktywujące inicjację transkrypcji przez polimerazę RNA II i III nazywamy czynnikami transkrypcyjnymi>> nie należy ich mylić z podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi takimi jak np. TFIID

• czynniki transkrypcyjne występujące jedynie w określonych tkankach>> Oct - 2- limfocyty B; Pit 1 - przysadka; MyoD - mioblasty; GATA 1 - komórki erytroidalne

• czynniki transkrypcyjne syntetyzowane w różnicnicującym się zarodku: Bicold, Fushi tarazu, Antennopedia

• wiążą się z promotorami albo z położonymi powyżej wzmacniaczami (enhancery) działają aktywująco na tworzenie się kompleksu preinicjacyjnego - oddziałując z nim bezpośrednio lun za pośrednictwem innych białek

p300/ CBP - modyfikuje histony - wpływ na rozmieszczenie nukleosomów

SRY (odpowiedzialny za determinację płci u ssaków) zginanie DNA - umożliwia oddziaływanie między różnymi czynnikami transkrypcyjnymi - kompleks wzmacniający

Czynniki, które nie oddziałują z DNA

>> aktywność czynników regulowana jest przez kontrolę ich syntezy, kontrolę ich zdolności do oddziaływania z DNA lub innymi białkami

>> oddziaływanie z innymi cząsteczkami może modulować aktywność czynnika

>> przekazywanie sygnału przez receptory> wnikać do wnętrza komówki np. hormony sterydowe

Ekspresja genów - czynniki transkrypcyjne

• domeny wiążące sekwencje DNA i domena typu helisa - skręt- helisa

Białka wiążące DNA

• upakowanie >> eukariotyczne histony/ białka nukleoidu

• naprawa>> nukleazy

• replikacja>> białka rozpoznające miejsca inicjacji, polimerazy DNA i ligazy, białka wiążące jednoniciowy DNA (topoizomerazy)

Ekspresja genomu:

• inicjacja transkrypcji - eukariotyczne białka wiążące sekwencję TATA, podjednostka sigma bakteryjnej polimerazy

• synteza RNA - polimerazy RNA

• regulacja transkrypcji - eukariotyczne czynniki transkrypcyjne, bakteryjne represory

(...) do powstającego mRNA następuje po rozpoczęciu transkrypcji>> transferaza- guanylinowa na końcach 5' dodaje ekstra guanozynę, która następnie jest metylowana>> czapeczka odgrywa ważną rolę podczas translacji

>> bardzo długie geny eukariotyczne wymagają dodatkowej stabilizacji kompleksu transkrypcyjnego>> w elongacji mRNA biorą udział czynniki elongacyjne - białka wiążące się z polimeracą po opuszczeniu promotora i pozostawieniu za sobą czynników transkrypcyjnych

>> terminacja transkrypcji - poli (A) znajdujące się na końcu 3' mRNA (250 nukleotydów) nie są zakodowane w DNA - dodaje je polimeraza poli (A)>>> na końcu mRNA sekwencja sygnałowa -5' AAUAAA- 3'

pre- RNA

dojrzewanie RNA

modyfikacje końców - czapeczka - transport mRNA z jądra do cytoplazmy, inicjacja translacji>>> poli A- terminacja transkrypcji przez polimerazę II; inicjacja translacji, degradacja mRNA

Skladanie - usuwanie intronów

>> introny ograniczone są sekwencjami 5'- GU AG- 3' >> w wycinaniu intronów biorą udział małe jądrowe RNA (snRNA) połączone z białkami

RNA kodujący:

• mRNA - informacyjne

RNA niekodujacy:

• RNA rybosomowe - rRNA - najliczniejsza klasa

• RNA transportujące - tRNA

• Małe jądrowe RNA -snRNA

• Małe jąderkowe RNA - snoRNA

• Małe cytoplazmatyczne RNA - sc RNA

• Mikro RNA - miRNA

EKSPRESJA GENÓW - TRANSLACJA

TRNA - transportujące RNA>> tworzą połączenia między mRNA a syntetyzowanym peptydem>> długość od 74 do 90 nukleotydów>> oprócz AUCG zawierają również nukleotydy zmodyfikowane ( ok. 50 modyfikacji)

• ramię akceptorowe - aminokwas przyłączony do adenozyny na końcu 3'

• ramię D - nazwa od dihydrourydyny

• ramię antykodonowe - zawiera 3 nukleotydy zwane aktykodonem, które łączą się z mRNA

• pętla zmienna - różna liczba nukleotydów

• ramię TWC- nazwa od sekwencji tymina- pseudourydyna - cytozyna

aminoacylacja - przyłączenie aminokwasów do tRNA; syntetazy aminoacylo - tRNA

• 20 różnych aminoacylaz - po jednej na każdy aminokwas>> duża specyficzność w stosunku do cząsteczek RNA z którymi się wiążą

translacja - RYBOSOMY

• każdy rybosom składa się z 2 podjednostek

• S- współczynnik sedymentacji> podczas ultrawirowania współczynnik sedymentacji zależy zarówno od kształtu jak i od masy cząsteczki

• Oprócz rRNA w skład rybosomów wchodzą białka rybosomowe

Rybosomy - organizmy prokariotyczne

• bakteryjne mRNA mają miejsca wiązania rybosomu > kodon inicjacyjny

• Mała podjednostka rybosomu - czynnik inicjacyjny IF- 3

• Inicjatorowy tRNA czynnik inicjacyjny IF-2 , GTP

• Duża podjednostka rybosomu; czynnik inicjacyjny

• FMet - formylometionina

Rybosomy - komórki eukariotyczne

• większość eukariotycznych mRNA nie posiada miejsca wiązania rybosomu

• mała podjednostka sybosomu łączy się z mRNA i skanuje sekwencje aż do napotkania kodonu inicjacyjnego

• kodon inicjacyjny wchodzi w skład sekwencji KOZAK

• połączenie się małej podjednostki z tą sekwencją stymuluje przyłączenie dużej podjednostki

• miejsce peptydowe - P zajęte przez tRNA Met lub tRNA fMet

• miejsce akceptorowe A - zajmuje drugi kodon > u bakterii miejsce wyjścia - E

• miejsce A zajmuje odpowiedni aminoacylo- tRNA umiejscawiany przez czynnik elongacyjny EF - Tu (bakterie lub eEF1: eEF - 1d, eEF - 1b, eEF- 1 gamma, eEF- 1 sigma (kom. eukariotyczne) wiążą one GTP

• hydroliza GTP umożliwia wytworzenie wiązania peptydowego katalizowane przez peptydylo-transferazę.

Translokazja

Czynnik uwalniający

• bakterie - czynniki RF-1 , RF- 2, RF-3

• eukariotyczne eRF >>> rozpoznają one kodon STP

regulacja transkrypcji

bakterie - np. operon tryptofanowy

obecny represor transkrypcji>> konieczna inaktywacja represora np. fosforylacja pRB

aktywacja transkrypcji - poprzez przyłączenie aktywatora np. hormonu.

