8. ROLA CHROMATYNY W REGULACJI EKSPRESJI GENOW.

Kazda z komorek zywego organizmu zawiera z nielicznymi wyjatkami ten sam zestaw genow. Z drugiej strony wiadomo, ze organizmy skladaja sie niekiedy z setek roznych typow komorek, z ktorych kazda ma inna role do spelnienia. Strukturalna i funkcjonalna roznorodnosc komorek, jak rowniez roznorodnosc reakcji na bodzce srodowiskowe i fizjologiczne osiagnieta zostaje przez kontrolowana ekspresje genow zalezna od natury komorki, etapu cyklu komorkowego czy cyklu rozwojowego. Ryc. 8-1 przedstawia schematycznie rozne etapy procesu ekspresji genow w szerokim znaczeniu tego slowa, od aktywacji regulatorow transkrypcji poczawszy na syntezie funkcjonalnego bialka skonczywszy. W regulacji tej kluczowa role w komorkach eukariotow, odgrywa chromatyna a w szczegolnosci stopien jej kondensacji.

Regulatory transkrypcji. Poziom ekspresji wiekszosci genow jest regulowany przez czynniki transkrypcyjne, ktore wiaza sie z sekwencjami regulatorowymi w DNA znajdujacymi sie po stronie 5' miejsca w ktorym zaczyna sie transkrypcja. Ocenia sie, ze okolo 5% naszych genow koduje czynniki transkrypcyjne, co daje miare wagi tych czynnikow dla poprawnego funkcjonowania komorek. Ich aktywnosc jest z kolei regulowana przez szereg roznych sciezek regulacyjnych. I tak na przyklad czynniki transkrypcyjne, ktore reguluja ekspresje genow waznych dla cyklu komorkowego sa regulowane przez elementy sygnalizacyjne tego cyklu a czynniki, ktore moduluja enzymy metabolizmu sa czesto regulowane przez metabolity.

Sekwencje regulatorowe wiekszosci genow eukariotow zawieraja miejsca wiazania licznych czynnikow transkrypcyjnych zapewniajacych to, ze kazdy gen moze reagowac w ramach rozmaitych sciezek sygnalizacyjnych oraz ulatwiajacych precyzyjna regulacje poziomu transkrypcji. Naogol aktywnosc czynnikow transkrypcyjnych zalezy od kontekstu tzn. moze byc modulowana przez inne bialka tworzace kompleksy z sekwencjami DNA znajdujacymi sie w poblizu. Jeden i ten sam czynnik transkrypcyjny moze indukowac transkrypcje jednego genu i wygaszac transkrypcje innego. Taka regulacja transkrypcji zalezna od kontekstu jest nazywana "kombinatoryjna". Pozwala ona reagowac komorkom eukariotycznym na zaskakujaco duza ilosc roznych bodzcow przy pomocy stosunkowo niewielkiej ilosci czynnikow transkrypcyjnych. Kontrola transkrypcji jest prostsza u prokariotow, gdzie geny jednej sciezki metabolicznej sa wspolregulowane w ramach jednej jednostki transkrypcyjnej (operonu).

Regulacja regulatorow. Regulatory transkrypcji same podlegaja roznym systemom regulacji. Jednym z podstawowych systemow jest transport pomiedzy cytoplazma a jadrem. Zachodzi on przy udziale porow jadrowych, ktore kontroluja przemieszczanie sie makromolekul. Czynniki transportujace rozrozniaja krotkie motywy aminokwasowe znajdujace sie w bialkach, ktore podlegaja transportowi przez pory. Rozroznia sie dwa typy motywow transportujacych: eksportowy, zidentyfikowany w bialkach transportowanych z jadra (nuclear export signal, NES) oraz importowy (nuclear localisation signal, NLS). Tego typu system zezwala na stosunkowo prosta kontrole wedrowki bialek. Maskowanie NES i NLS lub ich modyfikacja uniemozliwia rozpoznanie motywow przez systemy transportujace i tym samym uniemozliwia transport.

Modyfikacja czynnikow transkrypcyjnych jest niekiedy powodowana przez czasteczki sygnalizujace niezdolne do wnikniecia do komorki. Jest to sciezka regulacyjna zwana transdukcja sygnalu. Czasteczka sygnalizujaca (czesto polipeptyd) wiaze sie z receptorem obecnym na powierzchni komorki, co powoduje zmiane w konformacji tej jego czesci, ktora zlokalizowana jest wewnatrz komorki. Zmiana ta indukuje reakcje biochemiczna w komorce (na przyklad fosforylacje), ktora to reakcja aktywuje czynnik transkrypcyjny. Transdukcja sygnalu jest metoda stosowana przez komorki np. w przypadku stymulacji transkrypcji przez interferon. Niektore hormony (np glukokortykoidy) moga wnikac do wnetrza komorki i tam lacza sie z receptorami, sa transportowane do jadra gdzie kompleks hormonu z receptorem dziala jako czynnik transkrypcyjny.

