3. Ilościowy opis podziału składników mieszaniny w układzie

chromatograficznym. Warunki rozdziału składników miesza-

niny

Są dwie koncepcje termodynamicznego opisu retencji składników mieszaniny w układzie chromatograficznym uwzględniające zjawisko podziału składników między dwie fazy układu chromatograficznego lub zjawisko adsorpcji

faza ruchoma

składnik podział składnika

mieszaniny zgodnie z K

faza stacjonarna

Ilościowo rozdział każdego ze składników mieszaniny pomiędzy fazę stacjonarną a ruchomą opisuje stała podziału K:

K = c_S / c_M

₍₁₎

c_S - stężenie składnika w fazie stacjonarnej

c_M - stężenia składnika w fazie ruchomej

RT ln K = 2.3 RT lgK = 2.3 RT lg c_S/c_M = W

Stężenie substancji w fazie ruchomej wyraża się w [mol/l^-1]. Stężenie substancji w fazie stacjonarnej odnosi się albo do jej objętościV_S [mol/l^-1]lub do jej masy A_S [mol/kg^-1].

Składniki mieszaniny wymywane są z układu chromatograficznego zgodnie z ich współczynnikami podziału:

Jeśli K_A > K_B to t_A > t_B

większy współczynnik podziału K_A - dłuższy czas elucji składnika t_A

(tj. większe powinowactwo składnika A

do fazy stacjonarnej i c_S > c_M )

Składniki o tych samych wartościach współczynnika podziału w danym układzie chromatograficznym będą miały takie same czasy elucji i nie zostaną rozdzielone

Jeśli K_A = K_B to t_A = t_B

Podstawowym warunkiem rozdziału składników mieszaniny jest:

różnica ich wpółczynników podziału

Rys.2 Kolejne etapy rozdziału dwuskładnikowej mieszaniny oraz sygnał detektora dla poszczególnych etapów

Współczynnik podziału K a tym samym prędkość migracji składnika przez układ chromatograficzny i czas elucji zależy od:

• rodzaju i składu fazy ruchomej

• rodzaju fazy stacjonarnej

Zmieniając rodzaj i skład fazy ruchomej oraz stacjonarnej można wpływać na współczynnik podziału składników mieszaniny i ich rozdział

Wniosek powyższy jest słuszny przy następujących założeniach:

1. K = const

a więc w każdej chwili procesu chromatograficznego (elucji) stosunek stężeń

substancji w obu fazach jest taki sam,

2. brak dyfuzji

w układzie chromatograficznym nie zachodzi wyrównywanie stężeń na

drodze dyfuzji,

tzn. izoterma podziału jest liniowa

c_S

A

B

c_M

Założenie 1) jest z praktycznego punktu widzenia nie możliwe do spełnienia, ze względu na fakt, że jedna z faz jest ruchoma.

Można jednakże przyjąć, że układ chromatograficzny składa się z szeregu warstw (półek), w których ustala się stan równowagi zgodny ze współczynnikami podziału.

Proces elucji (rozwijania chromatogramu) realizowany jest w kolejnych warstwach (półkach), a wiec jest to szereg kolejno następujących po sobie równowag podziału.

Przykład

K_A = 9

K_B = 1

K_C = 1/9

Przyjmijmy, że faza ruchoma nie przepływa w sposób ciągły, lecz jest dodawana porcjami ∆V. Po dodaniu kolejnych objętości ∆V ustala się stan równowagi zgodny ze współczynnikami podziału:

∆V = 1

faza stacjonarna faza ruchoma

A 90% 10%

1 warstwa B 50% 50%

C 10% 90%

∆V = 2

faza stacjonarna faza ruchoma

A 81% 9%

1 warstwa B 25% 25%

C 1% 9%

A 9% 1%

2 warstwa B 25% 25%

C 9% 81%

Krzywa obrazująca rozkład stężeń każdego składnika w kolejnych (n) warstwach w fazie ruchomej lub stacjonarnej w funkcji czasu (lub objętości fazy ruchomej) ma postać krzywej Gausa:

profil stężenia

faza ruchoma w fazie ruchomej

profil stężenia

w fazie stacjonarnej

Każdy składnik przesuwając się wzdłuż układu chromatograficznego ulega serii podziałów zgodnie z wartością jego K. W konsekwencji czas przebywania składnika w fazie stacjonarnej powoduje jego opóźnienie w stosunku do prędkości przesuwania się fazy ruchomej.

Zatrzymywanie składnika w fazie stacjonarnej (wydłużenie czasu elucji) jest tym większe im większa jest liczba jego kolejnych podziałów.

Składniki mieszaniny będą w różnym stopniu zatrzymywane przez fazę stacjonarną (zgodnie z ich współczynnikami podziału K), przy czym to zróżnicowanie czasu elucji (rozdzielenie) będzie tym większe im większa będzie liczba kolejnych podziałów

c

C B A C B A C B A

n

4. Parametry retencji (cd)

Kolejnym parametrem retencji jest współczynnik retencji (pojemnościowy) K' (lub k)

a - masa adsorbenta

m_r - masa składnika

w fazie ruchomej

m_s - masa składnika

zaadsorbowanego

przez adsorbent

Prędkość migracji (oraz czas elucji) składnika zależy od współczynnika podziału K oraz objętości fazy stacjonarnej V_S (lub masy adsorbenta) w kolumnie.

