WYBRANE TECHNIKI CYTOGENETYKI MOLEKULARNEJ OPARTE O FISH (konspekt)
M-FISH (wielokolorowa FISH)
Zasada: Technika polega na jednoczesnym wybarwieniu wszystkich chromosomów na różne kolory (każda sonda specyficzna dla danego chromosomu znakowana kombinacją jednego lub kilku barwników fluorescencyjnych). Sondy malujące tak przygotowane, aby nie wiązały się z sekwencjami powtarzalnymi i chromosomowo niespecyficznymi (zablokowane sekwencje centromerowe i regiony heterochromatyny).
Zastosowanie:
- diagnostyka aberracji strukturalnych chromosomów - zwłaszcza złożonych translokacji (z udziałem kilku chromosomów lub niewidocznych w analizie prążkowej tzw. Ukrytych translokacji - obejmujących fragmenty o identycznym wzorze prążkowym)
- identyfikacja chromosomów markerowych, neocentrycznych chromosomów markerowych (NMC) lub dodatkowego materiału nieznanego pochodzenia znajdującego się w którymkolwiek z chromosomów
- diagnostyka cytogenetyczna komórek nowotworowych (identyfikacja licznych i złożonych aberracji liczbowych i strukturalnych chromosomów - często analiza na podstawie barwień klasycznych niemożliwa ze względu na niską rozdzielczość prążków i małą liczbę metafaz)
M-FISH a chromosomy markerowe:
→ zastosowanie przy nietypowym wyglądzie chromosomu markerowego (aby ustalić jego pochodzenie)
uwaga!
małe odcinki euchromatyny mogą zostać niewykryte; również chromosom markerowy zawierający jedynie sekwencje centromerowe (zablokowane sekwencje powtarzalne) może zostać niezdiagnozowa - rozwiązanie cenM-FISH (Centromere-specific multi-color FISH) - pozwala na identyfikację centromerów z wykorzystaniem znakowanego centromerowego DNA jako sondy; technika użyteczna w charakterystyce małych nadliczbowych chromosomów markerowych pozbawionych lub z niewielką ilością euchromatyny
M-FISH a SKY-FISH
W technice SKY-FISH subiektywna ocena barwy światła przez oko ludzkie zastąpiona spektrofotometryczną analizą widma światła emitowanego przez poszczególne chromosomy.
Sonda komplementarna do określonego chromosomu jest unikatową kombinacją od jednego do kilku barwników fluorescencyjnych różniących się widmem emitowanego światła. Po przetworzeniu w odpowiednim programie komputerowym uzyskujemy różnokolorowy obraz kariotypu, w którym każda para chromosomów wybarwiona jest innym kolorem
W technice SKY stosuje się jednocześnie 24 sondy molekularne (dla każdej pary chromosomów autosomalnych oraz dla X i Y inna) wyznakowane różnymi kombinacjami 5 różnych fluorochromów. Komputerowa analiza widmowa obrazu po hybrydyzacji - ocena całego kariotypu w jednym badaniu. Komputer nadaje poszczególnym chromosomom pseudokolory- analiza w programie do kariotypowania z modułem M-FISH lub SKY
Co możemy wykryć dzięki SKY
→ określić punkty pęknięć chromosomów
→ wykryć niewielkie translokacje
→ określić skład chromosomów markerowych i jednolicie barwiących regionów HSR
→ scharakteryzować złożone rearanżacje
Czego nie możemy wykryć dzięki SKY
→ inwersji
→ duplikacji
→ delecji
Multicolor banding FISH (mBAND-FISH)
Metoda FISH pozwalająca wizualizować jedną parę chromosomów z prążkami różnego pseudo koloru; pozostałe chromosomy wybarwione DAPI. Uwaga: mBAND nie odpowiadają prążkom G w systemie ISCN.
Porównawcza hybrydyzacja genomów (CGH)
Technika umożliwia mapowanie zmian liczby kopii określonych sekwencji DNA w chromosomach bez uprzedniej wiedzy o ich istnieniu, czy też znajomości ich umiejscowienia w genomie.
Główne założenie:
jednoczesna i kompetytywna hybrydyzacja dwu znakowanych różnymi fluorochromami izolatów DNA uzyskanych z komórek pacjenta oraz komórek prawidłowych (sondy) do normalnej płytki metafazowej (DNA znakowany jest przede wszystkim w reakcji nick-translacji)
Co jest potrzebne: preparat cytogenetyczny (chromosomy osoby o prawidłowym kariotypie), DNA osoby badanej wyznakowany jednym fluorochromem (np. fluorescencja zielona), DNA kontrolny - prawidłowy DNA wyznakowany innym fluorochromem (np.fluorescencja czerwona), Cot1 DNA do wysycenia regionów zawierających sekwencje wysoko powtarzające się.
Przebieg analizy: Po przeprowadzeniu hybrydyzacji do płytek metafazowych mieszaniny DNA znakowanego odpowiednio na zielono (DNA pacjenta) i na czerwono (DNA referencyjny otrzymany z prawidłowych komórek dawcy) [sondy konkurują o DNA chromosomu] podlegają dalszej analizie z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD podłączonej do komputera.