Aby moc odpowiedziec szybko na zewnetrzny lub wewnetrzny bodziec wymagajacy zmiany w ekspresji genow komorka musi byc w stanie nie tylko szybko aktywowac jeden lub wiecej aktywatorow ale musi rowniez moc szybko inaktywowac inne aktywatory transkrypcyjne. Jedna z metod stosowanych w tym celu przez komorki jest system oparty na ubikwitynacji i degradacji proteolitycznej bialek, ktory jest czynny w procesie poczatkowego uaktywniania i nastepujacej w dalszym etapie degradacji czynnikow transkrypcyjnych. I tak np. stwierdzono, ze w drozdzach ubikwitynacja zwieksza aktywnosc domeny aktywujacej transkrypcje (TAD, transcription activation domain) w czynniku transkrypcyjnym VP16 wirusa herpes simplex ale rowniez "naznacza" ja w celu degradacji. Podobnie w komorkach ssakow aktywnosc proteosomu 26 S (zaangazowanego w proteolize) jest niezbedna zarowno dla uzyskania aktywnosci przez receptor estrogenu jak i dla jego pozniejszej degradacji zaleznej z kolei od obecnosci ligandu. Nastepujace po sobie aktywacja i degradacja czynnikow transkrypcyjnych zwiazanych z promotorami umozliwia szybkie dostosowanie aktywnosci genu do potrzeb komorki w zmieniajacym sie srodowisku. Jesli sygnalizowana jest koniecznosc kontynuowania transkrypcji, nowo aktywowany czynnik transkrypcyjny zastepuje ten, ktory ulegl degradacji. Natomiast, jesli sygnal kontynuowania transkrypcji zanika, czynnik zdegradowany nie jest zastepowany innym i transkrypcja ustaje. Taki model dobrze tlumaczy mechanizm dzialania glukokortykoidow u ssakow.

Ubikwityna odgrywa role i w innych fazach transkrypcji. Duza podjednostka polimerazy II RNA (RNAP II) jest ubikwitynowana podczas transkrypcji. Ubikwitynacja jest rowniez indukowana przez UV i przez uszkodzenia w DNA powodowane przez cisplatyne.

Poza ubikwitynacja szereg innych modyfykacji post-translacyjnych odgrywa wazna role w regulacji aktywnosci czynnikow transkrypcyjnych. Najlepiej zbadana z nich jest fosforylacja, co wynika z latwosci z jaka mozna ja badac. Jednak czynniki transkrypcyjne sa podatne i na inne modyfikacje takie jak acetylacja lizyny czy metylacja lizyny lub argininy.

Dwie formy wlokna chromatynowego. Dostepnosc DNA dla bialek w regionach transkrypcyjnie kompetentnych chromatyny, i jego niedostepnosc w regionach transkrypcyjnie niekompetentnych, zostaly wykazane w doswiadczeniu w ktorym traktowano chromatyne enzymami nukleolitycznymi. Okazalo sie, ze odcinki DNA odpowiadajace transkrybowanym genom oraz regionom chromosomu bezposrednio do nich przylegajacym (o dlugosci kilku do kilkudziesieciu kb) ulegaja trawieniu. Natomiast chromatyna w odcinkach chromosomu polozonych poza tym regionem istnieje w formie utrudniajacej dostep enzymow nukleolitycznych do DNA (Ryc 8-2). Nietranskrybowane regiony chromosomow zorganizowane sa w chromatyne zbita (heterochromatyne) podczas gdy geny ulegajace transkrypcji organizuja sie w chromatyne rozproszona, (euchromatyne). Kazdy typ komorek ma wlasny jednostkowy uklad hetero- i euchromatyny i ten uklad dziedziczy sie z jednego pokolenia komorek na nastepne. Zmany struktury chromatyny odpowiadaja wiec za epigenetyczne zmiany fenotypu komorek czy organizmow, a wiec za takie zmiany, ktorym nie wywolane sa roznicami w sekwencji DNA.

Heterochromatyna od euchromatyny rozni sie konformacja DNA w nukleosomie, obecnoscia zmodyfikowanych histonow i niekiedy metylowanego DNA oraz skladem bialek niehistonowych. Stosunkowo dobrze poznano heterochromatyne drozdzy w regionie telomerow oraz w nieaktywnych transkrypcyjnie lokusach MAT (mating) zawierajacych informacje zwiazana z przelaczaniem typu koniugacyjnego (Ryc 8-3). Podstawowa role w procesie tworzenia heterochromatyny w chromosomach drozdzy odgrywaja bialka Sir3 i Sir4 (silent information regulator), ktore oddzialywuja z ogonami histonow H3 i H4 i tworzac zwarty kompleks makromolekularny chroniacy DNA przed oddzialywaniem z innymi bialkami. W heterochromatynie organizmow wyzszych natomiast znaleziono m.in. bialko HP1 (heterochromatin protein 1) pelniace podobna role jak bialka Sir.