Uzyskanie skutecznego rozdzielenia zależy od K (rodzaju fazy stacjonarnej, rodzaju fazy ruchomej) oraz od objętości fazy stacjonarnej V_S w kolumnie (GC)

4.1 Definicja chromatogramu (Parametry retencji cd.)

Chromatogram to graficznie przedstawiony obraz rozdziału mieszaniny. To zależność sygnału detektora S (mierzącego w sposób ciągły zmianę stężenia (A, n, I, i inn.) składnika w fazie ruchomej od czasu t lub objętości fazy ruchomej V_R

S

h

b_0.5 =2.35 δ

t_R w=4δ

V_R

t_M

t_RA δ = parametr kształtu,

odchylenie standardowe

-(x-m)² m(współczynnik położenia) = t_R

y = h e 2δ² gdy x = m tj. w punkcie odpowiadającym

czasowi retencji - wartość funkcji

jest największa i określa maksy-

malne stężenie związku

Parametr	Symbol	Zależność
martwy czas retencji	tM
martwa objętość retencji	VM	VM = tMF
czas retencji skł. A	tRA
objętość retencji skł. A	VA	VA = tRA F
zredukowany czas retencji	t'A	t'A = tA - tM
zredukowana objętość retencji	V'A	V'A= VA - VM
objętościowe natężenie przepływu	F
liniowa prędkość przepływu	u	u = L/tM
selektywność	α

Interpretacja parametrów retencji:

• martwy czas retencji t_M = L/u to czas retencji składnika nie zatrzymywanego w kolumnie, tj. składnika dla którego k=0. Szybkość elucji takiego składnika jest równa prędkości fazy ruchomej

• martwa objętość retencji V_M - objętość fazy ruchomej konieczna do wymycia składnika martwego z kolumny (nie zależy od u). Jest to objętość między cząsteczkami fazy stacjonarnej oraz objętość porów fazy stacjonarnej dostępna dla fazy ruchomej.

• czas retencji składnika t_RA - czas upływający od momentu wprowadzenia do kolumny do pojawienia się maksimum piku na chromatogramie

(zależy od L, u, K)

• objętość retencji składnika V_A - objętość fazy ruchomej konieczna do wymycia składnika z kolumny (nie zależy od u)

4.2 Zależności parametrów retencji

Przy spełnieniu liniowości izotermy podziału (K = const, t_R nie zależy od masy składnika):

→ K = (V_R -V_M)/V_S

K' = (V_R - V_M)/V_M

jeśli K = O (składnik nie zatrzymywany w kolumnie) to t_R = t_M

t_M = L / u

t_R = L/u (1 + K')

5. Parametry opisujące układ chromatograficzny

5.1 Selektywność (współczynnik rozdzielania) α

(1) α = K₂ / K₁ = K'₂ / K'₁ = t'_R2/ t'_R1

α charakteryzuje względny rozdział składników mieszaniny w danym układzie chromatograficznym (zdolność układu chromatograficznego dla rozdzielenia składników mieszaniny)

Dla K2 > K1 im większa wartość α tym lepsze rozdzielenie składników mieszaniny

Jeśli K2 = K1 to α = 1 brak rozdzielenia

5.2 Rozdzielczość układu chromatograficznego (równanie

Prunella) R_s

Rozdzielczość pików R_S określona jest zależnością:

Δt_R - sprawność termodynamiczna - f(K, α)

w₁, w₂ - sprawność kolumny związana

Δt_R z poszerzaniem pików

t

w₂

t

Dla całkowitego rozdzielenia pików chromatograficznych konieczne jest:

R_S = 1.5 (piki gausowskie)

R_S = 1 (piki o kształcie trójkąta)

R_S = 0.8 dla analizy jakościowej

R_S = 1.2 dla analizy ilościowej

Powyższa zależność nie podaje korelacji pomiędzy rozdzielczością i warunkami analizy, nie mówi jak poprawić zdolność rozdzielczą. Umożliwia jedynie wyznaczanie rozdzielczości.

indeks 2 odnosi się do piku bardziej zatrzymywanego

α - selektywność

N - sprawność kolumny (liczba półek teoretycznych)

jeśli α = 1 to R_s = 0

jeśli K'₂ = 0 to R_s = 0

jeśli N = 0 ? to R_s = 0

5.3 Interpretacja równania Prunell'a. Zwiększenie rozdzielczości

• zwiększenie K' dla K'>10 {K'/(1 + K')} → 1

optymalny zakres K' = {1 - 10} chromatografia kolumnowa

K' = {0.1 - 10} chromatografia cienkowarstwowa

t_M/t_R

Δt_R

Δt_R

ΔK

ΔK ΔK

0.01 0.1 1 10 100 K'

• zwiększenie α

R_S = 0.25 (α-1)/ α * N_ef ^0.5

N_ef

10⁴ R = 1

10³

1.04 1.08 1.2 1.4 α

W przypadku gdy α jest bardzo małe konieczna jest bardzo duża liczna półek (sprawność kolumny) dla zrealizowania rozdziału.

- zwiększenie N (sprawności kolumny)

5.3 Sprawność kolumny. Liczba półek teoretycznuch N

Ponieważ w miarę przesuwania się pasma wzdłuż kolumny (zwiększania t_R) jego szerokość w rośnie, wobec tego wartość względnego poszerzania pasma przyjęto jako miarę sprawności kolumny.

Sprawność kolumny chromatograficznej mierzy się dla każdej substancji liczbą półek teoretycznych N w kolumnie.

Po przebyciu przez próbkę pewnej drogi w kolumnie, rozkład jej stężenia w wycieku ma kształt krzywej Gaussa. Odchylenie standardowe tego piku σ (w jednostkach czasu) powiązane z liczbą półek N zależnością:

σ² = t_R² /N

Dla piku Gausowskiego jego szerokośc w, na określonej wysokości jest związana z kwadratem odchylenia standardowego σ (wariancją) zależnością:

w² = a σ²

w której współczynnik proporcjonalności a zależy od wysokości, na jakiej mierzone jest w.

N = a (t_R/w)² w a

w_h = 0.5 h 5.54 (w_h = 2.36 σ)

w_b 16 (w_b= 4 σ)

Powyższe metody wyznaczania sprawności powinny być stosowane dla pików gausowskich (pierwszych pików nba chromatogramie).

Wysokość półki (wysokość równoważna półce teoretycznej (HETP) jest zdefiniowana jako

H = L / N

Jak zwiększyć sprawność kolumny?

Zgodnie z teorią półek N = L/H, wobec tego, jak zmniejszyć wysokość półki H?