Inicjacja - rozpoznanie miejsc rozpoczęcia - ori

Elongacja - powielenie nici DNA

Terminacja - zakończenie replikacj

• u prokariota 2 ori

• helikaza rozkręca DNA> lolakizuja się białka stabilizujace tę nić

• białka SSB - wiążą jednoniciowy DNA

• topoizomerazy - nacinają nić by uniknąć superskrętu

• u eukariota bardzo dużo miejsc ori - replikacja zachodzi szybko

• elongacja - polimeryzacja nowego łąńcucha 5'>3'

• 1 nić w sposób ciągły - nić wiodąca

• nić opóźniona - ligowanie fragmentów

• polimerazy muszą rozpoznawać koniec 3' >> by to ułatwić synteza starterów przez prymazy (polimerazy DNA - alfa)

• nić wiodąca - 1 starter

• nić opóźniona - wiele starterów > 10 nukleotydowe fragmenty DNA

• fragmenty OKAZAKI - fragmenty RNA na nici;

• egzonukleazy- wycinają fragmenty RNA lubDNA>> egzonukleaza rozpoznaje fragmenty RNA o aktywności 5'>>3' usunie fragment i polimeraza go wypełni

• widełki replikacyjne to miejsce w którym zachodzi replikacja>> helikazy - rozplata; topoizomerazy - rozcina; MCM - działają jak helikazy - rozplata DNA

• polimeraza alfa - synteza starterów

• polimeraza sigma - główny enzym elongacyjny; katalizuje

• PCNA - białko, antygen charakterystyczny dla dzielących się komórek

• Prymaza nie jest stabilizowana przez białka ; polimeraza jest stabilizowana

• Gdy zreplikowane DNA - terminacja >> sekwencje terminacyjne w ori

• U eukariota wiele ori>> łączenie zreplikowanych fragmentów

• U bakterii polimeraza przesuwa się do końca

• U eukariota chromosomuy liniowe

• Polimeraza nie zreplikuje końcówki

• Telomery- setki tandemowo ułożonych sześcionukleotydowych sekwencji>> zabezpieczają przed skręcaniem się chromosomów; są budowane intnsywnie w komórkach zarodkowych; w starzejących się komórkach mniej>> duża aktywność telomeraz w kom. nowotworowych

• TELOMERAZA - enzym syntetyzuje telomery; ten enzym ma starter RNA > ma matrycę RNA i budujący fragment

• FISH - hybrydyzacha fluorescencyjna in situ

Naprawa błędów

• nieprawidłowo wbudowane nukleotydy>> wykrywanie i wycinanie przez NUKLEAZY i polimeraza dobudowuje sekwencje

MITOZA

-zanik otoczki jadrowej>> depolimeryzacja lamin (filamenty pośrednie)

• chromosomy zostają uwolnione z jądra

• zmiany w organizacji cytoszkieletu

• zmiany w kondensacji chromatyny

• nie wszystkie organizmy w ten sposób>> u niektórych grzybów nie zanika otoczka jądrowa

• MPF - kompleks cdk1 i cyklina B >> MPF jest nieaktywny aż CDK1 nie utworzy kompleksu z cykliną; aktywny aż nie dojdzie do degradacji cykliny B>> degradujące są znakowane przez UB> rozpoznawane przez proteasom

FUNKCJE MPF

CDK1 - CYKLINA A

• konieczna do rozpoczęcia profazy

• degradacja cykliny A poprzedza degradację cykliny B

• degradacja cykliny A jest niezbędna do ukończenia fazy M

CDK1 - CYKLINA B

• depolimeryzacja lamin otoczki jądrowej

• kondensacja chromosomów

• utworzenie wrzeciona podziałowego

• reorganizacja aparatu Golgiego

• degradacja cykliny B niezbędna do ukończenia podziału

Zanik otoczki jadrowej

• otoczka z 2 błon >> wewnętrzna błona wysłana jest laminami > podczas profazy aktywcja MPF>> fosforylowane są laminy> to powoduje rozpad otoczki jadrowej

• lamina B traci powinowactwo>> pozostaje związana z pęcherzykami błonowymi

• lamina A/C - monomery w cytoplazmie; rozpad otoczki jądrowej

• spadek aktywności MPF> laminy nawiązują ze sobą kontakt - tworzenie otoczki

CENTROSOM - po podziale komórki> para centriol otoczone gamma tubuliną> miejsce nukleacji MT> na powierzchni może zajść przyłączenie tubuliny (polimeryzacja i depolimeryzacja MT)

Kiedy kom. kończy podział - 1 kompleks do kom. potomnej> duplikacj centrosomów

• CDK2 - kinaza E > odpowiedzialna za to w profazie > 2 centrosomy idą do biegunów

• Są komórki bez centriol> wczesne zarodki myszy

• Zaburzenia - wielobiegunowe wrzeciona

• Dynamiczna niestabilność mikrotubul - mikrotubule ulegają skróceniu

>> podział synchroniczny- kinaza działa na wszystkie jądra w tym samym czasie> podział w tym samym tempie

>> podział asynchroniczny> pod powierzchnia> każde jądro dzieli się we własnym tempie

• podział nie musi być symetryczny- np. bruzdkowanie zarodka c. Elegans> 1 komórka mniejsza druga większa

• wrzeciona mogą być ustawione w różny sposób - determinuje to wielkość komórki

Punkty kontrolne fazy M

1 - zapobieganie gdy replikacja nie została zakończona S/G2 lub są uszkodzenia > punkt kontrolny fazy S

3. zaburzenia replikacji centrosomów

4. PK fazy M M- SAC - kinetochory nie związane z mikrotubulami; nieprawidłowo ułożone chromosomy

SAC - na kinetochorach lokują się białka punktu kontrolnego; wiążą czynnik, który indukuje anafazę

Białka : MAD 2 (łączy silnie) BUB1

CDC 20 - istotne w replikacji > indukuje aktywność APC (anaphase promoting complex)> kompleks inicjujący anafazę

APC - bardzo wiele białek, głównym jest enzym przyczepiający ubikwitynę> białka ubikwitynowane np. cyklina B > inaktywacja MPF

• po replikacji chromosomy z 2 chromatyd>> KOCHEZYNY

• trzeba uaktywnić SEPARAZĘ > separaza tnie kochezyny> spadek aktywności MPF

UBIKWITYNA

E1 - enzym aktywuje ubikwityne

E2 - enzym wiążący ubikwitynę

E3 - ligaza ubikwitynowa > rozpoznaje substrat

APC musi być ufosforylowane

MITOZA

2n- 2c>> po fazie s >> 2n - 4c >>>podział>> 2n - 2c

MEJOZA

• rozmnażanie - podział kom.

• bezpłciowe - pędy boczne roślin

• rozmnażanie> wymieszanie genomów dwóch odobników > potomstwo rózniące się gnetycznie>> może dojść do wymiesznai fragmentów chromosomów> zmienność genetyczna> pierwszy podział jest podziałem redukcyjnym

• 2n- 4c>> 1n-2c> 1n- 1c (4x)

• w drugim podziale każdy chromosom z 1 chromatydy

• profaza - rekombinacja genetyczna > zanik otoczki jądrowej> zmiany w stopniu kondensacji chromatyny (leptoten, zygoten, pachyten, diploten, diakineza)

• leptoten - kondensacja chromatyny

• zygoten - chromosomy układają się wzdłuż siebie> kompleks synaptonemalny

• pachyten - idealne połączenie - crossing-over> wymiana fragmentów chromosomów homologicznych

• diploten - chromosomy odsuwają się od siebie

• CHIAZMY - miejsce gdzie zaszło crossing- over

• Terminalizacja chiazm> chiazmy idą na koniec

• Wzrasta poziom MPF > rozpad otoczki jadrowej> dalsze etapy podziału

• U niektórych organizmów jądra dekondensują się po I podziale

• 4 haploidalne komórki - 1 chromatyda z każdego chromosomu

W. 8 CHLOROPLASTY

Chloroplasty występują głównie w komórkach mezofilu (kom. miękiszowe) liści i łodygi.