W euchromatynie zawierajacej sekwencje kodujace DNA, ktora jest w przyblizeniu dziesieciokrotnie bardziej wrazliwa od heterochromatyny na enzymy nukleolityczne, wyroznia sie dodatkowo regiony o jeszcze wyzszej (o kolejne dziesiec razy) wrazliwosci na nukleazy. Regiony te o dlugosci kilkuset par zasad nazwane zostaly miejscami hiperczulymi (HS, hypersensitive sites) (Ryc. 8-4). W tych wlasnie miejscach DNA wiaze sie z bialkami regulatorowymi rozpoznajacymi specyficzne sekwencje nukleotydowe. Powstajace w wyniku takich specyficznych oddzialywan kompleksy odpowiedzialne sa za regulacje aktywnosci transkrypcyjnej sasiadujacych genow. Tak wiec obecnosc HS sygnalizuje naogol obecnosc promotora lub wzmacniacza. Niekiedy obserwuje sie kilka miejsc HS polozonych w bliskim sasiedztwie. Moze byc to oznaka, ze region ten jest regionem kontroli lokusu LCR, (locus control region) odpowiedzialnym za kontrole ekspresji jednego lub kilku sasiadujacych genow, tak jak ma to miejsce w przypadku genow betaglobiny czlowieka. (Ryc. 8-5).

Jak czynniki transkrypcyjne reguluja ekspresje genu. Podczas zmiany typu komorek zwiaznej np. z cyklem rozwojowym, niektore geny dotychczas nietranskrybowane znajdujace sie w strukturach heterochromatynowych musza ulec derepresji. W tym celu nastapic musi rozluznienie tych struktur i udostepnienie sekwencji regulatorowych w DNA dla oddzialywan z bialkami bioracymi udzial w procesie ekspresji.

Rozluznianie chromatyny wyglada troche jak problem typu: co bylo pierwsze kura czy jajko? Aby rozluznic chromatyne odpowiednie bialka musza ulec zwiazaniu z DNA, co z kolei wymaga, aby chromatyna byla rozluzniona. Jedno z rozwiazan tego paradoksu polega na tym, ze niektore czynniki transkrypcyjne moga rozpoznawac swoje specyficzne miejsca wiazania nawet wtedy gdy DNA jest zwiazany z bialkiem. Np. receptor glukokortykoidu GR rozpoznaje krotka sekwencje nukleotydow w DNA i wiaze sie w rowku wiekszym, po jednej stronie helisy, nawet wtedy gdy DNA jest zwiazany z histonami w nukleosomie (Ryc 8-6). Natomiast aktywator zwany czynnikiem NF1 (nuclear factor 1) rozpoznaje dluzsze sekwencje DNA i calkowicie otacza czasteczke, tak, ze nie jest w stanie stworzyc kompleksu z DNA gdy ten jest owiniety wokol oktameru histonow. Niekiedy dostep do DNA uwarunkowany jest precyzyjnym umiejscowieniem rozpoznawanej sekwencji w stosunku do powierzchni nukleosomu. Stwierdzono, ze pomiedzy czynnikami transkrypcyjnymi zachodzi funkcjonalna kooperacja. Na przyklad wirus MMTV posiada promotor zawierajacy piec elementow wiazacych GR i dwa elementy NF1. GR wiaze sie do conajmniej dwoch miejsc nawet wtedy gdy DNA jest w formie nukleosomu. Po zwiazaniu sie z DNA GR rekrutuje czynniki modyfikujace chromatyne zwiekszajac tym samym dostepnosc DNA i umozliwiajac wiazanie NF1.

Aby rozluznienie zapoczatkowywane przez aktywatory transkrypcji doszlo do skutku potrzebna jest wspolpraca pomocniczych bialek, koaktywatorow. Rola koaktywatorow byla niejasna dopoki nie zrozumiano ze wiele z nich jest podjednostkami kompleksow zmieniajacych strukture chromatyny lub enzymami modyfikujacymi bialka chromatyny (patrz nizej). Z reguly, dopiero rekrutacja koaktywatorow prowadzi do lokalnego rozluznienia chromatyny umozliwiajac dostep RNAPII oraz ogolnej maszynerii transkrypcyjnej do promotora.