6. Teoria kinetyczna procesu chromatograficznego

Sprawność kolumny wiąże się z poszerzaniem się pików chromatograficznych. Im dłużej dany składnik przebywa w kolumnie tym szersze będzie jego pasmo na chromatogramie. Stopień poszerzania pików jest parametrem kinetycznym.

6.1 Przyczyny poszerzania pików chromatograficznych

- brak liniowości izotermy podziału (K ≠ const, K zależu od stężenia)

C_M

C_S

• czynniki hamujące ustalanie się równowagi podziału - dyfuzja

składników rozdzielanej mieszaniny w fazie ruchomej oraz fazie

stacjonarnej, opory w przenoszeniu masy. Wpływ tych czynników

na poszerzanie pików opisuje teoria kinetyczna.

6.2 Podstawy teorii kinetycznej

7. Dobór optymalnych warunków rozdziału - mechanizm retencji

Rozdział składników mieszaniny w chromatografii realizowany jest w serii kolejno po sobie nastepujących równowag podziału pomiędzy dwie fazy układu chromatograficznego, zgodnie z wartościami K.

Podczas transportu składników mieszaniny przez układ chromatograficzny występuje dyfuzja (hamująca ustalanie się równowag podziału), której efektem jest poszerzanie się pików chromatograficznych i niekompletny rozdział.

Optymalny rozdział zależy od zarówno od parametrów termodynamicznych (K,K',α) wpływających na retencję oraz kinetycznych (poszerzanie pasmchromatograficznych):

1. α > 1 czynniki

2. K' = {1 - 10 lub O.1 - 10} termodynamiczne

3. N, H czynniki kinetyczne

Dwa pierwsze parametry określają retencję składnika, którą można zmieniać (zwiększać) przez:

• zmianę rodzaju i składu fazy ruchomej rozpuszczalnika -HPLC

- zmianę typu i rodzaju fazy stacjonarnej - HPLC,GC

• zmianę temperatury - GC

proces rozpuszczania jest egzotermiczny

lnK = - H_r /RT + lnc → k ~ 1/T

zatem, podwyższenie temperatury powoduje skrócenie czasu retencji

Rozdział chromatograficzny można uzyskać przez zmianę parametrów wpływających na retencję składników mieszaniny, a więc charakter niekowalencyjnych oddziaływań międzycząsteczkowych w danym układzie chromatograficznym.

- elektrostatyczne oddziaływania w układzie chromatograficznym:

• polarne oddziaływania Van der Waals'a (pomiędzy cząsteczkami

mającymi ładunek powierzchniowy,

• niepolarne oddziaływania dyspersyjne pomiędzy neutralnymi

czasteczkami (grupami funkcyjnymi)

• wiązania wodorowe pomiędzy cząsteczkami składnika oraz

cząsteczkami fazy stacjonarnej (lub ruchomej) należą do silnych

oddziaływań przyczyniające się do powolnego ustalania się

równowagi podziału i ogonowania pików.

Składniki zawierające polarne grupy funkcyjne będą silniej zatrzymywane (oddziaływać) przez polarną fazę stacjonarną. Związki o charakterze niepolarnym łatwiej rozdzielić na niepolarnej fazie stacjonarnej. Wiele związków zawiera zarówno polarne jak i niepolarne fragmenty struktury. Ponadto oddziaływania między cząsteczkami składników mieszaniny oraz fazą stacjonarną zależą od rodzaju rozpuszczalnika (fazy ruchomej), w którym przebywają.

W chromatografii prostej decydują polarne oddziaływania międzycząsteczkowe

W chromatografii z odwróconymi fazami - dyspersyjne (hydrofobowe) oddziaływania międzycząsteczkowe.

W rzeczywistości model oddziaływań międzycząsteczkowych w układzie chromatograficznym jest bardziej złożony

7.1 Oddziaływania międzycząsteczkowe a mechanizm retencji .

RODZAJ fazy ruchomej oraz fazy stacjonarnej poprzez oddziaływania między cząsteczkami obu faz oraz cząsteczkami składników mieszaniny determinują ich zatrzymywanie (retencję) w kolumnie a w konsekwencji ich rozdział. Na przykład te składniki, których oddziaływania z fazą ruchomą są silniejsze niż z fazą stacjonarną będą wymywane szybciej. W uproszczonym modelu oddziaływań w układzie chromatograficznym zarówno rodzaj fazy stacjonarnej jak i rodzaj fazy ruchomej (moc elucyjna) warunkuje skuteczność rozdziału.

Chromatografia podziałowa

cząsteczki składnika

mieszaniny X

cząsteczki fazy cząsteczki fazy

ruchomej M stacjonarnej S

Można przyjąć, że o rozdziale decydują konkurencyjne oddziaływania

składnika X z fazą ruchomą M oraz składnika X z fazą stacjonarną S.

X M >> X S składnik X będzie lepiej rozpuszczał się w fazie ruchomej M (i będzie słabiej zatrzymywany przez fazę stacjonarną S) lub

X S >> X M składnik X będzie się lepiej rozpuszczał w fazie stacjonarnej (i będzie mocniej zatrzymywany przez fazę stacjonarną)

Chromatografia adsorpcyjna

cząsteczki składnika

mieszaniny X

cząsteczki fazy cząsteczki fazy

ruchomej M stacjonarnej S (ciało stałe)

Można przyjąć, że o rozdziale decydują konkurencyjne oddziaływania składnika X z fazą stacjonarną S oraz rozpuszczalnika M z fazą stacjonarną S

X S >> M S składnik X będzie silniej zatrzymywany przez

fazę stacjonarną

M S >> X S składnik X będzie słabiej zatrzymywany przez

fazę stacjonarną

Cząsteczki składnika będą się adsorbowały na centrach aktywnych żelu jeśli ich oddziaływania z adsorbentem są silniejsze niż oddziaływania cząsteczek rozpuszczalnika z adsorbentem.

