Jonoselektywne elektrody membranowe (ISE) i biosensory w diagnostyce laboratoryjnej

Potencjometria bezpośrednia w diagnostyce laboratoryjnej:

Oznaczanie stężenia elektrolitów w płynach ustrojowych:

• kationy: H,K,Na,Ca,Mg, amonowy

• aniony: F,Cl, wodorowęglowe

Ogniwo pomiarowe:

• elektroda pomiarowa ( wskaźnikowa), której potencjał elektryczny zależy od aktywności (stężenia) oznaczanego jonu w roztworze badanym (najczęściej elektrody jonoselektywne ISE)

• elektroda odniesienia ( porównawcza)- zachowuje w trakcie pomiarów stały, odtwarzalny potencjał, praktycznie niezależny od stężenia oznaczanego jonu (najczęściej elektroda chlorosrebrowa)

SEM ogniwa zanurzonego w r-rze badanym zależy od aktywności (stężenia) oznaczanego

jonu (stosuje się zwykle 1 kombinowaną elektrodę w 1 obwodzie). Dla rozcieńczonych r-rów a=c.

Mierzymy siłę elektromotoryczną ogniwa a nie roztworu!

Pomiędzy powierzchnią membrany, a stykającym się z nią r-rem(badanym i wewnętrznym) zachodzi reakcja wymiany jonowej, w wyniku której na granicy faz membrana/ roztwór powstaje potencjał elektryczny. Materiał membrany dobiera się tak, by wymiana jonowa zachodziła głównie z jednym rodzajem jonów- wtedy potencjał membrany zależy przede wszystkim od stężenia tego jonu.

Elektrody pomiarowe = ISE

• Cecha wspólna = obecność membrany selektywnie oddziałującej z oznaczanymi jonami. Oddziaływanie to jest źródłem potencjału elektrycznego elektrody.

• Część membranowa najważniejsza, zewnętrznie styka się z r-rem badanym, a wewnątrz styka się roztworem elektrolitu ( ciecz, żel), który ma jony na które metoda (elektroda) jest czuła i elektroda wyprowadzająca)

• Membrana bezpośrednio połączona z przewodem wyprowadzającym , bądź pośrednio przez płytkę z tym przewodem.

Zalety potencjometrii bezpośredniej z wykorzystaniem ISE:

• szeroki zakres prostoliniowości (zależność SEM od stężenia, linia prosta w szerokim zakresie stężeń)

• bardzo niskie granice oznaczalności i wykrywalności

• wysoka selektywność (konkretny jak w układach wieloelektrodowych, zdeterminowane obecnością elektrody)

Podział ISE:

1. ISE z membranami stałymi: szklane i krystaliczne

2. ISE z membranami ciekłymi

3. ISE z membranami podwójnymi

1. ISE z membranami stałymi (do pomiaru pH):

1. Szkło o składzie warunkującym czułość elektrody na określone kationy (H⁺, K⁺, Na⁺, NH4⁺) - zwykle w jonometrii

2. Nieorganiczne sole (halogenki, siarczki) w formie monokryształu, sprasowanego materiału krystalicznego lub rozproszonego w obojętnej matrycy (żywica silikonowa)

Przykłady:

• fluorek lantanu LaF₃ - elektroda czuła na aniony fluorkowe

• halogenki srebra (Agi, AgCl, AgBr)- elektroda czuła na jony srebra oraz aniony Cl^-, Bi^-, I^-

• siarczek srebra- elektroda czuła na jony srebra i aniony siarkowe

• siarczek srebra + siarczki metali ciężkich- elektroda czuła jw.+ kationy metali (Pb, Hg, Cd) elektrody złożone z dwóch siarczków, np. Ag₂S/CuS, Ag₂S/HgS, Hg₂S/PbS, czułe na jony Cu²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Ag₂S jest po to, by zwiększyć przewodnictwo elektryczne membrany.

2. ISE z membranami ciekłymi:

Obojętna chemicznie porowata matryca (PCV, octan celulozy, polietylen, żywica silikonowa, materiał ceramiczny) zwilżona rozpuszczalnikiem organicznym zawierającym hydrofobowy związek oddziałujący z oznaczanym jonem ( kationit, anionit, zw. kompleksujący, obojętny nośnik = jonofor).