Obok aktywatorow w chromatynie dzialaja represory takie jak np. bialko pRB kodowane przez gen supresorowy nowotworow RB1. Jego nazwa pochodzi od tego, ze mutacje w tym genie wywoluja nowotwor dzieciecy retinoblastome. Bialko to i inne nalezace do tej samej rodziny i wykazujace podobienstwa strukturalne biora udzial w regulacji cyklu komorkowego. Ich ekspresja powoduje zahamowanie komorki w fazie G1. Represory dzialaja we wspolpracy z korepresorami, ktore rowniez maja wlasnosci enzymatyczne i modyfikuja ogony histonow. Koaktywatory i korepresory nazywamy ogolnie koregulatorami.

Koregulatory jako potencjalne koordynatory regulacji transkrypcji. Koregulatory sa rekrutowane do promotorow przez czynniki transkrypcyjne specyficzne do sekwencji DNA. Koregulatory w rozny sposob wplywaja na transkrypcje. I tak np. pewne koaktywatory rekrutowane sa przez receptory jadrowe zwiazane z ligandem (hormonem) natomiast korepresory, ktore wyciszaja transkrypcje, rekrutowane przez receptor niezwiazany z hormonem albo zwiazany z antagonista hormonu. Jedne i drugie odgrywaja zasadnicza role w generowaniu tkankowo specyficznej odpowiedzi charakterystycznej dla receptora jadrowego (Ryc 8-7). Mediator, kompleks zlozony z szeregu podjednostek, ktory wiaze sie z polimeraza RNA, RNAP II, ktory jest niezbedny dla regulacji wielu roznych genow stanowi inny typ koregulatora, ktory sam przez sie nie wplywa na transkrypcje, ale posredniczy w dzialaniu sygnalow zarowno pozytywnych jak i negatywnych.

Ze wzgledu na sposob w jaki koregulatory zmieniaja strukture chromatyny mozna je podzielic na dwie grupy : pierwsza to kompleksy modyfikujace histony. Istnieja cztery klasy modyfikatorow histonow bioracych udzial w regulacji transkrypcji : acetylotransferazy histonow (HAT) deacetylazy histonow (HDAC), metylo-transferazy histonow (HMT) i kinazy histonow. Acetylacja histonow byla pierwsza z modyfikacji dla ktorych wykazano korelacje z kompetencja transkrypcyjna. Jest to modyfikacja, ktora inicjuje rozluznienie struktury chromatyny. Rekrutacja HAT i HMT przez aktywatory powoduje acetylowanie i metylowanie reszt aminokwasowych w "ogonach" co jest niezbedne dla aktywacji transkrypcji wielu genow. Odwrotnie, rekrutacja HDAC przez represory transkrypcji powoduje deacetylowanie ogonow co prowadzi najczesciej do wygaszania transkrypcji.

Zaleznosc pomiedzy modyfikacjami ogonow histonowych i ekspresja genow jest zlozona powniewaz rozne modyfikacje w roznych miejscach w ogonie wplywaja na siebie nawzajem. Po raz pierwszy zostalo to zauwazone w przypadku acetylacji i fosforylacji histonu H3, ale stwierdza sie rowniez interferencje pomiedzy acetylacja i metylacja. Dwa typy HMT uczestnicza w regulacji transkrypcji. Jedne z nich metyluja reszty argininy a inne lizyny. Metylacja argininy aktywuje transkrypcje podczas gdy metylacja lizyny powoduje skutki zalezne od kontekstu. I tak np. metylacja lizyny K9 w histonie H3 (H3-K9) prowadzi z reguly do represji genow. Niekiedy ma dzialanie aktywujace jesli rownoczesnie metylowane sa lizyny H3-K4 i H3-K27 na tym samym ogonie. Metylacja lizyny H3-K4 w komorkach ludzkich i u drozdzy naogol aktywuje transkrypcje, ale prowadzi do represji w genie kodujacym rybosomalny RNA.

