Jonoselektywne elektrody membranowe (ISE)
Potencjometria bezpośrednia w diagnostyce laboratoryjnej
∙ oznaczenia stężenia elektrolitów w płynach ustrojowych
- kationy: H,K,Na,Ca,Mg, amony
- aniony:
F,Cl, wodorowęglowe
Ogniwo pomiarowe
-elektroda pomiarowa ( wskaźnikowa) której potencjał elektryczny zależy od aktywności oznaczanego jonu w roztworze badanym (najczęściej elektrody jonoselektywne ISE
-elektroda odniesienia ( porównawcza), której potencjał jest stały w warunkach pomiaru (najczęściej elektroda chlorosrebrowa)
SEM ogniwa zanurzonego w r-rze badanym zależy od aktywności (stężęnia) oznaczanego
jonu (stosuje się zwykle 1 kombinowaną elektrodę w 1 obwodzie)
Elektrody pomiarowe = ISE
∙cecha wspólna = obecność membrany selektywnie oddziałującej z oznaczanymi jonami
Oddziaływanie to jest źródłem potencjału elektrycznego elektrody
Część membranoa najważniejsza, zewnętrznie styka się z r-rem badanym, a wewnątrz styka się roztworem elektrolitu ( ciecz, żel), który ma jony na które metoda (elektroda) jest czuła i elektroda wyprowadzająca)
Membrana bezpośrednio połączona z przewodem wyprowadzającym , bądź pośrednio przez płytkę z tym przewodem.
Zalety potencjometrii bezpośredniej z wykorzystaniem ISE
∙ szeroki zakres prostoliniowości (zależność SEM od stężenia, linia prosta w szerokim zakresie stężeń)
∙ bardzo niskie granice oznaczalności i wykrywalności
∙ wysoka selektywność (konkretny jak w układach wieloelektrodowych, zdeterminowane obecności ą elektrody)
Podział ISE
I ISE z membranami stałymi
II ISE z membranami ciekłymi
III ISE z membranami podwójnymi
I ISE z membranami stałymi (do pomiaru pH)
1. Szkło o składzie warunkującym czułość elektrody na określone kationy (H+, K+, Na+, NH4+) - zwykle w jonometrii
2. Nieorganiczne sole (halogenki , siarczki) w formie monokryształu, sprasowanego materiału krystalicznego lub rozproszonego w obojętnej matrycy (żywica lilikanowa)
Przykłady
- fluorek lantaru LaF3 - elektroda czuła na aniony fluorkowe
-halogenki srebra (Agi, AgCl, AgBr)elektroda czuła na jony srebra oraz aniony Cl-, Bi-, I-
-siarczek srebra elektroda czuła na jony srebra i aniony siarkowe
-siarczek srebra + siarczki metali ciężkich , elektroda czuła jw.+ kationy metali (Pb, Hg, Cd)
II ISE z membranami ciekłymi
Obojętna chemicznie porowata matryca (PCV, octan celulozy, ;polietylen, żywica silikonowa, materiał ceramiczny) zwilżona rozpuszczalnikiem organicznym zawierającym hydrofobowy związek oddzieł.z ozn. Jonem ( kationit, anionit, zw. kompleksujący obojętny nośnik = jonofor)
Przykład :
- Walinomycyna - jonofor, zdolny do selektywności o wiąza K+ i przenoszenia ich poza błony biologiczne
- membrana z PCV impregnowana antybiotykiem walinomycyną - ISE czuła na jony K+.
III ISE z membranami podwójnymi
∙ elektrody enzymatyczne
∙ elektrody gazowe
Przykłady elektrody enzymatycznej
-ISE do oznaczania mocznika w płynach ustrojowych
∙ Budowa - elektroda szklana czuła na jony NH4+, pokryta warstwą membranową zawierającą enzym ureazę
∙ działanie - pod wpływem ureazy zawartej w próbce mocznik ulega rozkładowi z wytworzeniem jonów NH4+, których stężenie odpowiada stężeniu mocznika, a na które reaguje zminą potencjału elektroda szklana.
Przykłady elektrody hazowej
Elektroda do oznaczania CO1 we krwi
∙ Budowa: elektroda szklana czuła na jony H+ mieszczona w zbiorniku wypełnionym buforem o ściśle określonym pH. Dno zbiornika stykające się z próbką badaną stanowi membrana z tlenem lub polietylen, przepuszczalna dla CO2
∙ działanie : gaz dyfunduje do wnętrza zbiornika z buforem zmieniając jego pH, co rejestruje elektroda szklana
CO2 + H20 H+ + HCO3 -
Selektywność ISE
∙ im mniejsza wartość k, tym ISE bardziej selektywna
∙ miarą selektywności ISE jest wartość współczynnika selektywności k określonego względem konkretnego jonu interferującego
∙ ISE nie są idealne selektywnie na wartość potencjały może wpływać obecność innych jonów w roztworze badanym.