Przekrój poprzeczny liścia

• kutykula

• epiderma górna

• mezofil palisadowy

• mezofil gąbczasty

• aparat szparkowy w epidermie dolnej

• spłaszczone pęcherzyki tylakoidów tworzące grana

• stroma

• tylakoid stromy

Tylakoidy

• zespolone (granowe)

• niezespolone (międzygranowe)

Chloroplasty mają strukturę semiautonomiczną - nie są w pełni samowystarczalne w syntezie własnych białek (mimo, ze mają DNA i rybosomy)>> genom chloroplastowy jest zbyt mały - syntetyzowane jest ok. 10% własnych białek, reszta syntetyzowana jest z jądra

W tylakoidach 4 kompleksy:

1. PS - I

2. PS-II

3. CfoCF1

4. Cytochrom blf

• ruchliwy kompleks antenowy- wcześniej uznawany jako 5. Fotokompleks, ale nim nie jest bo jest całkowicie kodowany przez DNA jądrowe.

Biogeneza chloroplastów jest realizowana na różnych poziomach organizacji:

1. Organizacji genomu chloroplastowego

2. Ekspresji genów w chloroplastach, w przedziale jądrowo-cytoplazmatycznym i współdziałnia genomu chloroplastowego i jądrowego

3. Biosyntezy własnych białek chloroplastowych i transportu białek z cytoplazmy do chloroplastów

4. Zespalania się podjednostek i kompleksów błon tylakoidów

5. Organizacji, substruktury całych chloroplastów i ich dynamiki

CtDNA

• komórka liścia - 100 chloroplastów

• chloroplst- 100 identycznych kopii

• wniosek>> 10000 kopii w każdej komórce

Replikacja cp DNA

• kod genetyczny cpDNA jest identyczny z uniwersalnym

• replikacja cpDNA jest semikonserwatywna, ale zachodzi pod kontrolą nDNA

• widełki replikacyjne przesuwają się w jednym kierunku

• replikacja jest asymetryczna, na jednej nici przebiega z inną szybkością niż na drugiej

Regulacja ekspresji genów chloroplastowych

• badania podczas rozwoju, głównie „zielenienia” (chroplast-chloroplast)

• badania także podczas cyklu światło/ciemność i w odpowiedzi na różne stresy (temperatura, promieniowanie)

• regulacja realizowana jest w przypadku wieszości genów, na różnych poziomach: posttranskrypcyjnym, postralnslacyjnym

• nie ma ścisłych reguł, ale są pewne tendencje

Ekspresja genów (jądrowych i plastydowych) zależna od światła

Fotoreceptor>> transdukcja sygnału>> kontrola ekspresji genów

Geny jądrowe: rbcS - światło czerwone i niebieskie

Cab - św. Czerwone i niebieskie

Geny plastydowe: rbcL - j.w

PsbA - j.w.

Karboksylaza - katalizuje I etap reakcji ciemniowej

Fitochromy - receptory światła czerwonego

Fitochromy - chromofor (fitochromobilina) + apoproteina

Hem- oocygeneza hemu - biliverdyna (synteza fitochromobiliny, fitochromobilina

Geny: PHYA (głównie w ciemności ), PHYB (w ciemności i na świetle), PHYC ( w ciemności i na świetle)

Regulacja transkrypcji:

• przez wiele elementów regulatorowych (RE) w genomie jądrowym, oddziałujących z odpowiednimi czynnikami transkrypcyjnymi

• znalezione też odpowiedniki takich elementów w genomie chloroplastowym (w ryżu)

CP RNA - polimerazy

2 główne formy w chloroplastach roślin wyższych:

Polimeraza PEP - (kodowana przez genom plastydowy) podobna do polimerazy E. Coli lub eubakteryjnej, o wielu podjednostkach. W niefotosyntetyzujacych tkankacj transkrypcja „ housekeeping” genes (także: NADH - dehydrogenaza, ATP - syntaza)

Polimeraza NEP (kodowana przez genom jądrowy) podobna do polimerazy faga - T7, o pojedynczej podjednostce. W zielonych tkankach transkrypcja genów fotosyntetycznych i „housekeeping genes”

System translacji przypomina bakteryjny:

• rybosomy 70S

• synteza białek zaczyna się od formylometioniny

• wrażliwość na te same antybiotyki: streptomycynę, chloramfenikol

• hybrydowe rybosomy są funkcjonalne

• rybosomy chloroplastowe in vitro mogą wykorzystywać tRNA do syntezy białka.

CpmRNAs - żyją relatywnie długo (0,5h do 8h)

Translacja jest regulowana przez światło i/ lub przez cząsteczki sygnałowe stanu reaks

>> zmiany globalne np. wysoki poziom translacji w dzień, niski w nocy. Preferencyjna translacja specyficznych mRNA, np. wysokie natężenie światła powoduje wzrost poziomu translacji psbA a zmniejszenie rbcL. Translacja może być też regulowana przez obecność podjednostki z całęgo kompleksu (translacja; rbc L mRNA)

>> większość kopii cpDNA jest aktywna transkrypcyjnie. Tylko część transkryptów na nowo jest selekcjonowana do dojrzewania i stablilizacji przez tzw. M-factors (kodowane przez jądrowy DNA) wiążących się z 5' VTR. Pozostałe transkrypty są przeznaczone do degradacji

T-factors - (kodowane przez jądrowy DNA) wybierają niektóre dojrzałe mRNAs do translacji. Pozostałe transkrypty są przechowywane (nieznany jest mechanizm ich przechowywania)

>> ewolucyjny transfer genów do jądra spowodował, że ponad 90% białek (ok. 3000) kodowana jest przez genom jądrowy

Dlatego też konieczny jest import białek z cytoplazmy do chloroplastu.

>> 2 typy rybosomów: wolne i związane z błoną syntetyzują białka przeznaczone do różnych komparttmentów

ER - signal peptide (SP)

Chloroplast - transit peptide (TP)

Mitochondrium - presequence

Nucleus - nuclear lozalization sygnal (NLS)

Peroxisome - peroxisome targeting signal (PTS)

Vacuole - vacuolar sorting signal (VSS)

Import białek chloroplastowych:

1. postranslacyjny

2. białka syntetyzowane są w formie prekursorów z N-końcem

3. N-koniec jest „kodem pocztowym”, odcinanym podczas transportu, zwanym często peptydem tranzytowym

>> w zależności od tego ile barier musi przejść dana cząstecka tyle jest cząsteczek tranzytowych

IMPORT DO CHLOROPLASTÓW I TRANSPORT WEWNĄTRZ CHLOROPLASTÓW TO DWA NIEZALEŻNE PROCESY !!!

Kompleksy tanslokacyjne otoczki chloroplastowej (translokony): Tocs i Tics

Tocs - zewnętrzna membrana = translakon OE

Funkcja:

• udział w fałdowaniu i tworzeniu struktury przestrzennej białek

• w transporcie białek przez błony

• w łącczeniu podjednostek białkowych w funkcjonalny oligomer

• MOLEKULARNE CZAPERONY - wiążą się z prekursorem przed i po translacji. Są to białka z rodziny Hsp 70 (powstają w stanie częściowo sfałdowanym); Hsp 100 w cytoplazmie i w stromie, oraz cpn 60 (głównie w stromie, ale też w cytoplazmie)

• ATP i GTP są konieczne do transportu

• Molekularne czaperony odgrywają zasadniczą rolę w transporcie po obu stronach membrany

RUBISCO

L8S8

L 50-55 kDa

S - 12 - 18 kDa

Cpn 60 - przyłączają się do polipeptydu

Cpn 10 - odłączają Cpn od polipeptydu

• udział w tworzeniu struktury przestrzennej L- monomeru, dimeru, oktameru

• udział w tworzeniu struktury przestrzennej monomeru.....dimeru oktameru ????