Sposob w jaki modyfikacje histonow wplywaja na transkrypcje jest obecnie intensywnie badany. Hipoteza "kodu histonowego" (Ryc. 8-8) postuluje, ze rozne modyfikacje ogonow powoduja powstanie specyficznych miejsc wiazania bialek pomocniczych. Szereg bialek regulatorowych posiada specjalne domeny np. chromodomene (chromatin organisation modifier) czy bromodomene, ktore wiaza sie specyficznie z nicia chromatynowa zawierajaca nukleosomy w ktorych ogony histonow sa zmodyfikowane. Bialka posiadajace bromodomene a wiec specyficzna domene lancucha polipeptydowego o dlugosci 110 aminokwasow posiadaja powinowactwo do acetylowanej lizyny. Natomiast chromodomena obecna w bialkach HP1 u kregowcow i bialkach grupy polycomb (PcG) u drosofili wiaze nukleosomy metylowane w lizynie H3-K9 powodujac kondensacje chromatyny. W tym wiec przypadku modyfikacja ogona pociaga za soba zmiane formy chromatyny z euchromatyny na heterochromatyne. Ale kod histonowy jest uzywany przez komorki nie tylko do regulacji kondensacji chromatyny. Stwierdzono, ze infekcja wirusowa komorek ludzkich powoduje wpierw acetylacje lizyny H3-K9 oraz fosforylacje seryny H3-S10 w regionie promotora interferonu, ktory stanowi jeden z czynnikow obronnych organizmu przed inwazja wirusow. Fosforylacja H3-S10 jest warunkiem niezbednym dla acetylacji H3-K14, co tez wkrotce po fosforylacji nastepuje. Niezaleznie od tego nastepuje rowniez acetylacja H4-K8. Acetylacja lizyn H3-K9 i H3-K14 jest warunkiem koniecznym dla rekrutacji czynnika transkrypcyjnego TFIID rozpoznajacego kasete TATA. Utworzenie kompleksu TFIID z DNA stanowi pierwszy etap w konstrukcji kompleksu preinicjacyjnego polimerazy II RNA, natomiast acetylacja H4-K8 pociaga za soba rekrutacje kompleksu SWI/SNF rozluzniajacego chromatyne i przygotowujacego ekspresje genu. Tak wiec specyficzne odczytywanie kodu histonowego przez odpowiednie systemy modyfikacji chromatyny zapoczatkowuje kaskadowa modyfikacje struktury wlokna chromatynowego bedaca elementem regulacji aktywnosci transkrypcyjnej.

Innym przykladem wykazujacym zaleznosc skutku modyfikacji ogonow histonowych od kontekstu jest wplyw koaktywatora CARM1 (coactivator-associated arginine methyltransferase 1) na transkrypcje. CARM1 znajduje sie w centrum ukladu decydujacego o tym czy komorka transkrybuje geny znajdujace sie pod kontrola receptorow jadrowych czy geny bedace pod kontrola czynnika transkrypcyjnego CREB (cAMP responsive element binding protein). CARM1 jest mianowicie koaktywatorem argininowej metylotransferazy (HMT), ktora metyluje ogon histonu H3. Ta metylacja powoduje indukcje genow regulowanych przez receptory jadrowe. Ale CARM1 koaktywuje rowniez metylacje argininy w innym koaktywatorze P300/CBP (creb binding protein), ktory, jesli niemetylowany, aktywuje czynnik transkrypcyjny CREB. Metylacja P300/CBP uniemozliwia wiec aktywacje CREB. CARM1 jest wiec rownoczesnie koaktywatorem transkrypcji genow zaleznych od receptorow jadrowych i korepresorem genow zaleznych od czynnika transkrypcyjnego CREB.

Bialko represorowe pRB, nalezace do supresorow nowotworow wiaze sie z niektorymi czynnikami transkrypcyjnymi regulujac ich aktywnosc a takze rekrutuje bialko SUV39H1, ktore ma wlasnosc HMT metylujacej podwojnie grupe aminowa lancucha bocznego lizyny H3K9. Nukleosomy z ogonami metylowanymi w ten sposob rekrutuja bialk HP1 posiadajaca chromodomene co z kolei powoduje heterochromatynizacje genow bedacego pod wplywem tych czynnikow.

Druga grupa koaktywatorow to kompleksy remodelujace chromatyne, ktore uzywaja jako zrodla energii ATP. Ich dzialanie polega na ulatwianiu dostepu do DNA poprzez zmiane pozycji nukleosomow w obrebie promotora lub przez indukowanie zmian konformacyjnych w nukleosomach (Ryc. 8-9). Wiekszosc z nich nalezy do jednej z dwoch rodzin : SWI/SNF oraz ISWI. Pierwszy z tych kompleksow odkryty zostal u drozdzy, gdzie stwierdzono, ze niektore mutanty niezdolne do fermentacji (sucrose non fermenting) mialy rownoczesnie defekt w przelaczaniu typu koniugacyjnego (switch). Geny odpowiedzialne za te fenotypy nazwano SWI/SNF. Bialka przez nie kodowane tworza duzy kompleks zlozony w sumie z 12 podjednostek, ktory to kompleks hydrolizuje ATP i zmienia strukture chromatyny in vitro w ten sposob, ze staje sie ona bardziej wrazliwa na trawienie enzymami nukleolitycznymi. Produkty trawienia przypominaja bardziej produkty trawienia DNA "nagiego" niezwiazanego z nukleosomami niz DNA obecnego we wloknie chromatynowym. Jesli chodzi o transkrypcje, to stwierdzono, ze u drozdzy mutanty swi/snf wykazuja zmniejszona ekspresje pewnych genow a zwiekszona innych. Pozwala to sadzic, ze kompleks SWI/SNF reguluje ekspresje niektorych represorow. U drozdzy wykryto rowniez drugi, homologiczny kompleks bialkowy RSC (remodel the structure of chromatin) wykazujacy podobne wlasnosci. U drosofili znaleziono homologiczny kompleks zawierajacy produkt genu Brm (brahma) a u czlowieka dwa kompleksy : hBRM (human brahma) i BRG-1 (brahma related gene).