Oddziaływania międzycząsteczkowe rozpuszczalnika oraz składników mieszaniny z adsorbentem zależą od właściwości chemicznych (rodzaj centrów aktywnych) oraz fizycznych adsorbenta

1. Wpływ rodzaju fazy ruchomej (rozpuszczalnika) na rozdział

składników mieszanin. Elucja izokratyczna i gradientowa

Rodzaj rozpuszczalnika wpływa na wartość współczynnika podziału oraz pojemnościowego składników mieszaniny i w konsekwencji na ich retencję w układzie chromatograficznym.

Optymalny zakres K' to: {1-10} dla chromatografii kolumnowej lub {0.1-10} dla cienkowarstwowej. Zatem właściwy rozpuszczalnik to taki, dla którego wartości K' składników mieszaniny znajdują się w tym zakresie.

W chromatografii podziałowej rozpuszczalnik wpływa na K poprzez oddziaływania tego rozpuszczalnika z cząsteczkami składników mieszaniny a zatem:

moc elucyjna rozpuszczlnika jest (w przybliżeniu) zależna od oddziaływań miedzycząsteczkowych tego rozpuszczalnika z cząsteczkami składnika (ów) mieszaniny.

W chromatografii adsorpcyjnej rozpuszczalnik wpływa na K' poprzez oddziaływania z adsorbentem, stąd:

moc elucyjna rozpuszczalnika zależy od oddziaływań tego rozpuszczalnika z adsorbentem.

Uszeregowanie rozpuszczalników wg. mocy elucyjnej (polarności, stałej dielektrycznej, parametru rozpuszczalności Hildebranda) to szereg eluotropowy.

Chromatografia prosta

K' {1-10}

0 P_M P_S 100

P_X

1. Jeśli K' >> 10

0 P_M P_X P_S 100

P_M

Jeśli K' >> 10 (zbyt długi czas retencji) : składnik ma większe powinowactwo do fazy stacjonarnej (polarność zbliżoną do polarności fazy stacjonarnej), rozpuszczalnik o słabej mocy elucyjnej. Rozdział można poprawić stosując rozpuszczalnik o większej mocy elucyjnej - większej polarności

2. Jeśli K' << 1

0 P_M P_X P_S 100

P_M

• Jeśli K' << 1 (zbyt krótki czas retencji) składnik ma większe powinowactwo do rozpuszczalnika, (polarność zbliżoną do polarności rozpuszczalnika), rozpuszczalnik o zbyt dużej mocy elucyjnej). Rozdział można poprawić stosując rozpuszczalnik o mniejszej mocy elucyjnej - polarności, w powyższym przykładzie P<0. Taki rozdział można zrealizować stosując chromatografię z odwróconymi fazami.

W odwróconym układzie faz, długie czasy retencji można skrócić przez zastosowanie rozpuszczalnika o większej mocy elucji (mniej polarnego, lub w przypadku eluentu metanol/woda o mniejszej zawartości wody). Natomiast zbyt krótkie czasy retencji można wydłużyć stosując rozpuszczalnik o mniejszej elucji (bardziej polarny lub zawierający więcej wody)

W obu typach chromatografii, jeśli czasy retencji są zbyt krótkie to rozdział można poprawić wydłużając czasy retencji przez zastosowanie rozpuszczalnika o mniejszej sile elucji ( w układzie normalnym jest to rozpuszczalnik jest to eluent mniej polarny a w odwrotnym układzie faz - eluent bardziej polarny, lub większej zawartości wody.

• w praktyce chromatograficznej stosuje się fazy stacjonarne o polarności zbliżonej do polarności składników mieszaniny

• związki polarne lepiej się rozdzielają na polarnych fazach stacjonarnych i wymagają mało polarnych rozpuszczalników

• związki niepolarne rozdzielają się na niepolarnych fazach stacjonarnych z zastosowaniem polarnych rozpuszczalników (chromatografia z odwróconymi fazami)

• związki średnio polarne lepiej rozdzielać stosując chromatografię z odwróconymi fazami stosując mocniejsze bardziej polarne rozpuszczalniki.

Jako fazę ruchomą można zastosować mieszaninę rozpuszczalników. Np. heksan/CCl₄, dioksan/CH₂Cl₂, metanol/woda Siła elucyjna mieszaniny rozpuszczalników różniących się polarnościami zmienia się w przybliżeniu liniowo (w skali logarytmicznej) wraz ze zmianą stężenia jednego ze składników.

Elucja izokratyczna - rozdział odbywa się przy stałej sile elucyjnej rozpuszczalnika (pojedynczy rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników o tym samym składzie)

Elucja gradientowa

Polega na ciągłej zmianie mocy elucyjnej rozpuszczalnika podczas rozdziału chromatograficznego mieszaniny.

a) b)

K'<<1 K'>>10

dla poprawy rozdzielczości należy dla poprawy rozdzielczości należy

zastosować rozpuszczalnik o zastosować rozpuszczalnik o

mniejszej mocy elucyjnej większej mocy elucyjnej

(o mniejszym powinowactwie

do składników lub adsorbenta)

c)

K'<<1 K'{1-10} K”>>10

dla poprawienia rozdzielczości należy zastosować elucję gradientową

• umożliwia ona wolniejszą elucję składników szybko wymywanych z kolumny i jednocześnie szybszą elucję składników długo wymywanych.

(w przypadku chromatografii gazowej elucję z gradientem temperatury, np. t₀=60˚C, Δt =10˚C/min, t_k=150˚C.

2. Wpływ rodzaju stacjonarnej na rozdział

składników mieszanin.

Podstawowe parametry fizykochemiczne adsorbentów:

• średnica ziaren (3 -10μm)

• rozrzut ziaren (10%)

• rozmiary porów (70 - 300L) oraz objętość porów

• powierzchnia właściwa (50 - 250 m²/g) (im większa powierzchnia właściwa tym większa retencja)

powierzchnia właściwa po chemicznej modyfikacji zmniejsza się nawet o ok. 50%

• gęstość centrów aktywnych (bonding phase density) (1 - 5 na nm²)

określa hydrofobowość adsorbenta, w przypadku chromatografii prostej

centrami aktywnymi mogą być np. grupy -OH, -NH₂, -CN

w chromatografii z odwróconymi fazami - C4, C8, C18, fenylowa

Klasyfikacja adsorbentów

Właściwości adsorpcyjne SiO₂*H₂O

Silikażel jest najczęściej stosowanym adsorbentem w praktyce chromatograficznej. Higroskopijność i zawartość wody w składzie SiO₂*H₂O tego adsorbenta decyduje o ilości wolnych, nie związanych mostkami wodorowymi grup silanolowych odpowiedzialnych za jego właściwościach adsorpcyjnych.