• udział w transporcie podjednostek

• udział w łączeniu się podjednostek L i S

Kierowanie białek do błony tylakoidu ze światła tylakoidu (lumen)

>> białka przeznaczone do błony tylakoidu i do lumen mają dwa peptydy tranzytowe (2 kody pocztowe)>> są one odcinane dwuetapowo:

prekursor>>cięcie>> b. Pośrednie>> cięcie>> b. Dojrzałe

Kierowanie białek do błony tylakoidu i do lumen 4 drogi:

1. sec -A - zależna droga

2. pH gradient - zależna droga

3. SRP - zeleżna droga (signal recognition particles); zależna od cząstek rozpoznających sygnał

4. Spontaniczna

SecA - zeleżna droga

• angażuje homolog genu bakteryjnego sec-A

• wymaga ATP

• gradient pH stymuluje transport

• przykłady białek transportowanych w ten sposób:

- plastocyjanina

- cytochrom f

- PS IF

- OE33; białko 33 kDa kompleksu wydzielającego tlen (oxyden erdiving component)

• OF PSII (OFC)

PH gradient - zależna droga

• wymaga gradientu pH w poprzek blony tylakoidu

• przykłady białek transportowanych w ten sposób:

- OE 2H, OE17, białka kompleksu wydzielajacego tlan OEC

- PS II T

- PS I N

• peptydy tranzytowe tych białek mają bliźniachy motyw argininowy - kluczowy dla transportu w poprzek błony

SRP - zależna droga - zależna od cząsteczek rozpoznających sygnał

• angażuje białka typu SRP (cSRP 54)>> SRP występuje u prokariota i eukariora> zbudowane jest z RNA i kilku białek

• wymaga GTP

• gradient pH stymuluje transport

• przykłady białek: LHCPs (light - harvesting chlorophyll proteins)

Spontaniczna droga transportu i włączenia białka do błony tylakoidu

Przykłady: CP II

>> na proces fotosyntezy składają się reakcje „jasne” i „ciemne” w których można wyróżnić 4 etapy:

1. absorbcja światła przez cząsteczki chlorofilu, związanego z białkami błon tylakoidów, powoduje rozkład cząsteczek wody i wybicie elektronów transportowanych następnie na kolejne receptory

H2O>>> światło>> O2 + 4H+ +4 e

2. łańcuch transportu elektronów z wody, przez kolejne przenośniki aż na NADP+, sprzężony z ruchem protonów w poprzek błony tylakoidu do światła tylakoidu tworząc gradient pH

2H2O + 2NADPH >>światło>> 2H+ + 2NADPH + O2

3. kompleks CfoCF1 pwoduje syntezę ATP z ADP i Pi. Jest to tzw. Fosforylacja fotosyntetyczna

H+ +ADP3 + Pi2>> ATP + H2O

4. w trakcie „reakcji ciemnych” wiązanie CO2 i przekształcanie CO2 w węglowodany; ATP i NADPH wytworzone podczas reakcji świetlnych dostarczają energii i elektronów do syntezy 6- węglowych cukrów z CO2 i H2O

6CO2 + 18 ATP + 12 NADPH + 12 H2O>> C6H12O6 + 18 ADP + NADP + 6H+

ontogeneza różnych form plastydów: rysunek

Rośliny C4

• mają w liściu prócz miękiszu wypełniającego jego wnętrze także miękisz wieńcowy - otaczający samą wiązke przewodzącą i mający stosunkowo duże chloroplasty

• nazwa c4 bierze się stąd, ze rośliny te wiążą początkowo CO2 z czterowęglowym szczawiooctanem

• rośliny c4 to organizmy nastawione na oszczędną gospodarkę wodną (np. kukurydza)

• oszczędnie otwierają aparaty szparkowe; tylko poprzez transport CO2 z jednej komórki do drugiej, przez plazmodesmy

JAK SIĘ DZIELĄ PLASTYDY?

Podział plastydu nie jest związany z podziałem komórki, żaden z tych procesów nie inicjuje drugiego, ale oba są nadrzędnie kontrolowane

Dwuetapowy podział plastydu:

• podział nukleoidu

• plastydokineza

W komórkach potomnych jest zazwyczaj różna liczba plastydów

>> plastydokineza za pomocą kurczliwego aktynowego pierścienia w miejscu przewężającego się plastydu

1. zachamowanie podziału cytochalazyną B

2. barwienie rodaminą skoniugowaną z falloidyną

3. zbliżona wielkość depozytów tworzących pierścień aktynowy

DAPI (4'-6' diamino -2- phenylidol) barwi całe obszary nukleoidów. ChlDNA połączone jest z białkami

Stała liczba plastydów w określonych komórkach danego gatunku np.

Anthoceros - 1 plastyd

Sphagnum - 1,2,4,8,16,32 w komórce

Selaginella - 4 w komórkah aparatu szparkowego

1. FtsZ - ring; białko podobne do tubuliny tworzące pierścieniową strukturę po stronie stromy, geny homologiczne do bakteryjnych u arabidopsis 2 rodziny genów ftsz 1 i ftsz2

2. PD - ring tworzące u krasnorostów pierścień od strony cytoplazmy; geny eukariotyczne

3 i 4 MinD i MinE (lub ich homologi) - białka po stronie stromy dbaja aby pierścień zakłądany był w płaszczyźnie równikowej komórki

6. ARTEMIS - białko wewnętrznej błony otoczki, białko z domeną translokazy

• chloroplasty dziedziczone w większości gatunków odmatycznie

> mechanizmy determinujące określoną segregację plastydów u glonów izogametycznych - degradacja ptDNA w zygocie>> u glonów anizogametycznych, mszaków i paprotników - degradacja ptDNA już w czasie spermatogenezy

>>> u roślin wyższych:

1. w czasie podziału różnicującego

2. w czasie zapłodnienia

3. po zapłodnieniu

W. 9 MITOCHONDRIA

• mitochondria są organellami występującymi u większości eukaryouta

• są miejscem, w którym zachodzi cykl Krebsa i transport elektronów wytwarzających energię w procesie oddychania tlenowego

• są dziedziczone głównie odmatyczynie podczas rozmnażania płciowego u większości kręgowców i roślin wyższych

• ze względu na sposób dziedziczenia materiał genetyczny jest niezwykle użyteczny w okręślaniu linii dziedziczenia organizmów

reakcja całkowitego spalania glukozy

C6H 2O6 + 6O2 + 32Pi +32 ADP + 32H+ >> 6CO2 + 32ATP + 38H2O

MtDNA

• mitochondrialny DNA jest mały (1,65 Kb) w komórkach zwierzęcych, u innych może być kilkakrotnie większy; wielkość zależna od gatunku Arabidopsis - mtDNA 200 - Kb; pozostała informacja importowana z jądra

Różnice w mitochondrialnym kodzie genetycznym

• mała zmienność kodu genetycznego świadczy o tym, że mitochondria powstały bardzo wczesnie w toku ewolucji z jednego przodka

• znane są wyjątki od standardowego= uniwesralnego kodu genetycznego

• wyjątki są wśród jednokomórkowych eukaryota, niektórych grzybów i prokaryoita ; głównie to modyfikacje kodonu STOP: UAA, UAG, UGA

Biosynteza białek mitochondrialnych

Mitochondria syntetyzuja niewielką liczbę białek cyklu Krebsa i transportu elektronów. Wszystkie pozostałę ok. 95% kodowane są przez genom jądrowy.