Współczynnik k informuje ile razy stężenie jonu interferującego ( przeszkadzającego) musi być większe od stężenia jonu oznaczanego, aby spowodować 100% błąd oznaczenia tzn., aby potencjał wywołany przez jon interferujący był taki sam jak potencjał wywołany przez jon oznaczony
Np. k=0,0001 oznacza że stężenie jonu przeszkadzającego muis być 10 000 razy wyższe od oznaczanego, aby wytworzyć taki sam potencjał elektrody
kation
|
Potencjał ISE E=E0 ± ( 0,059/z) log c (stężenie jonu)
Wzór Ernsta | | | |
| | anion Wartościowość jonu
Potencjał elektrody
|
Potencjał jonowy elektrody
Czułość ISE s = ± 0,059/z
Informuje w jakim kierunku i o ile zmieni się potencjał ISE (= SEM ogniwa), jeśli stężęnia oznaczanego jonu wzrośnie 10 razy
Dla M+ wzrost SEm o S[V]
Dla M- spadek SEM o S[V]
Im wyższa bezwzględna wartość S tym ISE bardziej czuła !
Czułość ISE zmniejsza się ze wzrostem wartości jonu
2 : 1 0,059/4 = 55mV
2 : 2 0,059/2 = 29,5mV
2 : 3 0,059/3 = 19mV
Teoretyczna wartość S niemal zawsze różni się od wartości rzeczywistej, której zmienną jest nachylenie charakterystyki ISE
Charakterystyka ISE
Wykres zależności SEM ogniwa pomiarowego zestawionego i testowanej ISE i elektrody odniesienia od stęż. Zon. Jonu (logC lub PC)= krzywa kalibracyjna ISE.
1.Roztwory wzorcowe o wyższym stężeniu
2. Zestawić ogniwo pomiarowe kolejno w każdy 1 (r-ry wzorcowe)
3. Dla każdego rejestrować SEM
Równanie prostej opisującej prostoliniowy odcinek krzywej kalibracyjnej
SEM [Mv] = A ± S log c
A - potencjał formalny ISE wyznaczony względem elektrody odniesienia - stała dla danego ogniwa pomiarowego obejmującego potencjał normalny ISE i potencjał elektrody odniesienia.
Dla kationów :
Wzrost stężenia powoduje wzrost SEM ogniwa pomiarowego
Dla anionów :
Wzrost stężenia powoduje obniżenie SEM ogniwa pomiarowego
UWAGA!! Wzrost stężenia = wzrost wartości logC, ale obniżenie pH
Biosensory = bioczujniki, czujniki biologiczne
Przyrządy zwykle zminiaturyzowane, stosowane w analizie medycznej, biotach., ochronie śr. Do oznaczania zw. biologicznie czynnych
Budowa: sygnał
Subst. Oznaczana (analit | element przetwarzający (sensor, czujnik) ------- rejestracja
^ przetwarzanie sygnału
Biologiczny element detekcyjny
Reakcja agalitu z wartwą receptorową generuje sygnał, który przekształca się przez El. Przetw. Bio.
Warstwa receptorowa= materiał aktywny biologicznie odpowiedzialny za selektywność biosensora
-enzym immunobiologiczny
-przeciwcziala
-zywe mikroorganizmy
- tk. Roślinne i zwierzęce
-organella komórkowe
Biosensory:
-potencjometryczne
-amperometryczne
-optyczne (optoelektryczne)
-termistorowe
-piezoelektryczne
Biosensory enzymatyczne:
- bardzo wysoka selektywność w stosunku do substratu
- procedura immobilizacji :
∙chemicznie (kowalencyjnie) lub fizycznie zw. bezpośrednio z pow. Sensowa
∙fizycznie lub chemicznie
Biosensory mikrobiologiczne
-wykorzystują naturalną aktywność biokatalityczną żywych kom. Bakteryjnych (zaw w nich enzymów)
-bakterie są fiz. Zw. z pow. Sensora po przez unieruchomienie za pomocą membrany, przep. Szklanej dla enzymów.
-duża czułość, ale mała selektywność i długi czas odpowiedzi)
-wrażliwe na obecność w analizowanych próbkach zw. wpływających na szybkość metabolizmu kom. Bakterii = możliwość wykorzystywania do oznaczania trucizn, toksyn i mutagenów.
Biosensory tkankowe:
-cienki plaster tkanki lub izolowane organelle kom. Zmieszczone na końcówce sensora i zabezpieczone porowatą membraną
-lepsza selektywność
-bardzo długi czas życia
Immunosensory:
- oparte na selektywności oddziaływania przeciwciała z antygenem z wytworzeniem stabilnego, termodynamicznego kompleksu (specyficzność detekcji)
-jako wartw. Recept. Biosensora można wykorzystać oba skł. Kompleksu
-wyznaczają pośredni typ. Detekcji, wymagający obecności znaczników (np. fluorescencyjnych) umożliwiających śledzenie reakcji wiązania agalitu z receptorem.