Mutacje w genach kodujacych podjednostki kompleksow remodelujacych chromatyne moga miec bardzo rozne skutki. U myszy, homozygoty ze wzgledu na delecje w genie brm, nie stwierdzono specjalnych defektow poza tym, ze byly one nieco wieksze od myszy bez delecji. Wskazuje to na zaklocenia kontroli wzrostu. Natomiast delecja genu BRG-1 jest letalna na wczesnym etapie rozwoju embrionu.

Druga rodzina kompleksow zaangazowanych w remodelowanie chromatyny zwanych ISWI (Imitation SWI) rozni sie nieco pod wzgledem funkcji. Zamiast zwiekszac ogolna podatnosc wlokna chromatynowego na trawienie nukleolityczne kompleksy te powoduja zmiane w pozycjonowaniu nukleosomow pod wplywem ATP. Pod wplywem ich dzialania obserwuje sie wiec zmiany w odleglosciach pomiedzy nukleosomami.

Istnieje jeszcze trzeci typ kompleksow remodelujacych zawierajacy bialko Mi-2. Roznia sie one od kompleksow typu SWI/WNF i ISWI tym , ze po pierwsze w ich skladzie znajduje sie podjednostka wiazaca sie specyficznie do metylowanego DNA, a po drugie zawieraja one jako podjednostki deacetylazy histonow HDAC1 i HDAC2. Kompleks typu Mi-2 ilustruje dobrze ogolna zasade koordynacji dzialania mechanizmow komorkowych, ktore nie funkcjonuja in vivo oddzielnie. Zwykle skutki jednego wzmacniaja lub znosza dzialanie drugiego i vice versa. (ryc. 8-10)

Kompleks preinicjacyjny w przypadku polimerazy, ktora syntetyzuje informacyjny RNA tworzy sie w regionie nici chromatynowej uprzednio rozluznionej przez dzialanie aktywatorow i koaktywatorow (ryc 8-12) a wiec majacej charakter miejsca HS. Kompleks ten, ktorego centralnym skladnikiem jest w przypadku transkrypcji genow kodujacych bialka RNA polimeraza II (RNAPII), zawiera szereg bazowych czynnikow transkrypcyjnych. Pierwszy z nich, TFIID, posiadajacy dwie podjednostki TBP (TATA box binding protein) i TAF (TBP Associated Factor), tworzy kompleks z DNA w miejscu kasety TATA. Kolejno dolaczaja inne czynniki bazowe TFIIA, B, E, F i H. Sekwencja aminokwasow w RNAPII od strony karboksylowej zawiera 52 powtorzenia sekwencji heptapeptydu TyrSerThrSerProSer (jest to domena CTD, carboxy terminal domain) ktora stanowi rodzaj platformy dla budowy kompleksu zaangazowanego w proces dojrzewania RNA. Dlugosc CTD oraz jego fosforylacja ma znaczenie dla aktywnosci enzymatycznej kompleksu. Fosforylacja ta ulega zmianie podczas transkrypcji.

Wkrotce po tym jak RNAPII inicjuje transkrypcje, powstajacy RNA jest modyfikowany przez dodanie czapeczki (ang. cap) na koncu 5'. Sluzy ona do ochrony RNA przed atakiem nukleolitycznym oraz jako miejsce wiazania bialek transportujacych dojrzaly RNA do cytoplazmy i jego translacje na polipeptyd. Proces ten jak sie okazalo, koordynuje wczesne etapy transkrypcji a w szczegolnosci przejscie od etapu inicjacji transkrypcji tzn. samego startu polimeryzacji do etapu elongacji tzn. wydluzania lancucha polinukleotydowego. Elongacja jest kontrolowana przez specjalne bialka "czynniki elongacyjne". W czasie tego procesu zachodzi czesto rowniez wycinanie intronow. Stwierdzono, ze luzna struktura promotora nie wystarcza dla uzyskania efektywnej transkrypcji. Zidentyfikowano specjalny czynnik, FACT (facilitates chromatin transcription), ktory ulatwia elongacje transkrypcji poprzez dysocjacje histonow H2A i H2B z chromatyny in vitro. Inny kompleks rozluzniajacy chromatyne poza promotorem zwany elongatorem ma funkcje HAT.