Przykład :

Membrana z PCV impregnowana antybiotykiem walinomycyną- ISE czuła na K⁺ (walinomycyna- jonofor zdolny do selektywnego wiązania kationów potasu i przenoszenia ich przez błony biologiczne)

3. ISE z membranami podwójnymi:

• elektrody enzymatyczne

• elektrody gazowe

Przykłady elektrody enzymatycznej:

• ISE do oznaczania mocznika w płynach ustrojowych:

• Budowa - elektroda szklana czuła na jony NH₄⁺, pokryta warstwą membranową zawierającą enzym ureazę

• Działanie - pod wpływem ureazy zawartej w próbce mocznik ulega rozkładowi z wytworzeniem jonów NH₄⁺, których stężenie odpowiada stężeniu mocznika, a na które reaguje zmianą potencjału elektroda szklana.

Przykłady elektrody gazowej:

• Elektroda do oznaczania CO₂ we krwi:

• Budowa: elektroda szklana czuła na jony H+ mieszczona w zbiorniku wypełnionym buforem o ściśle określonym pH. Dno zbiornika stykające się z próbką badaną stanowi membrana z teflonu lub polietylenu, przepuszczalna dla CO₂

• Działanie: gaz dyfunduje do wnętrza zbiornika z buforem zmieniając jego pH, co rejestruje elektroda szklana

• CO₂ + H₂0 (H⁺ )+ HCO₃ ^-

Selektywność ISE:

• im mniejsza wartość k, tym ISE bardziej selektywna, tym mniej dany jon przeszkadza

• miarą selektywności ISE jest wartość współczynnika selektywności k określonego względem konkretnego jonu interferującego

• ISE nie są idealne selektywnie na wartość potencjału może wpływać obecność innych jonów w roztworze badanym.

Współczynnik k informuje, ile razy stężenie jonu interferującego ( przeszkadzającego) musi być większe od stężenia jonu oznaczanego, aby spowodować 100% błąd oznaczenia, tzn. aby potencjał wywołany przez jon interferujący był taki sam jak potencjał wywołany przez jon oznaczony.

Np. k=0,0001 oznacza że stężenie jonu przeszkadzającego musi być 10 000 razy wyższe od oznaczanego, aby wytworzyć taki sam potencjał elektrody

dla kationu

Potencjał ISE: E=E₀ ± ( 0,059/z) logc stężenie jonu

Wzór Nernsta:

dla anionu wartościowość jonu

Potencjał elektrody

Potencjał normalny elektrody

Czułość ISE:

s = ± 0,059/z

Informuje w jakim kierunku i o ile zmieni się potencjał ISE (i SEM ogniwa), jeśli stężenie oznaczanego jonu wzrośnie 10 razy

Dla M+ (kation) wzrost SEM o S[V]

Dla M- (anion) spadek SEM o S[V]

Im wyższa bezwzględna wartość S tym ISE bardziej czuła !

Czułość ISE zmniejsza się ze wzrostem wartości jonu:

Z= 1 s=0,059/1 = 59mV

Z= 2 s=0,059/2 = 29,5mV

Z= 3 s=0,059/3 = 19mV

Teoretyczna wartość S niemal zawsze różni się od wartości rzeczywistej, której miarą jest nachylenie charakterystyki ISE.

Charakterystyka ISE:

Wykres zależności SEM ogniwa pomiarowego zestawionego z testowanej ISE i elektrody odniesienia od stęż. oznaczanego jonu (logC lub pC)= krzywa kalibracyjna ISE.

1.Roztwory wzorcowe o wyższym stężeniu

2. Zestawić ogniwo pomiarowe kolejno w każdy 1 (r-ry wzorcowe)

3. Dla każdego rejestrować SEM

Równanie prostej opisującej prostoliniowy odcinek krzywej kalibracyjnej:

SEM [mV] = A ± S log c

A - potencjał formalny ISE wyznaczony względem elektrody odniesienia - stała dla danego ogniwa pomiarowego obejmującego potencjał normalny ISE i potencjał elektrody odniesienia.

Dla kationów : Wzrost stężenia powoduje wzrost SEM ogniwa pomiarowego

Dla anionów : Wzrost stężenia powoduje obniżenie SEM ogniwa pomiarowego

UWAGA!! Wzrost stężenia = wzrost wartości logC, ale obniżenie pC

Zastosowanie jonoselektywnych elektrod membranowych w diagnostyce laboratoryjnej - przykłady:

• pomiar pH, np. różnych płynów ustrojowych, zwłaszcza we krwi (powinna mieć stały poziom pH, ok. 7, 4 (7,37 - 7,44); to stałe pH utrzymują bufory: regulowany mechanizm przez ciśnienie O₂ i CO₂)

• oznaczanie jonów ważnych w płynach ustrojowych: K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Cl^- (analizatory elektrolitów)

• oznaczanie jonów w płynach komórkowych i pozakomórkowych

• zastosowanie mikroelektrod w badaniach in vivo.