Rodzaje centrów aktywnych SiO₂:

Właściwości adsorpcyjne tego adsorbenta zależą od oddziaływań z wolnymi (nie związanymi) grupami silanolowymi, które wykazują słabo kwasowy charakter.

Maksymalna zawartość grup silanolowych na powierzchni żelu krzemionkowego - 8 - 9 μmol/m² lub średnio ok. 5 grup -OH na 100 Å

Inne adsorbenty

7.4 Chemiczna modyfikacja silikażeli - chemicznie związane fazy stacjonarne

Żele krzemionkowe poddawane są modyfikacji:

• termicznej , powodującej zmianę ilości wolnych grup silanolowych,

• chemicznej przez dołączenie organicznych ligandów, nowych centrów aktywnych, zmieniających własności adsorpcyjne silikażeli

Kowalencyjnie związane z fazą stacjonarną (żel krzemionkowy) grupy to najczęściej: C₈, C₁₀, C₁₈ , o dł. łancuchów 21 Å. Przyjmuje się, że cząsteczki składników mieszaniny penetrują pomiędzy tymi łańcuchami - a więc proces ten jest traktowany termodynamicznie jak rozpuszczanie.

Po chemicznej modyfikacji

- zmienia się powierzchnia właściwa adsorbenta

np. powierzchnia właściwa żelu krzemionkowego - 350 m²/g

powierzchnia wł. po modyfikacji chemicznej - 170 m²/g.

• pozostaje ok. 50% wolnych grup silanolowych (które mogą być dostępne

jeśli grupy R są krótkie, lub niedostępne - jeśli grupy R są długie, jak np.

C10, C18, w oddziaływaniach z rozpuszczalnikiem lub składnikiem.

np. silikażele zawieraja ok. 5 grup -OH na 100 Å,

najczęściej ok. 50% nie przereagowanych grup -OH pozostanie

po chemicznej modyfikacji silikażeli.

Typy połączeń grupy R z atomami Si silikażeli:

Si - R

Si-O-R

Si-O-Si-R

Można kontrolować właściwości tego typu faz poprzez rodzaj, ilość podstawników R na jednostkę powierzchni adsorbenta, długość łańcuchów alkilowych.

Podstawnik R może zawierać różnorodne grupy funkcyjne (C18, C14, C8, C4, C1, fenylowa, -CN, -NH₂, i inn.), zatem faza stacjonarna może mieć rózną polarność lub hydrofobowość.

Wpływ różnych czynników na retencję

• struktury składników mieszaniny

V_R 2

1

3

n

1 - alkilobenzeny

2 - alkilofenony

3 - estry kwasu p-hydroksybenzoesowego

Hypersil - C18 (5µm, 150x4.6mm), eluent: MeCN/woda 60/40, 1 ml/min

Alkilobenzeny wykazują silniejszą retencje niż alkilofenony. Obecność grupy karbonylowej powoduję słabsze oddziaływania z niepolarną (hydrofobową) fazą stacjonarną.

Najmniejsza retencja parabenów wynika z obecności bardziej polarnej(od gr. karbonylowej) estrowej, która słabo oddziałuje z niepolarną fazą stacjonarną

• charakteru fazy ruchomej oraz rodzaju oraz ilości centrów aktywnych

jeśli powierzchnia adsorbenta ma dużą gęstość centrów aktywnych R (niepolarnych) wtedy o retencji decydują niepolarne oddziaływania dyspersyjne

(jest to charakterystyczna cecha metod z odwróconymi fazami)

4

3

2

1

Zmiana retencji kwasu dodecylowego (faza stacjonarna: C18, duża gęstość centrów aktywnych - ok. 2 grupy R18 na 100 Å) w zależności od składu fazy ruchomej:

• - 100% MeCN t_R - 3.18 zmniejszenie

• - 99/1 MeCN/H₂O t_R - 3.20 mocy elucyjnej

• - 95/5 MeCN/H₂O t_R - 3.36 (tj. oddziaływań

• - 90/10 MeCN/H₂O t_R - 3.88 z fazą stacjonarną)

(zwiększenie polarności)

Kwas dodecylowy jest polarny lecz w jego retencji nie biorą udziału polarne (lub jonowe) oddziaływania z niepolarną (C18) fazą stacjonarną; Symetria pików potwierdza występowanie wyłączne oddziaływań dyspersyjnych.

Zmniejszając udział acetonitrylu (zwiększając udział wody) w fazie ruchomej obserwujemy zwiększanie się retencji kwasu dodecylowego

3

2

1

Retencja tego samego składnika (faza stacjonarna: Hypersil-C1) w zależności od składu fazy ruchomej

• - 100% MeCN t_R - ?

• - 99/1 MeCN/H₂O t_R - 7.30

• - 95/5 MeCN/H₂O t_R - 2.72

Gęstość centrów aktywnych w trójmetylosilanu (Hypersil-C1) wynosi 3 grupy C1 na 100 Å(a więc jest większa niż poprzednio) lecz grupy C1 są 18 razy krótsze. Powierzchnia SiO2 ma 5 - 8 grup OH na 100 Å, lecz tylko połowa została podstawiona (podczas chemicznej modyfikacji) grupami C1, natomiast pozostałe grupy -OH są dostępne dla cząsteczek składnika ze względu na małe rozmiary grup R1.