Biosensory z przetwornikiem potencjometrycznym
∙warstwa receptorowa to najczęściej immunobilizowany enzym
∙ przetworniki ISE czułe na jony których stężenie w próbce zmienia się w wyniku reakcji enzymatycznej (często elektroda szklana)
Mocznik - końcowy produkt degradacji białek w organizmie człowieka.
Znaczenie diagnostyczne poziomu we krwi :
∙ ocena wydolności nerek
∙ kontrola pozanerkowego oczyszczenia krwi ( dializoterapia)
Oznaczenie metabolizmu enzymatycznego pomiar stężenia produkcji hydrolizy mocznika katalizowanej przez ureazę.
Mocznik + H2O amoniak + CO2
Biosensory do oznaczania mocznika:
∙ wartwa receptorowa: immobilizowana ureaza
∙przetworniki : np. ISE czuła na NH+ lub H+ (zmiany pH) elektroda gazowa czuła na CO2 (pozostający w równowadze z jonami HCO3- i CO32- lub NH3 (pozostający w równowadze z jonami amonowymi), czuły na jony wodorkowe tranzystor polowy (ISFET)
Schemat ideowy ISFET:
Elektroda odniesienia, bramka, izolator, kanał, membrana jonowymienna, źródło, dren, podłoże.
∙ główny element pomiarowy membrana jonowymienna czuła na określony typ jonów naniesiona na bramkę tranzystora (membrana może być zwizana z enzymem = ENFET)
∙ napięcia sterujące przyłożone do bramki przy określonej wartości potencjału na granicy membrana - roztwór zapewnia określoną wartość mierzonego sygnału wyjściowego
∙ wymiana jonów powoduje skok potencjału na granicy membrana - roztwor.
∙ zmiana sygnału wyjściowego jest proporcjonalna do aktywności oznaczanych jonów
Biosensory z przetwornikiem amperometrycznym :
- warstwa receptorowa: najczęściej enzymy lub mikroorganizmy ( szczepy bakteryjne)
- przetworniki : elektroda tlenowa Clarka lub elektroda rejestrująca nadtlenek wodoru
Przykłady oznaczania z wykorzystaniem biosensorów amperometrycznych
∙ cholesterol oksydaza cholesterolowa /H2O2
∙ α - aminokwasy : oksydaza - α- aminokwasy / H2O2 lub O2
∙ amoniak - bakterie nitrujący / tlen
∙ szczawiany : oksydaza szczawianowa / tlen
∙ glukoza : pseudomonas fluorescens / tlen
Elektroda tlenowa Clarka = elektroda amperometryczna
(oznaczanie Cl, H2S, O2 = stężenia lub ciśnienia )
∙ wartość mierzonego prądu elektrody amperometrycznej wynika z reakcji wymiany O- pomiędzy oznaczaną substancją, a elektrodą roboczą (katodą)
Elektroda tlenowa Clarka:
∙ katoda : platyna ∙ anoda : elektroda chlorosrebranowa ∙ elektrolit : nasycony KCl
∙ membrana : 1 przepuszczalna jedynie dla O2
∙ warstwa oksydazy glukozowej
∙ membrana 2 przepuszczalna dla substratów i produktów reakcji
∙ tlen ulega redukcji na katodzie
∙ prąd na wyjściu zależy od wymiany elektronów między tlenem a katodą.
∙ ubytek tlenu w próbce zmniejsza prąd tlenowy dyfundując w stanie katody.
F-glukoza + O2 D - glukonolakton + H2O2
Amperometryczny biosensor do oznaczania glukozy :
- warstwa receptorowa : oksydaza glukozowa immobilizowana w membranie przepuszczalnej dla glukozy i tlenu (teflon)
- przetwornik : elektroda tlenowa Clarka
∙ spadek natężenia prądu jest proporcjonalny do stężenia glukozy w próbce
∙ odczyt z krzywej kalibracyjnej (pomiar spadku natężenia prądu dla roztworów o różnych stężeniach glukozy.
Natężęnie prądy dla El. Clarka jest < jeżeli zmniejszymy w próbce zawartość substratu dla enzymu.
Biosensory optyczne:
∙ wartwa receptorowa immobilizowana na powierzchni włókna światłowodowego połączonego z przetwornikiem zmniejsza sygnał optycznu na elektrodzie.
∙ detekcja bezpośrednia i reakcja analit - receptor generuje sygnał optyczny lub osłabia już istniejący.
∙ detekcja pośrednia : wykorzystywana np. w optycznych biosensorach do oznaczania glukozy
Budowa optycznego biosensora
∙ mamy białko z gr. Leukin, unieruchamia się dekstran. Wnętrze jest oświetlone. Membrana przepuszczalna dla glukozy. Glukoza wypiera dekstran. Natężenie fluorescencji można mierzyć.