Biosynteza białek transportowanych z cytoplazmy do mitochondrów wymaga:

• odpowiedniego transportu w cytoplazmie

• obecności sekwencji tranzytowej rozpoznającej i wiążącej receptory w błonie

• obecności peptydaz rozpoznających sekwencje tranzytowe i odcinających je

Etapy utleniania:

a) Glkoliza

C6H12O6 + 2NAD+ + Pi + 2ADP >> 2C5H4O5 + 2ATP + 2NADH

2. utlenienie pirogronianu lub kwasów tłuszczowych do CO2 związane jest z redukcją FAD lub NAD+ do FADH2 i NADH2; zachodzi w matrix lub związane jest z białkami wewnętrznej błony skierowanymi do matrix

3. w cyklu kwasu cytrynowego (cykl kwasów trójkarboksylowych = cykl Krebsa) acetylo CoA jest utleniany do CO2 a NAD i FAD jest redukowany do NADH2 i FADH2

4. transfer elektronów z NADH2 i FADH2 na O2 związany jest z wewnętrzna błoną mitochondrialną i sprzężony jest z generowaniem gradientu protonów dla syntezy ATP oraz z syntezą ATP przez kompleks F0 i F1- syntazy ATP

Białka zaangażowane w podział mitochondriów:

1. FtSC - ring; białko podobne do tubuliny tworzące pierścieniową strukturę po stronie stromy, geny są pochodzenia bakteryjnego. Brak u grzybów i zwierząt

2. Dynamina - ring; tworzący się u grzybów i zwierząt od strony cytoplazmy, geny eukariotyczne

Skład mitochondrium

• rybosomy 70 S

• wszystkie rodzaje RNA

• własne DNA (mtDNA)

• błona wewnętrzna mitochondrium > selektywna zawiera cały układ kompleksów transportujących elektrony

• RNA - kdowany przez własny genom (mtDNA)

• Fakt, ze u jednego zwierzęcia dane białko jest kodowany przez własny genom (mt DNA) nie znaczy, że u innych zwierząt też tak jest (w przeciwieństwie do chloroplastów, w których niezależnie od gatunku dane białko jest kodowane przez ten sam genom) np. syntaza ATP u jednych zwierząt kodowane przez mtDNA a u innych przez nDNA>>> oksydaza cytochromowa - składa się z 3 podjednostek i wszystkie kodowane są przez mtDNA

• Glikoliza > poza mitochondrium w cytoplazmie! Reszta etapów w matrix

• Transportowi elektronów towarzyszy transport protonów (w łańcuchu oddechowym)

W.10 PODZIAŁ ORGANELLI

Podsumowanie : Chloroplasty a mitochondria

1. Organella semiantonomiczne

2. Wielkość genomu chloroplastów podobna u różnych gatunków, wielkość genomu mitochondriów różna u różnych gatunków

3. Kod genetyczny uniwersalny w genomie chloroplastów, różny w genomie mitochondriów

4. Transport do organelli wg podobnego mechanizmu

5. Dziedziczenia zwykle odmatyczyne

Cechy organelli typowe dla bakterii:

• wielkość i morfologia podobna

• otoczone podwójną błoną zewnętrzna jak się przypuszcza pochodzi ona od „gospodarza”; z inwaginacji błony gospodarza”ednocytujacej” bakterię; wewnętrzna błona jest włąsną błoną cytoplazmatyczna bakterii

• niektóre enzymy i system transporty przez błony przypominają bakteryjny

• podział organelli przypomina „przewężenie”bakteryjne

• organella zawierają małe kliste DNA podobne do bakteryjnego

• organella podobnie jak bakterie syntetyzują białka przy użyciu włąsnych rybosomów

• rybosomalne RNA przypomina DNA Eubacteria

Pochodzenie Eukaryota

Jak powstały kompartmenty w komórce Eukariotycznej:

1. endosymbioza - wyjaśnia pochodzenie mitochondriów i chloroplastów

2. inwaginacja błony kom. wytworzyła wewnętrzny system membran

Podstawy teorii endosymbiozy

• mitochondria i chloroplasty mogą tworzyć się tylko z już istniejących - brak jest genów organellowych kodujących część własnych białek

• mitochondria i chloroplasty mają rozmieszczenie genów bardziej zbliżonych do prokaryota niż eukaryota, ale liczba tych genów jest znacznie mniejsza niż u prokaryota np. Synechocystis (cyanobacteria) -3200 genów

• mitochondria i chloroplasty mają własną maszynerię syntezy białek znacznie bardziej przypominaja Prokaryota niż eukaryota

Mitochondria

• pochodzą od Alfa - Proteobacteria, zostały wchłonięte na drodze fagocytozy przez prymitywne komórki setki milierdów lat temu

• nie zostały strawione, dostarczają tlen

• wewnętrzna błona jest własną błoną Proteobacteia, a zewnętrzna oryginalną błoną fagocytarną

Chloroplasty

• pochodzą od Cyanobacteria, zostały „wchłonięte na drodze fagocytozy” przez prymitywne komórki setki milionów lat temu

• nie zostały strawione, dostarczją produktów fotosyntezy, PSI, PSII podobne do roślin wyższych (inne bakterie fotosyntetyzujące tylko PSI)

• wewnętrzna błona jest własną błoną cyanobacteria a zewnętrzna oryginalną błoną fagocytarna

• chloroplasty i mitochondria mają swoje własne DNA

• to pozajądrowe DNA wykazuje dziedziczenie nie-mendlowskie

• znana jest rekombinacja między mt - i ct-DNAs

• zwykle ct i mt DNA są koliste i zawierają geny potrzebne do transkrypcji, translacji oraz pewne geny kodujace białka kompleksów białkowych kodowanych także przez nDNA

• tempo mutacji z pozajądrowym DNA jest różne od tempa mutacji nDNA

Cechy chloroplastów i mitochondriów podobne do bakteryjnych:

• wielkość i morfologia podobna

• otoczone podwójną błoną, zewnętrzna i wewenętrzną

• koliste małe DNA ( z niewielką liczbą białek) podobne do bakteryjnego

• rybosomalne RNA przypomina rRNA Eubacteria

• transkrypcja genów rRNA rozpoczyna się w miejscach promotorowych przypominajacych promotory bakteryjne

• hybrydyzacja DNA i RNA z chloroplastu u Cyanobacteria a także mitochondrium i bakterii tlenowych

• wiele homologów genów bakteryjnych

• chloroplasty i mitochondria syntetyzują białka przy użyciu własnych rybosomów o wielkości rybosomów Prokaryota i o takich samych podjednostkach

• wrażliwość na te same inhibitory i antybiotyki: chloramphericol, streptomycyna, erytromycyna

Cechy chloroplastów podobne do bakteryjnych:

• niektóre enzymy np. transportu elektronów (ATP-aza) występują wyłącznie u Prokaryota; rozpuszczanie białka enzymatyczne np. cyklu Krebsa - podobne do prokariotycznych

• system transportu przez błony przypomina bakteryjny

• podział chloroplastu i mitochondrium przypomina „przewężenie bakteryjne”

• podobne są białka pomocnicze , główie chaperoniny

W czym chloroplasty i mitochondria nie przypominają bakterii:

• nie zawsze mają kształt i wielkość bakterii

• ilość DNA w chloroplastach i mitochondriach jest znacznie mniejsza niż u prokaryota , zbyt mało genów aby syntetyzować własne białka

• podział i rozmieszczenie chloroplastów i mitochondriów w komórkach potomnych są ściśle kontrolowane przez komórki eukariotyczne

Wtórna endosymbioza

• glony cryptomonad (wiciowiec + czerwony glon)

• glony chlorarachniofity (wiciowiec + zielony glon)

• sporowce (pierwotniak + czerwony glon)

Apikoplast - pozostałość chloroplastu, z resztka genomu, bez genów fotosyntetycznych

Plasmodium, Toxoplasma - pasożytnicze protista

Mają geny jądrowe - homologi plastydowe, białka apikoplastu z sekwencjami tranzytowymi (plastydowymi)

Toxoplasma - 68 genów apikoplastu ( w tym 60- „housekeeping genes”)

Czy wtórna endosymbioza jest możliwa współcześnie?