Z tego względu kwas dodecylowy jest silniej zatrzymywany w przypadku czystego MeCN (1) Jego retencja zmniejsza się ze wzrostem zawartości wody w fazie ruchomej. Gdy zawartość wody nie jest zbyt duża wtedy decydują polarne oddziaływania z adsorbentem (jego wolnymi grupami silanolowymi). Pik 3 (95/5 MeCN/H2O) jest symetryczny co świadczy o tym, że 5% H2O wystarczyło do stłumienia polarnych oddziaływań grup silanolowych adsorbenta z kwasem dodecylowym.

• składu fazy ruchomej

faza ruchoma MW BP R.I UV η μ

[ºC] [nm] [cP] [Debye]

acetonitryl 41 82 1.341 195 0.358 3.37

dioxan 88 101 1.421 215 1.26 0.45

etanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68

metanol 32 65 1.326 205 0.584 1.66

izopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68

tetrahydrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70

woda 18 100 1.33 185 1.00 1.84

Polarność fazy ruchomej nie jest jedynym czynnikiem warunkującym oddziaływania z adsorbenten. Np. moment dipolowy wody jest mniejszy niż acetonitrylu lecz woda nie bierze udziału w hydrofobowych oddziaływaniach z adsorbentem natomiast acetonitryl tak.

Chromatografia gazowa

Obejmuje metody chromatograficzne, w których fazą ruchomą jest gaz.

Fazą stacjonarna może być adsorbent (chromatografia adsorpcyjna)lub faza ciekła na nośniku (chromatografia podziałowa)

Składniki mieszaniny muszą być przeprowadzone w stan gazowy

Cechy chromatografii gazowej są konsekwencją zastosowania gazu jako fazy ruchomej - a więc substancji o znacznie niższej niż ciecz lepkości i większym współczynniku dyfuzji. Czas retencji oraz współczynnik retencji rozdzielanych składników jest zatem funkcją ich prężności pary nad fazą stacjonarną (zależną od temperatury) oraz rozpuszczalności w fazie stacjonarnej. Powinowactwo do fazy ruchomej (obojętnego gazu) odgrywa znaczącą rolę w chromatografii cieczowej

1. Gaz nośny

Jego rola polega wyłącznie na przenoszeniu składników przez kolumnę natomiast nie bierze on udziału w specyficznych oddziaływaniach ze składnikami mieszniny i nie wpływa na jakość rozdziału.

Rodzaj gazu nośnego (azot, hel, argon, wodór) zależy od stosowanego detektora: dla katarometru najlepszym gazem jest wodór i hel, których przewodnictwo cieplne (7.14, 5.97) najbardziej różni się od przewodnictw cieplnych rozdzielanych substancji zapewniając dużą wykrywalność. W detektorze argonowym, gazem nośnym jest argon.

Wybór gazu powinien uwzględniać wielkość współczynników dyfuzji składników w fazie ruchomej dla obniżenia dyfuzji podłużnej i zwiększenia sprawności kolumny.

2. Detektory

Obecnie stosuje się prawie wyłącznie detektory różniczkowe, mierzące zmiany właściwości eluatu - gazu nośnego zawierającego poszczególne składniki.

Cechy detektorów:

- czułość (stosunek przyrostu sygnału do przyrostu stężenia lub masy)

• wykrywalność (najmniejsza ilość substancji wywołująca sygnał, którego wysokość jest 2x większa od poziomu szumów

• zakres liniowości (proporcjonalność sygnału do stężenia substancji)

• mała objętość celki pomiarowej

• stabilność i odtwarzalność wskazań

• stała czasowa (0.01 dla kolumn kapilarnych)

Detektor cieplno-przewodnościowy (katarometr TCD)

Mierzy zmianę przewodnictwa cieplnego przepływającego gazu na skutek pojawienia się w nim składnika mieszaniny.

Zasadniczym elementem są cztery, włączone w obwód mostka Wheatstone'a, czujniki (drut wolframowy, platynowy, termistory z tlenków manganu, kobaltu niklu), których cechą jest znaczna zmiana oporu przy niewielkiej zmianie temperatury czujnika (tmp. detektora musi by ć utrzymywana z dokładnością do dziesiątych stopnia Celsjusza).

Jeśli przez celkę detektora przepływa gaz nośny to czujniki wykazują jednakowy opór elektryczny i układ jest w równowadze. Gdy w gazie nośnym pojawi się składnik mieszaniny o innym przewodnictwie cieplnym niż gaz nośny), wówczas temperatura i w konsekwencji opór elektryczny czujnika zmienia się.

Sygnał tego detektora zależy od prędkości przepływającego gazu, dlatego konieczna jest zachowanie stałości warunków (tmp., prędkości przeplywu)

Wykrywalność zależy od rodzaju gazu nośnego; najkorzystniejszy jest wodór i hel.

Czułość - zależy od temperatury czujników, którą można regulować.

Podstawowe cechy:

• mała wykrywalność 10^-7 - 10^-8 g/cm³ (nie można stosować kolumn kapilarnych)

• uniwersalność, można analizować wszystkie substancje, powszechnie stosowany w analizie gazów

• -nie niszczy próbki

• zakres liniowości - 10⁵

Detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID)

Jest najbardziej rozpowszechniony detektorem w chromatografii gazowej.

Mierzy zmiany natężenia prądu jonowego powstającego w celce detektora podczas spalania składników w gazie nośnym.

Podstawowym elementem jest palnik z temperaturą płomienia zależną od natężenia przepływu doprowadzonego do niego tlenu (powietrza) i wodoru oraz gazu nośnego.

W palniku umieszczonym między dwiema elektrodami i zasilaczem spala się badana substancja w gazie nośnym w wyniku czego powstają termojony (karbojony), zbierane na odpowiedniej elektrodzie i rejestrowany jest powstający prąd jonowy. Sygnał detektora jest proporcjonalny do ilości atomów węgla w cząsteczce, przy czym każdy szereg homologiczny ma inny współczynnik proporcjonalności.

Jest to detektor masowy, którego sygnał zależy od szybkości z jaką docierają do niego wykrywane substancje.