Gdy polimeraza dotrze do konca genu, transkrypcja zatrzymuje sie po napotkaniu sygnalu "terminacji". Lancuch polinukleotydowy zostaje wowczas przeciety i do jego konca 3' zostaje dodany odcinek poliA. Nowosyntetyzowane mRNA jest nastepnie transportowane przez otoczke jadrowa do cytoplazmy, gdzie ulega translacji. W eksporcie mRNA posrednicza bialka, ktore z jednej strony wiaza sie do mRNA a z drugiej oddzialywuja z bialkami porow w blonie jadrowej. Zlozonosc kazdego z tych etapow powoduje, ze badane sa one oddzielnie, co z kolei powoduje, ze tradycyjnie uwaza sie je za oddzielne niezwiazane z soba procesy. W ostatnich latach stalo sie jednak jasne, ze poszczegolne etapy ekspresji genow sa bardzo scisle powiazane i wplywaja jeden na drugi. Proces syntezy bialka przypomina produkcje na tasmie montazowej, gdzie element, ktory ulega przeksztalceniu na jednym etapie produkcji jest przekazywany jako substrat do nastepnego etapu w sposob ciagly, a czynniki bialkowe odpowiedzialne za kazdy z poszczegolnych etapow procesu sa funkcjonalnie a czasem i mechanicznie powiazane w kompleksy.

Metylacja zwiazana z procesem wygaszania aktywnosci transkrypcyjnej genow dotyczy nie tylko histonow ale rowniez i DNA (u ssakow metylacji ulega glownie dinukleotyd CpG, u roslin rowniez CpNpG). Te modyfikacje maja charakter epigenetyczny i sa dziedziczone z jednego pokolenia komorek na drugie.

U ssakow metylacja DNA zachodzi przy udziale dwoch klas metylotransferaz. Pierwsza z nich jest reprezentowana przez enzym, ktory metyluje glownie DNA juz metylowany w jednej nici powstajacy w procesie replikacji. Jest to metylotransferaza zachowawcza Dnmt1, (DNA methyltransferase 1) znajdujaca sie wiekszosci tkanek, ktorej zadaniem jest utrzymywanie wzoru metylacji w dzielacych sie komorkach organizmu. Metylotransferazy Dnmt3a i Dnmt3b znaleziono w komorkach wczesnego etapu rozwojowego. Maja one za zadanie metylowac DNA de novo. Metylacja DNA reguluje ekspresje genow na kilka roznych sposobow. Tak wiec niektore czynniki transkrypcyjne nie wiaza sie z DNA jesli ten jest metylowany. Inny sposob regulacji jest zwiazany z obecnoscia bialka MeCP2 (methyl CpG binding protein). Bialko to wiaze sie z metylowanym DNA, nastepnie rekrutuje HDAC oraz korepresor Sin3a (switch independent). Podobnie bialko MBD2 (zawierajace motyw "methyl-CpG-binding domain") wiaze sie z kompleksem remodelujacym chromatyne typu NuRD (nucleosome remodeling and histone deacetylase) zawierajacym bialko Mi-2 oraz HDAC. Kompleks NuRD ma za zadanie ulatwienie dostepu do chromatyny czynnikom powodujacym represje transkrypcji. Kompleksy MeCP2-Sin3a-HDAC (Ryc. 8-12) oraz MBD2-NuRD wyciszaja ekspresje genow przez utworzenie heterochromatyny zawierajacej deacetylowane histony i metylowany DNA. Metylacja DNA nie zawsze powoduje jednak wyciszanie ekspresji. Stwierdzono ze w niektorych przypadkach powoduje ona aktywacje ekspresji genu, jesli metylowana jest sekwencja rozpoznawana przez represor.

Metylacja DNA jest w pewnych przypadkach zwiazana funkcjonalnie z metylacja histonow. Stwierdzono, ze metylacja H3-K9 naogol towarzyszy wyciszaniu genu.. Wynika to z tego, ze histon H3 posiadajacy lizyne K9 metylowana w lancuchu bocznym rekrutuje bialko HP1, charakterystyczne dla heterochromatyny. Bialko to posiada chromodomene majaca powinowactwo do tak zmodyfikowanego ogona histonu. U Arabidopsis HP1 rekrutuje z kolei metylotransferaze Cmt3, ktora metyluje sekwencje CpNpG. Podobne zjawisko stwierdzono u Neurospora crassa. Nie jest jasne jak wplywaja na siebie metylacja H3-K9 i metylacja CpG w DNA u ssakow. Zwazywszy, ze zidentyfikowano u nich szereg metylotransferaz DNA, oddzialywania moga byc bardziej skomplikowane niz u Arabidopsis.