Gospodarz: Wiciowiec

Endosymbiont: zielony glon

2 fazy cyklu : autotroficzna i heterotroficzna

Powstanie i utrwalenie układu symbiotycznego między amebą a bakterią

Glaukocystophyta - bardzo pierwotne protista jednokomórkowe, pozostałość po ścianie gramujemnych bakterii zbudowanej z peptydoglikanów i barwników podobnych do cyanobacteria

Cyanophora paradoxa - 135 Kb i ponad 50 genów; gen ferrodoksyny, 6 genów białek rybosomalnych, geny biosyntezy białek, gen SecY>>> podwójny system translokonów SecY w błonie tylakoidów ( taki jak w chloroplastach u prokaryota) i dodatkowo w wewnętrznej błonie otoczki

Ciekawe współczesne przykłady endosymbiozy

Elysia chlorotica - morski ślimak fagocytuje chloroplasty glonu Vaucheria Litorea, wchłaniając je do cytoplazmy komórek epitelialnych. Ślimak przez prawie rok może żyć mając tylko światło i CO2. Symbiont wydziela fotosyntetycznie tlen, transport elektronów przez PSI i PSII, bez żadnego dodatkowego źródła pożywienia dla mięczaka, wszystko to odbywa się bez jądra glnou.

Biogeneza peroksysomów - endosymbiotyczne pochodzenie

• powstaja przez podział istniejących peroksysomów

• specyficzne białka błony i matrix peroksysomów syntetyzują...... i transportowane są do peroksysomów

• pojedyncza błona

• brak DNA

• brak specyficznych presekwencji kierujacych

Monofiletyczne pochodzenie mitochondriów alfa-proteobakterii - 1,5 mld lat temu

Ewolucja mitochondriów

• redukcja wielkości i liczby genów w genomie mitochondrialnym

• najmniejszy 5 genów - plasmodium i najwiekszy arabidopsis ale dużo sekwencji niekodujący

• najwiecej genów (97) zawierają mitochondria u Recinomonas americana (wiciowiec) m.in. 4 geny kodujące podjednostki polimerazy RNA typu bakteryjnego ( u pozostałych polimeraza RNA jest kodowana jadrowo i jest podobna do polimerazy RNA z bakteriofaga T3/T7)

Transfer genów endosymbionta do jadra

• redukcja wielkości genomów mitochondrialnych i liczby genów wynika z postępującego uzależnienia endosymbionta od gospodarza ( biosynteza, składniki ściany kom.).przenoszenie genów z genomu endosymbionta do genomu gospodarza obejmuje następujące etapy:

1. duplikacja genów przenoszonych do jadra (w tym przenoszenie kilku siąsiadujacych genów w blokach)

2. przenoszenie genów w postaci...

3. dopasowanie promotora jądrowego do genu mitochondrialnego

4. dodanie do genu sekwencji kierujących białka do mitochondriów (najpierw była tylko translacja na powierzchni błony mitochondrialnej)

5. wykazano eksperymentalnie i to z dużą częstością transfer genów z mitochondriów do jądra u drożdży i z chloroplastów do jadra w pyłkach arabidopsis

Dlaczego transfer genów nie został zakończony?

1. pewne białka nie mogły być translokowane z cytoplazmy do plastydu

2. pozostawienie niektórych genów w plastydowym genomie umożlwia szybką regulację ekspresji np. w odpowiedzi na zmianę potencjału redox

Filogeneza sekwencji rDNA potwierdza obecnie najbliższe pokrewieństwo Cyanobacteria i plastydów oraz alfa-proteobacteria i mitochondriów

Związki filogenetyczne głównie na podstawie sekwencji chlDNA:

• w obrębie rodzin np. Crassulaceae, Berberidaceae

• między gatunkami tego samego rodzaju np. Juniperus

• najczęściej porównywalne sekwencje rbc, otp, psb,psa i to głównie niekodujące odcinki: spacery, introny

Na tej podstawie wyodrębnia się wspólnego przodka obecnie żyjących roślin lądowych - Mesostigma viridae (pierwszego produktu endosymbiozy) pełna sekwencja 135 genów, w tym 53 wspólnych dla wszystkich roślin lądowych i glonów. Od niego wywodzą się duże linie ewolucyjne: Streptophyta (Charophyta i rośliny lądowe) Chlorophyta (Chlorophyceae, Ulvophyceae, Trebuksiophyceae, Prasinophyceae)

Jaki był mechanizm redukcji genów genomu organellowego.

Genom Synchocystis - Cyanobacteria - 3,573 Kb i 3,200 genów>> coraz większa zależność od genomu gospodarza

• utrata genów

• substytucja genów

• transfer genów

• wiele genów przeniesionych do jądra nie ma wcale funkcji w organellach

Przepływ genów pomiędzy mitochondriami i jądrem jest/ był trudny gdyż:

1. mitochondria nie zawsze mają ten sam kod genetyczny co jadro komórki w której się znajdują

2. transfer genów (o różnym kodzie genetycznym) z mitochondriów do jadra musi/musiał implikować różne ich redagowanie

3. (...) z jądra do mitochondriów uniemożliwają przepływ genów z mitochondriów do jądra

4. genomy mitochondrialne bardzo różnia się od siebie w różnych grupach systematycznych. Jeśli wszystkie pochodzą od wspólnego przodka, wiele genów musiałoby wędrować pomiędzy mitochondriami a jądrem wielokrotnie.

Hydrogenosomy - organelle produkujące wodę

Pochodzenie hydrogenosomów

Różnice:

• brak DNA, grzebienia mitochondrialnego, cytochromów, fosforylacji oksydacyjnej, brak produkcji wodoru w mitochondriach

Podobieństwa:

• otoczone są podwójną błoną i dzielą się przez podział

• ten sam mechnizm importu białek z cytoplazmy do organelli; białka importowane są do hydrogenosomów mają presekwencje kierujące charakterystyczne dla białek mitochondrialnych

Mitosomy - szczątkowe mitochondria; odkryto je u Endomoeaba histolytica w 1999r.

Teoria kompartmentacji - teoria konkurencyjna do endosymbiotycznej:

• Eukaryota powstały z Prokaryota na drodze kompartmentacji - wpuklenia się błony cytoplazmatycznej

• ER, Golgi, błona jadrowa, lizosomy

• Chloroplasty i mitochondria - komkpartmentacja plazmidów wewnątrz wpukleń błony kom.

Prokaryota Eukayota

1. 1-10 nm 1. 10-100 nm

2.beztlenowe 2. Tlenowe

3. brak organelli 3. Organella

4. koliste DNA 4. Liniowe DNA

5. głównie kodujące regiony 5. Wiele niekodujacych

6. RNA i białka w komórce 6.RNA w jądrze;białka w

cytoplazmie

7. brak cytoszkieletu 7. Cytoszkielet

8. podział- przewężenie 8. Mitoza , mejoza

9. głównie 1-komórkowe 9. Wielokomórkowce

W. 11 EKSPRESJA GENÓW

1. kontrola tranksrypcji

2. transkrypcja

3. kontrola dojrzewania RNA

4. kontrola transportu i lokalizacji mRNA

5. kontrola translacji

6. regulacja degradacji mRNA

7. regulacja aktywności białka

Postranslacyjna obróbka białek

1. fałdowanie i niekowalencyjne wiązanie kofaktorów

2. modyfikacje kowalencyjne; glikozylacja, fosforylacja, acetylacja itd.