Cechy detektora

• wysoka wykrywalność (10^-12 g/s)

• zakres liniowości 10⁷

• stosowany dla związków organicznych (największa czułość dla węglowodorów)

• mniejsza czułość dla chlorowcopochodnych oraz pochodnych tlenowych, siarkowych, azotowych

• nie można wykrywać gazów szlachetnych, tlenu, azotu, tlenku i dwutlenku węgla, amoniaku, tlenków azotu, siarkowodoru, dwutlenku siarki, aldehydu i kwasu mrówkowego, wody i dwusiarczku węgla

• niszczy próbkę

Detektor płomieniowo-fotometryczny FPD

Jest odmianą detektora płomieniowo-jonizacyjnego, wykorzystywanego dla związków siarki i fosforu z dużą czułością.

Eluat z kolumny spala się w płomieniu z nadmiarem wodoru, tak że ze związków siarki i fosforu powstają wzbudzone cząsteczki S2 lub tlenek fosfiny (HPO), które emitują charakterystyczne dla siebie promieniowanie (394 nm dla związków siarki lub 526 nm dla związków fosforu) rejestruje się za pomocą fotopowielacza. W niektórych detektorach możliwe jest jednoczesne oznaczanie tych związków.

Detektor termojonowy TID (alkaliczny detektor płomieniowo-jonizacyjny AFID)

Jest również odmianą detektora płomieniowo-jonizacyjnego. Stosowany jest detektorem azotowo-fosforowym umożliwiającym oznacznie śladowych ilości tych związków oraz halogenopochodnych.

Detektor argonowy i helowy (ArD, HeD)

Mierzą natężenie prądu jonowego

Źródłem jonizacji są meta-stabilne atomy argonu Ar*(lub helu He*), które otrzymuje się przez jonizację argonu (helu) promieniowaniem α lub β (izotopy radu, strontu).

Wzbudzone atomy argonu (helu) tracą energie w zderzeniach z cząsteczkami badanych substancji. Jeżeli potencjał jonizacji tych substancji jest niższy od potencjału wzbudzenia argonu (helu) to ulegają one jonizacji:

Ar + e → Ar* + e- (energia metatrwałych at. argonu - 11.6 eV)

Ar* + S → Ar + S⁺ + e

W detektorze argonowym jonizacji ulegają związki, których potencjał jonizacji jest niższy od energii wzbudzonych atomów argonu (11.6 eV).

W praktyce sprowadza się to do oznaczania wszystkich związków organicznych, natomiast nie mogą być oznaczane gazy trwałe (wodór, tlen, azot).

Mniejsza czułość dla pochodnych azotowych i chlorowcopochodnych (rekombinacja)

W detektorze helowym (wyższy potencjał wzbudzenia atomów helu 19.6 eV) można oznaczać wszystkie gazy trwałe (z wyj, neonu)

Gazem nośnym może być tylko argon (hel)

Detektor fotojonizacyjny (PID)

Substancje ulegają jonizacji pod wpływem promieniowania nadfioletowego. Dobierając źródło emitujące promieniowanie o różnej długości można selektywnie i z dużą wykrywalnością oznaczać określone związki (10^-11 g/s).

Detektor wychwytu elektronów (rekombinacyjny) ECD

Źródło jonizacji - cząstki α, β żródła promieniotwórczego

Gaz nośny - azot, argon z metanem

W wyniku jonizacji gazy nośnego, jony dodatnie i elektrony zbierane są przez odpowiednie elektrody i tworzy się prąd tła.

N₂ + β → N₂⁺ + 2e

Wprowadzona do detektora substancja (o powinowactwie do elektronowym) wychwytuje elektrony, tworząc jony ujemne, które z kolei zderzają się z jonami dodatnimi (rekombinacja) tworząc cząsteczki obojętne. W wyniku tych przemian następuje obniżenie natężenia prądu jonowego.

S + e → S^-

S^- + N₂⁺ → S + N₂

Umożliwia wykrywanie śladowych ilości substancji ( 10^-13 - 10^-14 g/s) mających powinowactwo elektronowe, pochodnych tlenowych, siarkowych, azotowych, chlorowcopochodnych. Nie jest przydatny do oznaczania węglowodorów, estrów eterów.

3. Kolumny i ich wypełnienie

W chromatografii gazowej stosowane są:

• kolumny pakowane (l =1-3m, d =2-6mm)

mikropakowane (d = 0.8-1,2 mm, długość kilkunastu metrów)

preparatywne (pakowane, d>6mm, dł. kilka metrów)

• kapilarne (d = 0.2 - 0.6 mm długość kilkadziesiąt metrów, mają większą od mikrokapilarnych pojemność sorpcyjną)

mikrokapilarne (d>0.1mm, długość kilkadziesiąt metrów, większą od

kapilarnych rozdzielczość)

Kolumny kapilarne (metalowe lub najczęściej szklane, ze stopionej czystej krzemionki) mogą mieć ścianki pokryte ciekłą fazą stacjonarną lub porowatą warstwę adsorbenta na ściankach .

Fazę stacjonarną wiąże się chemicznie w reakcjach z grupami hydroksylowymi krzemionki, lub przez sieciowanie fazy stacjonarnej z zastosowaniem inicjatorów reakcji rodnikowych, promieniowania UV.

Adsorbenty

Różnią się:

• powierzchnią właściwą (kilkadziesiąt do kilkuset m²/g)

• rodzajem i ilością centrów aktywnych

• aktywnością (aktywacja polega na wygrzewaniu w odpowiedniej temperaturze i usunięciu wody, dwutlenku węgla)

Adsorbenty nieorganiczne

• sita cząsteczkowe (naturalne lub syntetyczne zeolity - glinokrzemiany, najczęściej wapnia) o określonej średnicy porów (1.3 μm , 0.5μm)

Stosowane są do rozdzielania gazów (azotu, tlenu, helu, tlenków węgla,

tlenków azotu, gazów szlachetnych

• żele krzemionkowe (Spherosil, Corasil, Porasil, Chromosil) o różnych właściwościach w zależności od średnicy cząstek, powierzchni właściwej, średnicy porów i inn.

