Chromatografia powinowactwa (AC)

Rodzaj chromatografii adsorpcyjnej wykorzystujący wzajemne powinowactwo substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej i liganda umieszczonego na nierozpuszczalnym nośniku (matrycy)

Efektem jest specyficzne i odwracalne związanie obu elementów , bez utraty ich aktywności.

Zastosowanie: izolacja i oczyszczanie wielu biologicznie aktywnych molekuł (białko, kw. Nukleinowe)

AC - zalety:

∙ brak ograniczeń co do objętości, stężenia próbki

∙ zachowanie aktywności biologicznej izolowanych cząsteczek

∙ bardzo wyskoki stopień czystości izolowanych cząsteczek

∙ silne natężenie izolowanych cząsteczek

∙ bardzo wysoka specyficzność

AC- wady:

∙ nietrwałość pewnych ligandów

∙ konieczność samodzielnego przygotowania złoża

∙ trudności w uzyskaniu odpowiedniego liganda

AC - typy oddziaływań:

∙ enzym - substrat

∙ enzym - inhibitor

∙ enzym - koenzym

∙ hormon - receptor (lub białko transportujące)

∙ przeciwciało - antygen

∙ przeciwciało z gr IgG - dopełniacz

∙ kwast nukleinowe - białka ( polimerazy - histony)

∙ komplementarne odcinki kwasów nukleinowych

∙ pektyny - glikoproteiny , polisacharydy

∙ jony metali - białka ( poprzez reszty His, Tyr, Trp)

∙ barwniki białka

Nie ma znaczenia, którą cząsteczkę danej pary wybierzemy jako ligand.

Tragedie rozkładu:

AC positive mode : z ligandem wiąże się cząśteczka która nas interesuje (izolacja, oczyszczanie),

AC negative mode: z ligandem wiążą się zanieczyszczenia

AC przygotowanie kolumny:

Biosorbent = nośnik +ligand (wiązanie kowalencyjne!)

Nośniki (matryca)

∙ obojętny fizycznie i chemicznie (niska absorpcja niespecyficzna)

∙ stabilny w stosownych warunkach rozdziału chromatograficznego ( odpornośćna niskie i wysokie pH, obecność detergentów itp.

∙ duża powierzchnia wiązania liganda ( porowatość)

Agarowa (sephorose) , celuloza, dekstran (Sephadex), poliakrylamid (nośnik musi być zaktywowany)

Przygotowanie biosorbenta

∙ aktywacja nośnika = derywatyzacja grup funkcyjnych nośnik celem umożliwienia kowalencyjnego związania liganda

∙ przyłącznia cząsteczki liganda w sposób warunkujący zachowanie, jego aktywności biologicznej

Odcinki aktywujące :

∙ Dla ligandów z gr aminową:

- bromocyjan (CNBr)

- kwas 6-aminoheksanowy

- nadjodan

∙ Dla ligandów z gr OH

-epichlorohydryna

∙ Dla lih. Z gr. SH

- Tiole

Sposób wiązania ligandów:

∙ białko : gr aminowe , karboksylowe ( reszty Glu, ASP), sulfhydrylowe ( reszty Cys), hydroksylowe ( reszty Tyr, Ser, Thr)

∙ kw. Nukleinowe : grupy enolowe zasad azotowych reszty fosforowe

∙ cukry lub reszty cukrowe glikoprotein: grupy hurdoksylowe

Złoże zaktywowane ugrupowanie Epoksy

NH2, COOH, SH, OH możan dzięki nim związać każdy typ liganda.

Grupa dystansowa (spacer)

Łańcuch alifatyczny 6C (6 węgli)

Dla niskocząsteczkowych ligandów (koenzymy, hormony)= lepsze wiązanie, eliminacja efektów sferycznych .

Ligandy monospecyficzne:

∙ Wiążą się tylko z jednym konkretnym związkiem

∙ przykłady : antygeny, przeciwciała, hormony, receptory, enzymy.

Idealna selektywnośc danej metody

Ligandy gruposelektywne:

∙ wiążą się z określonymi grupami związków docelowych

∙ Awidyna : biotyna, biotynylowane przeciwciała

∙ Heparyna: białka osoczowe, enzymy, czynniki krzepnięcia, czynniki wzrostu, proteazy, lipazy, cytokiny

∙ Pektyny: glikoproteiny i inne glukokoniugaty

∙ węglowodany : pektyny, glikozydazy

∙ kwasy nukleinowe : polimerazy RNA i DNA, białka regulacyjne, rybosomalne

∙Lizyna rRna, DNA, plazminogen

∙ poliuracyl : mRNA

∙ Barwnik Cibacron blue : albuminy wiele enzymów

∙ białko A - immunoglobuliny

∙ kalmodulina regulowane przez nią kinazy, cyklazy i fosfatazy

∙ AMP: kinazy zależne od AMP, enzymy i kofaktorem NAD

∙ Jony metali przejściowych - białka i peptydy zawierające dostępne reszty His.