3. Łączenie się z innymi podjednostkami białkowymi

Fałdowanie:

• struktura pierwszo-, drugo - i trzeciorzędowa , nie wszystkie białka fałdują spontanicznie, białka opiekuńcze - molecular chaperones- molekularne przyzwoityki

• Hsp 70 wiąże się z hydrofobowym rejonem białka jeszcze w trakcie jego syntezy

• Do pofałdowania dochodzi w środkowym otworze ukłądu tworzonego przez wiele podjednostek (GTOL/GroES)

Proteolityczne roszczepienie białka

>> usuwanie krótkich peptydów z N lub C końca - skrócona cząsteczka jest aktywna, np. suniecie peptydu sygnałowego, który zatrzymał białko w cytoplazmie i uniemożliwił transport na zewnątrz komórki

• cięcie dużej częsteczki na mniejsze - aktywne cząsteczki białka np. obróbka preproinsuliny; w wyniku tej obróbki powstaje aktywna insulina

Modyfikacje

Acetylacja (np. histon H3) - acetylazy

Metylacja (np. histon H3) - metylazy

Fosforylacja - kinazy

• glikozylacja typu O - przyłączenie bocznego łańcucha cukrowego poprzez grupę hydroksylową do seryny i treoniny

• glikozylacja typu N - przyłączenie bocznego łańcucha cukrowego poprzez grupę aminową grupy asparaginy

• acylacja - przyłączenie łańcuchów lipidowych poprzez serynę lub cysteinę

>> transferaza przenosi resztę cukrową z dolicholu na asparaginę , enzym ten jest połączony z cząsteczka transportera wprowadzającego białak do ER

Degradacja

• degradacja nieprawidłowo pofałdowanych białek lub uszkodzonych

• degradacja białek podczas cyklu komórkowego białek regulatorowych

• recykling aminokwasów (głodzenie komórki)

lizosom - pęcherzyki zawierające enzymy hydrolityczne; fuzjują z fagosomami (fagolizosom) lub z uszkodzonymi organellami (np. mitochondria)

proteasom - 80-90% białek jest degradowanych przez proteasom

Degradacja zależna od ubikwitynacji

Ubikwityna- białko globularne złożone z 76 aminokwasów, silnie konserwatywne ewolucyjnie

E1 - enzym aktywujący ubikwitynę

E2 - enzym wiążący ubikwityne

E3 - ligaza ubikwitynowa rozpoznająca substrat

W. 12 APOPTOZA - PROGRAMOWANA ŚMIERĆ KOMÓRKOWA = ŚMIERĆ SAMOBÓJCZA

50-70 mld komórek umiera każdego dnia w organizmie człowieka

Każda komórka żyje i umiera;

• jest zabijana pod wpływem czynnika uszkadzającego

• popełnia samobójstwo w wyniku indukcji

PCD - eliminuje komórki podczas rozwoju zarodkowego i z różnych tkanek dorosłego organizmu zachowując odpowiednią liczbę komórek w tkankach

Historia badań nad apoptozą

• 1966 J.W. Saunders „śmierć jest niezbędna do eliminowania organów i tkanek podczas wczesnego rozwoju embrionalnego”

• 1972 apoptoza „śmierć występująca naturalnie podczas rozwoju”

• 1981 odkryto geny kodujące białka indukujące apoptozę oraz białka indukujące apoptozę oraz białka antyapoptotyczne ced-9

• 1992 odkryto homolog ced-9 u człowieka bcl-2

• 2002 nagroda Nobla za „genetyczną regulację rozwoju organizmów i PCD”

U zwierząt apoptoza = programowana śmierć komórkowa (PCD)

PCD - kontrolowana i regulowana genetycznie forma śmierci komórek organizmu wielokomórkowego. Komórki biorą aktywny udział w procesie włąsnej śmierci.

NEKROZA - niekontrolowana śmierć wskutek uszkodzenia komórki prowadząca do jej lizy

PCD - wiele mechanizmów molekularnych i główne geny sterujące apoptozą w świecie zwierząt zostały zidentyfikowane

Wykazano, że proces PCD jest silnie konserwatywny ewolucyjnie u wszystkich grup zwierząt od C. Elegans do Homo sapiens

>> zachowana równowaga między powstawaniem kom. a umieraniem

niektóre geny promują a niektóre hamują apoptozę

Morfologia apoptozy - przejawy apoptozy:

• tworzenie się pęcherzyków w błonie, z których powstaną ciałka apoptotyczne

• redukcja organelli

• kurczenie się komórki

• kondensacja chromatyny

• fragmentacja jądra

• wyciek związków z mitochondriów

• na końcu drogi odpączkowują ciałka apoptotyczne - obłonione fragmenty komórek

Morfologia nekrozy

• pęcznienie komórki

• lizosomy zniekształcone

• dezintegracja błon (otoczki, mitochondriów, błony jądrowej, strawiony cytoszkielet)

• organella ulegają dezintegracji

• błona traci ciągłość

• wyciek elektrolitów, utrata krist mitochondriów

• nierównomierne rozproszenie chromatyny

• ER nabrzmiałe

Apoptoza Nekroza

- membrany nietknięte - błony dziurawe

- kurczenie się komórki - „rozpuszczanie” komórki

- pozostaje pod kontrolą - zniszczenie struktur

- fragmentacja jądra - stan zapalny

- często fagocytowana - pęcznienie komórki

- kondensacja chromatyny

- ciągłość błon

APOPTOZA

• przenoszenie sygnału apoptozy w komórce zależy od poziomu wewnątrzkomórkowego ATP; w komórce potrzebny jest odpowiedni poziom energetyczny i potencjał utleniająco-redukujący, niezbędne do podtrzymywania aktywności enzymów.

• Dochodzi do ekspresji genów i produkcji białek „śmierci” w jądrowym DNA

• Apoptozę cechuje określona sekwencja zmian biochemicznych i morfologicznych

Białka

Antyapoptotyczne Proapoptotyczne

Sekwencja zmian w apoptozie

• komórka traci wodę i elektrolity (obkurczenie)

• cytoplazma ulega kondensacji

• błona komórkowa uwypukla się

• zagęszczenie chromatyny i degradacja DNA

• pękanie mitochondriów i uwolnienie cytochromu c

• rozpad komórki na małe fragmenty otoczone błoną tzw. Kom. ciałka apoptotyczne

• przemieszczenie się cząsteczek fosfolipidu ... seryny z wewnętrznej na zewnętrzną warstwę błony komórkowej

• zmiany konformacyjne w błonie komórkowej

• aktywują sąsiednie makrofagi

Dlaczego komorki ulegają apoptozie - samobójczej śmierci

Niezbędne do prawidłowego rozwoju np.:

1. resorpcja ogona kijanki podczas metamorfozy żaby

2. zanikanie tkanki pomiędzy palcami u płodu

3. eliminowanie „nadmiaru” komórek podczas tworzenia się synaps w trakcie rozwoju mózgu

W dojrzałych tkankach stałe odtwarzanie, np. komórki krwi, tk. Nabłonkowych

Niszczenie komórek, które zagrażają integracji organizmu np.:

1. niszczenie komórek zainfekowanych przez wirusy przez cytotoksyczne limfocyty T (CLTS)

2. niszczenie uszkodzonych komórek zarodka z defektywnym DNA, poprzez intensywną produkcję p53 ( induktora apoptozy)

3. usuwanie komórek efektorowych systemu immunologicznego>>> chroby autoimmunizacyjne (stwardnienie rozsiane, gościec przewlekły)

Uszkodzone DNA

Komórki po uszkodzeniu DNA wzmagają produkcję białka p 53, które jest induktorem apoptozy. Mutacja genu p53 jest stwierdzona w wielu rodzajach nowotworów (zaburzona jest apoptoza)

Jakie czynniki decydują o rozpoczęciu apoptozy?