Biosensory

Biosensory = bioczujniki, czujniki biologiczne

Przyrządy zwykle zminiaturyzowane, stosowane w analizie medycznej, biotechnologii, ochronie śr. do oznaczania zw. biologicznie czynnych w celu wykrycia lub oznaczenia ilościowego określonych substancji w badanym materiale, np. metabolitów w płynach ustrojowych

Budowa: sygnał

Substancja oznaczana (analit) | element przetwarzający (sensor, czujnik) ------- rejestracja i

przetwarzanie sygnału

Biologiczny element detekcyjny (receptor)

• Elementy biosensora:

- warstwa receptorowa w postaci materiału biologicznego (biologiczny element detekcyjny)

- przetwornik (czujnik, sensor).

Warstwa receptorowa służy do „rozpoznawania” oznaczanego związku. Specyficzna reakcja receptora z analitem generuje sygnał biologiczny.

Przetwornik(czujnik) - np. elektroda szklana czuła na jony H⁺.

Zadaniem przetwornika jest „przetłumaczenie” tego sygnału biologicznego na parametr mierzalny fizycznie i konwersja mierzonego parametru na sygnał elektryczny, który może być wzmocniony, zarejestrowany i przetwarzany np. na sygnał cyfrowy.

• Mierzony sygnał jest proporcjonalny do stężenia analizowanej substancji w próbce.

• Działanie: reakcja analitu z warstwą receptorową generuje sygnał, który zostaje przekształcony przez element przetwarzający biosensora (transduktor) na sygnał analityczny (zwykle elektryczny) podlegający wzmocnieniu i rejestracji. Na podstawie wielkości zarejestrowanego sygnału wnioskujemy o stężeniu substancji

Warstwa receptorowa = materiał aktywny biologicznie odpowiedzialny za selektywność biosensora:

• enzymy immobilizowane (jeden lub układy wieloenzymatyczne: dwa lub nawet trzy)

• organelle komórkowe( np. chloroplasty)

• tk. roślinne i zwierzęce (często bogate w enzymy)

• przeciwciała monoklonalne (reagują na określony rodzaj białka, np. bakterie, toksyny)

• lektyny (naturalne białka; wiążą selektywnie cukry)(np. sojowe)

• hemoglobina (np. łączenie z tlenkiem azotu, cyjanowodorem)

• żywe mikroorganizmy(np. bakterie)- cell biochop

immobilizowane na powierzchni przetwornika (wszystkie wymienione muszą takie być)

Zalety biosensorów:

• wysoka selektywność

• wysoka czułość

• szybkość i prostota oznaczania

• możliwość operowania na poziomie pojedynczej komórki

Ze względu na sposób przekształcania sygnału wyróżnia się biosensory:

-potencjometryczne (ISE)

-amperometryczne

-optyczne (optoelektroniczne)

-termistorowe (opornik półprzewodnikowy)

-piezoelektryczne

-tranzystorowe

Przetworniki(sensory)

• sensory elektrochemiczne:

• potencjometryczne (jonoselektywne elektrody membranowe)

• amperometryczne (np. elektroda tlenowa Clarka)

• półprzewodnikowe (jonoczułe tranzystory polowe)

• sensory optyczne (światłowodowe)

• sensory masowe (np. czujniki piezoelektryczne zwane mikrowagami kwarcowymi)

• sensory termiczne (termistory - pozwalają zmierzyć ciepło reakcji enzymatycznej).

Biosensory enzymatyczne:

• bardzo wysoka selektywność w stosunku do substratu

• procedura immobilizacji na powierzchni sensora musi gwarantować utrzymanie wysokiej aktywności biologicznej enzymu

• chemicznie (kowalencyjnie) lub fizycznie związane bezpośrednio z powierzchnią sensora

• fizyczne lub chemiczne unieruchomienie w inertnej matrycy (białkowej, żelowej, polimerowej.

• użyteczny czas życia warstwy enzymatycznej zależy od odporności enzymu i matrycy, w której jest immobilizowany.