Analiza wyników: Po ułożeniu kariotypu - analiza stosunku fluorescencji na całej długości chromosomów dzięki zastosowaniu specjalistycznego programu komputerowego; najczęściej analizuje się 10 - 16 chromosomów dla każdego przypadku; wyniki analizy w postaci profili intensywności fluorescencji w obu kolorach oraz wartości stosunku „zieleń : czerwień” wzdłuż każdego chromosomu. Wartość >1 lub <1 w określonym regionie danego chromosomu oznacza odpowiednio zwiększenie lub zmniejszenie w DNA nowotworowym liczby kopii sekwencji DNA specyficznej dla tego regionu ; nieprawidłowe regiony chromosomów (wykazujące delecje, duplikacje) można charakteryzować wykorzystując specyficzne sondy i klasyczną technikę FISH. Odchylenia od osi pionowej (stosunek równy 1) w kierunku czerwieni świadczą o delecji materiału genetycznego w danym regionie chromosomu u pacjenta, w kierunku zieleni o amplifikacji lub duplikacji tego regionu.
ZALETY:
możliwość analizy aberracji w obrębie wszystkich chromosomów przy wykorzystaniu pojedynczej hybrydyzacji oraz uniknięcie często niemożliwych do wykonania badań opartych na cytogenetyce klasycznej
możliwość zastosowania na tkankach, z których nie uzyskano dzielących się komórek
możliwe badanie komórek nowotworowych
WADY:
nie jest wiarygodne rozpatrywanie delecji czy addycji chromosomowych w obszarach centromeru i telomerów
utrudniona diagnostyka mozaikowości
brak możliwości wykrywania aberracji zrównoważonych (translokacja, inwersja)
Co możemy wykryć dzięki CGH
pojawienie się dodatkowych chromosomów lub utratę całych chromosomów
duplikacje i delecje fragmentów chromosomów
translokacje niezrównoważone
Czego nie możemy wykryć dzięki CGH
inwersji
translokacji zrównoważonych
CESH (Comparative Expressed Sequence Hybridization)
Pierwsza technika pokazująca pełen profil ekspresji genów bezpośrednio w chromosomach (Lu et al., 2001). Zasad taka sama jak w przypadku CGH.
FIBER-FISH
Hybrydyzacja do włókien chromatynowych - wykorzystuje chemiczne i fizyczne działania na chromosomach interfazowych rozluźniające i prostujące włókna chromatyny tak, że obrazowane mogą być pojedyncze pętle DNA
Możliwe odróżnienie sond leżących w odległości kilku kpz od siebie
Analizując wynik hybrydyzacji zwracamy uwagę na:
liczbę sygnałów na danym włóknie, które obejmuje zazwyczaj loci o znanej lokalizacji
wzajemne położenie tych loci
Uwaga: kiedy kolejność testowanych loci na włóknie znana - przedstawiamy je w porządku pter do qter
MICRO-FISH
Etapy analizy
Pobranie chromosomu obarczonego aberracją lub chromosomu markerowego przy użyciu odpowiedniej aparatury - mikrodysekcja (chromosomy uprzednio barwione (GTG).
Pobrany materiał namnażamy techniką DOP-PCR (degenerate oligonucleotide-primed polimerase chain reaction)
Namnożony produkt wykorzystujemy następnie w charakterze sondy do FISH
- znakujemy sondę stosując jedną z technik znakowania
- wyznakowaną sondę dodajemy do mieszaniny hybrydyzacyjnej
4) FISH wykonujemy u badanego pacjenta ze zmienionym kariotypem oraz dla porównania na prawidłowych płytkach metafazowych, aby określić pochodzenie aberracji
MICROARRAY CGH
Zasada metody: Taka sama jak dla CGH (tzn. DNA kontrolny i DNA badany wyznakowane różnymi fluorochromami), ale sekwencja docelowa to małe odcinki DNA umieszczone na mikromacierzy; mikromacierz może zawierać klony DNA pokrywające tylko jeden chromosom, wybrane regiony odpowiedzialne za zespoły genetyczne lub cały genom. Umożliwia analizę całego genomu, fragmentów chromosomów lub określonych chromosomów z rozdzielczością zależną tylko od liczby zastosowanych klonów. Ocenę niezrównoważenia kariotypu przeprowadza się przez określenie profilu fluorescencji - zielony/czerwony uzyskanego w poszczególnych parach chromosomów homologicznych i analizie ilościowej ich wzajemnego stosunku. Statystyczna analiza polega na uśrednieniu wyników uzyskanych dla 10-20 płytek metafazowych; termin „częściowa aneuploidia” używany do określenia aberracji wykrytej tą metodą - niemożliwe określenie, czy nadwyżkowy materiał jest duplikacją, czy chromosomem markerowym, wiadomo jedynie, że dany segment DNA występuje w nieprawidłowej ilości
ZALETY:
bardzo wysoka rozdzielczość badania
możliwość wykrywania bardzo małych delecji
WADY:
niemożliwe wykrywanie aberracji zrównoważonych
wysoki koszt badania
utrudniona diagnostyka mozaikowości