Lektyny:

Białka posiadające przynajmniej 2 miejsca wiążące, fragment cukrowy innych cząsteczek (oligo- i polisacharydy, glikoproteiny)

∙konkanawalina A (z roślin strączkowych)

∙ hemoglutynina wirusa grupy (odpowiedzialne za przyleganie do komórki gospodarza i fuzję błon )

∙ selektywny zwierzęce (oddziaływania międzykomórkowe)

∙ Aglutynina związków przenicy

Glikoproteiny- przykłady

∙ białka strukturalne ( kolagen)

∙ Substancje o właściwościach ochronnych i poslozgowych ( mucyny)

∙ białka błon komórkowych

∙ niektóre substancje grupowe krwi

∙ białka transportujące (transferryna, celuroplazmina)

∙ białka biorące udział w procesach odporności ( immunoglobuliny, antygeny układu zgodności tkankowej)

∙ hormony (gonadotropina kosmówkowa) hormony tyreotropowe)

∙ enzymy (fosfataza alkaliczna)

∙ białka niorące udział w oddziaływaniu komórka - komórka, wirus - komórka , bakteria - komórka, hormon komórka itp.

Etapy analizy AC

∙Kondycyjnowanie kolumny

∙ wprowadzenie próbki ( adsorpcja)

∙ Obmycie niezwiązanych i związanych niespecyficznie składników próbki

∙ Lucja (desorpcja0

∙Regeneracja kolumny

Warunki wiązania i elucji należy dobrać tak, aby te procesy zachodziły szybko i całkowicie oraz nie wpływały na aktywność biologiczną lignadu i cząsteczek docelowych

Odwracalną reakcję między ligandem, a cząsteczka docelową charakteryzuje siła dysocjacji wytworzonego kompleksu, która zależy m.in.od pH, siły jonowej, polarności i temp. Środowiska

Optymalne wiązanie : 10-4 do 10-8 M

Optymalna Lucja : 10-1 do 10-2 M

Kondycjonowanie kolumny

Przemywanie buforem wiążącym ( startowym) o parametrach (pH, siła jonowa) promujących adsorbcję cząsteczek docelowych.

Wprowadzenie próbki

specyficzna absorpcja i oddziaływanie niespecyficzne

Przemywanie kolumny :

Elucja - wymywanie cząsteczek docelowych

1 i 2 - elucja niespecyficzna

3 i 4 - elucja biospecyficzna

Prowadzona skokowo lub gradientowo

Elucja niespecyficzna

Bufor elujący o parametrach promujący desorbcję

1= bez zmian konformacyjnych lig. I cząst. Docelowej wzrost siły jonowej (NaCl), obniżenie polarności (dioksan, glikol etylenowy)

2= zmiany konformacji : elastyczna zmiana pH, czynniki chaotropowe (6M chlorowodorek guaniny, 4-8M mocznik).

Elucja biospecyficzna - Bufor zawiera:

3= cząsteczki kompetytora o większym niż cząsteczka docelowa powinowactwie do nieruchomego ligandu

4= Cząsteczki wolnego liganda (lub jego analogu), który współzawodniczy z unieruchomionym ligandem o miejsce wiążące cząsteczki docelowej.

Frakcjonowanie IgG z surowicy

∙ Ligand = białko A produkowane przez Staphylococcus ureus wiąże fragment Fc IgG (protein A - Sepharose Cl 4B)

∙ Powinowactwo do liganda zależy od podklasy i pochodzenia gatunku IgG

∙ 1 etap : związanie całej puli IgG ze złożem (bufor fosforanowy pH=8)

∙ 2 etap : frakcjonowanie IgG za pomocą eluenta o malejącym pH (rosnąca siła rugowania - elucja gradientowa)

Frakcjonowanie glikoprotein z osocza

∙Ligand = konkanawalina A (ConA - Sepharose 4B)

∙ Powinowactwo do liganda zależy od liczby i umiejscowienia reszt cukrowych

∙ Bufor startowy : fosforanowy pH - 7,5

∙ Elucja gradientowa buforem fosforanowym zawierającym wzrastające stężenie kompetytorów (glukoza i mannoza)

---