Biosensory mikrobiologiczne:

• wykorzystują naturalną aktywność biokatalityczną żywych kom. bakteryjnych (zawartych w nich enzymów)

• bakterie są fiz. związane z pow. sensora poprzez unieruchomienie za pomocą mikroporowatej membrany, przepuszczalnej dla enzymów oznaczanych związków

• duża czułość, ale mała selektywność i długi czas odpowiedzi (komórki zawierają wiele różnych enzymów, co jest źródłem interferencji)

• wrażliwe na obecność w analizowanych próbkach zw. wpływających na szybkość metabolizmu komórek bakterii = możliwość wykorzystywania do oznaczania trucizn, toksyn i mutagenów.

Biosensory tkankowe:

• cienki plaster tkanki lub izolowane organelle kom. umieszczone na końcówce sensora i zabezpieczone porowatą membraną

• lepsza selektywność w porównaniu z biosensorami bakteryjnymi

• bardzo długi czas życia w porównaniu z biosensorami enzymatycznymi

• długi czas odpowiedzi

Immunosensory:

• oparte na selektywności oddziaływania przeciwciała z antygenem z wytworzeniem stabilnego termodynamicznie kompleksu (specyficzność detekcji)

• jako warstwę receptorową biosensora można wykorzystać oba skł. kompleksu

• wyznaczają pośredni typ. detekcji, wymagający obecności znaczników (np. fluorescencyjnych) umożliwiających śledzenie reakcji wiązania analitu z receptorem.

Biosensory z przetwornikiem potencjometrycznym:

• warstwa receptorowa to najczęściej immobilizowany enzym

• przetworniki: ISE czułe na jony, których stężenie w próbce zmienia się w wyniku reakcji enzymatycznej (często elektroda szklana)

Mocznik - końcowy produkt degradacji białek w organizmie człowieka.

Znaczenie diagnostyczne poziomu we krwi :

∙ ocena wydolności nerek

∙ kontrola pozanerkowego oczyszczenia krwi ( dializoterapia)

Oznaczenie metabolizmu enzymatycznego pomiar stężenia produkcji hydrolizy mocznika katalizowanej przez ureazę.

Mocznik + H₂O amoniak + CO₂

Biosensory do oznaczania mocznika:

• warstwa receptorowa: immobilizowana ureaza

• przetworniki : np. ISE czuła na NH+ lub H+ (zmiany pH), elektroda gazowa czuła na CO₂ (pozostający w równowadze z jonami HCO₃^- i CO₃^2- lub NH₃ (pozostający w równowadze z jonami amonowymi), czuły na jony wodorkowe tranzystor polowy (ISFET)

Schemat ideowy ISFET:

• elektroda odniesienia, bramka (elektroda), izolator, kanał, membrana jonowymienna, źródło (elektroda), dren (elektroda), podłoże.

• główny element pomiarowy- membrana jonowymienna czuła na określony typ jonów naniesiona na bramkę tranzystora (membrana może być związana z enzymem = ENFET)

• napięcia sterujące przyłożone do bramki przy określonej wartości potencjału na granicy membrana - roztwór zapewnia określoną wartość mierzonego sygnału wyjściowego

• wymiana jonów powoduje skok potencjału na granicy membrana - roztwór.

• zmiana sygnału wyjściowego jest proporcjonalna do aktywności oznaczanych jonów

Biosensory z przetwornikiem amperometrycznym :

• warstwa receptorowa: najczęściej enzymy lub mikroorganizmy ( szczepy bakteryjne)

• przetworniki : elektroda tlenowa Clarka lub elektroda rejestrująca nadtlenek wodoru

• Amperometria- metoda polegająca na analizie warstwy dyfuzyjnej (zaraz przy powierzchni).

Mierzy się natężenie prądu płynącego przez komórkę pomiarową w zależności od stężenia substancji ( jest proporcjonalne) elektrodowo- czynnej(depolaryzatora) (oznaczana substancja). I= f(c). Natężenie prądu mierzy się przy stałym potencjale elektrody pracującej.