• tlenek glinu, ma mniejsze znaczenie (ze względu na trudności w utrzymaniu aktywności na stałym poziomie)

Powyższe adsorbenty mają właściwości hydrofilowe i nie mogą być stosowane jeśli gaz nośny jest wilgotny lub próbka zawiera wodę

• Thermo-trap TA - adsorbent fydrofobowy do analiz śladowych

substancji w wodzie i powietrzu

Adsorbenty organiczne

Obecnie najczęściej stosowany rodzaj adsorbentów w chromatografii gazowej. Są to porowate polimery, kopolimery (np. styrenu i dwuwinylobwnzenu - Porapak P, PS, Q, QS, R, N, T, Chromosorb 101, 102, 103 itd.), różniące się powierzchnią właściwą, porowatością, temperaturą stosowania.

Fazy stacjonarne

Rozdzielanie składników mieszanin na ciekłych fazach stacjonarnych zależy od różnic w rozpuszczalności tych składników. Stąd najważniejszą cechą faz stacjonarnych wpływającą na ich rozdzielczość jest ich polarność. Drugą cecha determinującą przydatność w chromatografii gazowej jest mała prężność pary i duża odporność termiczna.

Fazy stacjonarne sklasyfikowano w oparciu o indeks polarności Rohrschneidera, wg umownej skali, w której skwalan ma polarność = 0 a β, β' -oksy-dwupropionitryl ma polarność = 100.

Inne systemy klasyfikacji uwzględniają ich elektrodonorowe i akceptorowe własności

Węglowodory - Skwalan, Apiezony (węglowodory alkanowe)

Silikony - oleje silikonowe i polimery, dimetylo oraz metylofenylosiloksany są najczęściej stosowanym rodzajem faz stacjonarnych. Różnią się zawartością grup funkcyjnych.

Pierwsze są stosowane do rozdzielania związków niepolarnych drugie - aromatycznych i średniopolarnych. Do tej grupy zalicza się także fazy fluoroalkilosilikonowe (średnia polarność), nitrylosilikony (wysoka polarność)

Poliglikole (glikole polietylenowe - Carbowax PEG, propylenowe - dzięki obecności atomów o charakterze donorów i akceptorów elektronów mogą oddziaływać ze związkami o różnym charakterze.

Estry kwasów karboksylowych (sebacynowego, adypinowego, ftalowego, bursztynowego) - mają zdolność tworzenia wiązań wodorowych, wadą jest reagowanie z alkoholami i aminami w tmp..120 ^oC

Inne fazy stacjonarne:

• optycznie czynne (dipeptydy, diaminy) - do rozdzielania związków

racemicznych

• ciekłe kryształy ( o charakterystycznym dla kryształów stałych

uporządkowaniu cząsteczek, wykazują anizotropię różnych właściwości)

Ich oddziaływanie ze składnikami mieszaniny zależy w mniejszym

stopniu od ich polarności a w większym od kształtu cząsteczek (łatwość

rozdzielania izomerów geometrycznych)

W wyborze fazy stacjonarnej należy uwzględnić oprócz jej polarności, także elekrono-donorowe/akceptorowe właściwości, stałą dielektryczną i in.

Czynniki wpływające na rozdzielczość w chromatografii gazowej

R_S = f (α, K', N)

• - selektywność układu chromatograficznego (fazy

stacjonarnej), współczynnik rozdzielenia

K' - współczynnik retencji (pojemnościowy)

N lub H - sprawność kolumny

Miarą selektywności fazy stacjonarnej jest różnica czasów retencji dwóch związków o różnej budowie lecz o identycznych temperaturach wrzenia. Jeśli ta różnica jest duża to świadczy to o dobrej selektywności fazy stacjonarnej

α oraz K' zależą od:

• rodzaju fazy stacjonarnej (polarność, stała dielektryczna,

własności elektrono-donorowe/akceptorowe, oraz

• temperatury

V_M

V_R = V_M + KV_S = V_M + K' V_S = V_M (1 + K')

V_S

t_R = t_M (1 + K')

proces rozpuszczania jest egzotermiczny

lnK = - H_r /RT + lnc → k ~ 1/T

zatem

• podwyższenie temperatury powoduje skrócenie czasu

retencji i pogorszenie rozdzielczości

• obniżenie temperatury powoduje wydłużenie czasu retencji i poprawę rozdzielczości

Zbyt niska temperatura powoduje poszerzanie i niesymetryczność pików i wydłuża czas analizy

Wzrost tmp. o 30^oC skraca czas analizy o ok. połowę

Dobór odpowiedniej temperatury zależy od temperatury wrzenia składników rozdzielanej mieszaniny oraz termicznej odporności fazy stacjonarnej

W chromatografii podziałowej

temperatura kolumny powinna być zbliżona do temperatury wrzenia składników mieszaniny

W chromatografii adsorpcyjnej

temperatura kolumny może być wyższa od temperatury wrzenia składników mieszaniny

Chromatografia izotermiczna (w stałej temperaturze) oraz z programowaniem temperatury

Gdy temperatury wrzenia składników mieszaniny nie różnią się więcej niż o kilkadziesiąt stopni, wówczas można rozdzielić mieszaninę stosując stałą temperaturę kolumny w czasie analizy

Gdy temperatury wrzenia składników mieszaniny różnią się znacznie (np. 100^oC) wówczas należy zastosować programowanie temperatury

K = c_S / c_M

Jeśli K_A > K_B to t_A > t_B

Jeśli K_A = K_B to t_A = t_B

faza

stacjonarna

K = C_s/C_M

K' = K * V_S/V_M

K' = c_S*V_S / c_M*V_M = c_S/c_M * V_S/V_M

K' = N_S/N_M

V_R = V_M + K V_S

V_R = V_M + K A_S

V_M

V_R = V_M + K' V_S = V_M (1 + K')

V_S

t_R = t_M (1 + K') stąd

K' = (t_R -t_M) / t_M

m_s/a

K_a =

m_r/V_M

m_s/a a m_s

K'_a = K_a * a/V_M = * =

m_r/V_M V_M m_r

t_R = f (K, K', V_s lub A_s, L, u)

---