U drosofili, w regionach wyciszonej transkrypcji, heterochromatyna tworzy sie z udzialem bialek nazwanych PcG (polycomb group) zawierajacych chromodomene podobnie jak bialko HP1 u kregowcow. Sa one zdolne do polimeryzacji. U czlowieka rowniez znaleziono szereg bialek homologicznych do bialek PcG drosofili niektore z nich maja rowniez funkcje metylotransferazy histonowej. Podobnie jak u drosofili stwierdza sie ich zwiazek z heterochromatyna.

Izolatory. Izolatory sa to struktury rozgraniczajace funkcjonalnie domeny wlokna chromatynowego (Ryc. 8-13). Ich zadaniem jest ochraniac geny przed nieprawidlowymi sygnalami emanujacymi z otaczajacych segmentow wlokna. Rozroznic mozna dwa typy izolatorow : pierwszy znosi dzialanie wzmacniacza na promotor jesli znajduje sie pomiedzy nimi a drugi typ stanowi bariere uniemozliwiajaca postep procesu kondensacji chromatyny ktory ma czesto charakter "inwazyjny". Niektore izolatory posiadaja obydwie te funkcje.

U drozdzy w regionie HMR zidentyfikowano tRNA^Thr, ktory ma wlasnosci izolatora zatrzymujacego rozprzestrzenianie sie wygaszania ekspresji sasiadujacych genow przez bialka Sir. Bialka te powoduja heterochromatynizacje odcinka polozonego pomiedzy elementami sekwencji E i I flankujacymi HMR. Niezbedne dla aktywnosci izolujacej sa w tym przypadku czynniki transkrypcyjne TFIIIC i TFIIIB. Zarowno lewa jak i prawa granica regionu HMR posiadaja rowniez sekwencje wiazace kohezyny, co wskazuuje na to, ze odgrywaja one pewna role przy tworzeniu bariery. Element STAR (subtelomeric anti-silencing region) usytuowany pomiedzy subtelomerowymi sekwencjami X i Y rowniez ma wlasnosci izolatora uniemozliwiajacego rozprzestrzenianie sie heterochromatyny telomerowej w chromosomach drozdzy. Zawiera on wielokrotnie powtarzajace sie sekwencje rozpoznajace bialko o nieznanej funkcji Tbf1 i oraz inne rozpoznawane przez slaby aktywator transkrypcji Reb 1, obecny rowniez w wielu promotorach genow transkrybowanych przez polimeraze RNAPI i II oraz terminatorach polimerazy RNAPI.

U drosofili element Gypsy, ktory jest elementem powtarzajacym sie typu retrotranspozonu, zawiera elementy sekwencji rozpoznawane przez specyficzne bialko su(hw) (supressor of hairy wings). Bialko to oddzialywuje z bialkiem Mod(mdg4) tworzac funkcjonalny izolator.

W przypadku kregowcow aktywnosc izolatora jest czesto zwiazana z obecnoscia CTCF (CCCTC binding factor) oraz GAGA (bialka wiazacego sekwencje GAGA).

Ryc 8-1. Zintegrowany system regulacji ekspresji genow kodujacych bialka u eukariotow.

Ryc. 8-2. Wrazliwosc wlokna chromatynowego na trawienie DNaza I.

Ryc. 8-3 Struktura heterochromatyny w drozdzach. A. heterochromatyna telomeru, B. Heterochromatyna w regionie MAT.

Ryc. 8-4. Miejsca czule i hiperczule w genach kodujacych histony u drosofili.

Ryc. 8-5. Miejsca hiperczule w LCR czlowieka.

Ryc 8-6. Miejsca wiaznia GR w DNA zwiazanym z nukleosomem.

Ryc. 8-7. Modyfikacja chromatyny przez RAR/RXR. a) receptor kwasu retinowego poloczony z ligandem rekrutuje koaktywator CPB/p300 i PCAF (HAT), b) Receptor bez ligandu rekrutuje Sin3a, HDAC2 i HDAC3 powodojac heterochromatynizacje regionu i represje transkrypcji

Ryc. 8-8. Kod histonowy.

Ryc. 8-9 Kompleksy remodelujace chromatyne.

Ryc. 8-13. Izolator uniemozliwiajacy rozprzestrzenianie sie struktury heterochromatynowej.

niebieski kompleks - kohezyna, czerwony kompleks - kondensyna, mur - izolator.

140

131

Ryc. 8-10 Powstawanie transkrypcyjnie aktywnej domeny chromatynowej przez rekrutacje regulatorow, koregulatorow i czynnikow transkrypcyjnych bazowych.

Ryc 8-11. Powstawanie kompleksu preinicjacyjnego.

Ryc. 8-12. Powstawanie segmentu heterochromatyny z wykorzystaniem bialek MeCP2.

A.

B.

Fig. 8 - 14. Modyfikacje histonow a struktura chromatyny

---