Przykłady oznaczania z wykorzystaniem biosensorów amperometrycznych:

• cholesterol oksydaza cholesterolowa /H₂O₂

• α - aminokwasy : oksydaza - α- aminokwasy / H₂O₂ lub O₂

• amoniak - bakterie nitrujący / tlen

• szczawiany : oksydaza szczawianowa / tlen

• glukoza : pseudomonas fluorescens / tlen

Elektroda tlenowa Clarka = elektroda amperometryczna (oznaczanie Cl, H₂S, O₂ = stężenia lub ciśnienia )

• wartość mierzonego prądu elektrody amperometrycznej wynika z reakcji wymiany e^- pomiędzy oznaczaną substancją, a elektrodą roboczą (katodą)

Elektroda tlenowa Clarka:

∙ katoda : platyna ∙ anoda : elektroda chlorosrebrowa ∙ elektrolit : nasycony KCl

∙ membrana : 1 przepuszczalna jedynie dla O₂

∙ warstwa oksydazy glukozowej

∙ membrana 2 przepuszczalna dla substratów i produktów reakcji

∙ tlen ulega redukcji na katodzie

∙ prąd na wyjściu zależy od wymiany elektronów między tlenem a katodą.

∙ ubytek tlenu w próbce zmniejsza prąd tlenowy dyfundując w stanie katody.

F-glukoza + O₂ D - glukonolakton + H₂O₂

Amperometryczny biosensor do oznaczania glukozy :

• Warstwa receptorowa : oksydaza glukozowa immobilizowana w membranie przepuszczalnej dla glukozy i tlenu (teflon, len, polimery silikonowe)

• Przetwornik : elektroda tlenowa Clarka- rejestruje spadek natężenia prądu wywołany zmniejszeniem stężenia O₂ w próbce na skutek kontrolowanego enzymatycznie utleniania glukozy: D-glukoza

• Natężenie przepływającego prądu (jego spadek) jest proporcjonalne do stężenia O₂ rozpuszczonego w badanym medium

• Spadek natężenia prądu jest proporcjonalny do stężenia glukozy w próbce

• Odczyt z krzywej kalibracyjnej (pomiar spadku natężenia prądu dla roztworów o różnych stężeniach glukozy.

• Przetwornik: rejestracja spadku stężenia tlenu w próbce na skutek reakcji:

• D-glukoza + tlen D-glukonolantan + H₂O

• Można by wykorzystać zmianę pH (elektroda czuła na zmianę pH) przy powstawaniu kwasu glukonowego. Można tez wykorzystać czujnik powstającego H₂O₂ (np. rozkłada się do H₂O i O₂ przy srebrze).

Natężenie prądu dla elektrody Clarka jest mniejsze, jeżeli zmniejszymy w próbce zawartość substratu dla enzymu.

Biosensory optyczne (z przetwornikiem optoelektronicznym):

• warstwa receptorowa immobilizowana na powierzchni włókna światłowodowego połączonego z przetwornikiem zamieniającym sygnał optyczny na elektryczny

• detekcja bezpośrednia: reakcja analit - receptor generuje sygnał optyczny lub osłabia już istniejący.

• detekcja pośrednia : wykorzystywana np. w optycznych biosensorach do oznaczania glukozy

Budowa optycznego biosensora:

(Mamy białko z gr. leukin, unieruchamia się dekstran. Wnętrze jest oświetlone. Membrana przepuszczalna dla glukozy. Glukoza wypiera dekstran. Natężenie fluorescencji można mierzyć.)

Budowa:

• światłowód (transportuje promieniowanie elektromagnetyczne)

• końcówka włókna światłowodowego w membranie z białkiem konkanawaliną A, do tego dekstran przyłączony

Optyczny biosensor (schemat)

Czujniki optyczne (optody lub optrody):

• Wykorzystują światłowody do przesyłania światła (od źródła do miejsca pomiaru i dalej do systemu detekcyjnego).

• Jako źródło światła stosuje się świecące diody, a jako detektory- fotodiody (co pozwala na miniaturyzację całego urządzenia).

• Na końcach światłowodów immobilizuje się odczynniki chromogenie lub fluorogenne (albo materiał biologiczny).

• Pomiar absorbancji, fluorescencji, luminescencji lub reflektanci.

Zastosowanie biosensorów:

1. W analityce medycznej - oznaczanie:

• glukozy

• mocznika

• mleczanu

• szczawianu

• cholesterolu

• glutaminy i kwasu glutaminowego

• etanolu

• acetylocholiny (mikrobiosensor - acetylocholinoesteraza na tranzystorowej elektrodzie pH).

2. W analizie środków spożywczych.

3. W monitoringu środowiska - detekcja substancji toksycznych i mutagennych. Do określenia ogólnej toksyczności można stosować biosensory bakteryjne - szybkość metabolizmu żyjących bakterii jest monitorowana czujnikiem tlenowym.

4. Kontrola procesów biotechnologicznych.

---