Zanik pozytywnych sygnałów np.:

• brak dostatecznej ilości czynników wzrostu dla neuronów

• brak interleukiny - 2 (ILO2) dla mitozy limfocytów

Dopływ negatywnych sygnałów:

• wzrost ras, UV działanie chemoterapeutyków

• kumulacja białek o nieprawidłowej III- rzędowej strukturze

• nagromadzenie się cząsteczek (ligandów) wiążących się ze specyficznym receptorem uruchamiają apoptozę komórki TGF-beta , TNF-alfa

Apoptoza: sygnały i realizacja

Ligand Fas, NF-alfa, cytochrom c>>> kaspazy początkowe: 6,8,9,12>> kaspazy wykonawcze: 2,3,7

Indukcja apoptozy

- pewien czynnik zewnętrzny musi rozpoznać receptor w błonie kom.>> np. zapalne cytokiny rozpoznają receptory w błonie , tworzy się kompleks śmierci i dochodzi do uruchomienia enzymów

Zewnętrzny, receptorowy, szlak apoptotyczny

Wewnętrzny, mitochondrialny szlak

1. szlak wewnętrzny (szlak niemitochondrialny)>> sygnały odbierane są przez są przez receptory należące do rodziny TNF obecne w błonie komórek:

• TNFR 1 dla TNF -alfa

• Apo 1/ Fas

• NGFR dla NGF-alfa

• TRAIL (na komórkach nerwowych)

2)szlak wewnętrzny (mitochondrialny) - sygnał uszkadzający DNA powoduje zaburzenie potencjału błonowego mitochondriów i otwieranie kanałów mitochondrialnych MPTP. Pęcznienie macierzy mitochondrialnej powoduje przerwanie błony zewnętrznej i przedostanie się cytochromu c , czynnika AIF oraz białka Cmac/DIABLO do cytoplazmy komórki

Receptorowy szlak indukcji apoptozy

-ligand rozpoznaje receptor

1. Fas + FasL >>>DISC>>aktywacja kaspazy 8>> kaskada kaspaz

DISC - kompleks DED (death domain protein) + FADD (FAS+DED)

2. TNF + TNRF ½ >> DISC>> aktywacja kaspazy 8>> kaskada kaspaz

Mitochondrialny szlak indukcji apoptozy

• wokół mitochondriów

• indukcja przez czynnik w komórce

• wyciek cytochromu c do cytoplazmy

Bcl-2>> Apaf-1>> BAK i BAX

PROGRAMOWANA ŚMIERĆ KOMÓRKOWA (PCD) U ROŚLIN

Apoptoza u zwierząt jest programowaną śmiercią komórkową (PCD) ale PCD u roślin nie zawsze pozostaje pod kontrolą tych samych genów apoptotycznych funkcjonujących u zwierząt.

Mechanizmy molekularne u roślin są o wiele mniej poznane. Analiza genomu Arabidopsis wykazała brak homologów kilku kluczowych genów apoptozy m. In. Z rodziny Bcl, Bcl-2 i kaspaz

Śmierć wielu komórek i tkanek jest warunkiem rozwoju roślin wyższych

• w fazie embrionalnej

• w organach wegetatywnych

• w organach generatywnych

Programowana śmierć komórek w rozwoju roślin wyższych ma kilka przejawów cytomorfologicznych, w zależności od typu komórek i tkanek ulegających śmierci.

• PCD elementów trachearnych i sklerenchymatycznych - degradację protoplastu poprzedza synteza wyspecjalizowanej ściany komórkowej, która pozostaje i pełni niezbędne funkcje

• PCD tapetum - degradację protoplastu poprzedza liza komórki

• PCD mezofilu - pozostawia ściany komórek liścia

• PCD bielma - obejmuje protoplast i matriks zewnątrzkomórkową na rzecz rozwijajacego się zarodka

Fragmentację DNA wykazano we wszystkich tkankach dwiema metodami:

• elektroforeza pojedynczych komórek na żelu (cometassay)

• reakcja TUNEL- (terminam deoxynucleotidyl transferase)- mediated....

W komórkach tapetum internukleosomalne cięcie jądrowego DNA oraz kondensacja chromatyny i jej przemieszczenie do otoczki jądrowej rozpoczyna się przed zmianami w strukturze i funkcji pozostałych organelli i przedziałów komórkowych>> śmierś taperum jest formą PCD

Proces starzenia się liści jest formą PCD

• mitochondria zachowują wewnętrzną organizację błon, aż do późnego etapu starzenia się komórek mezofilu charakteryzującego się zmianą struktury chloroplastów oraz kondensacją chromatyny w jądrach

• brak jednoczesnej redukcji potencjału we wszystkich mitochondriach starzejąch się komórek mezofilu wyklucza mitochondria jako ośrodek przekazywania pierwszych sygnałów proapoptotycznych podczas programowanej śmieric komórek mezofilu

Mechanizm tworzenia się apoptosomu: wiązanie Apaf 1 (monomeru) z cytochromem c (WD40)>> oligomeryzacja Apaf 1 (NB-ARC)- tworzenie kołowej platformy>> wiązanie z kaspazą 9 (CARD)

Kaspaza - faza wykonawcza apoptozy

• proteazy cysteinowe

• występują w cytoplazmie w formie proenzymów

• poznano dotychczas 14 kaspaz: inicjujące proces: 2,8,9,10

• degradują aktynę w komórce

• prowadzą do zmian morfologicznych i biochemicznych materiału genetycznego

• kaspaza 9 + Apaf 1 + cytochrom c = apoptosom

• kaspaza uaktywnia następne kaspazy - cięcie białka przy kwasie asparaginowym (kaskada kaspaz)

Kaspazy

>> inicjatorowe - 9 i 8 aktywowane przez dimeryzację

>> egzekutorowe - 3 i 7 są aktywowane przez odcięcie N-terminalnego peptydu i podział na małą i dużą podjednostkę

• Helicobacter pylori - apoptoza komórek nabłonka błony śluzowej

• Mycobacterium tuberculosis - apoptoza monocytów, makrofagów, komórek nabłonka dróg oddechowych

• Streptococus pneumonae - apoptoza neuronów

Wewnątrzkomórkowe protista:

Trypanosoa cruzi - obniżona ekspresja receptorów Fas na limfocytach poprzez podwyższony poziom IFN-g zakażone makorofagi produkują białko hsp-65

Cryptosporidium parvum - aktywacja jądrowego czynnika NF, hamowanie apoptozy erytrocytów

Pasożyty zewnątrzkomórkowe

>> załamanie potencjału błonowego powoduje uwonienie cytochromu c do cytoplazmy

Różnice pomiędzy PCD roślin a apoptozą zwierząt:

• inne wzory rozwoju roślin i zwierząt

• inna struktura metaboliczna , organizacja (wakuola, ściana komórkowa)

• hormony są inne - fitochormony maja inną budowę i funkcję niż zwierzęce

• mechanizmy u roślin są gorzej poznane; nie znaleziono homologów głównych genów.

---