LABORATORIUM SPECJALIZACYJNE Z TECHNOLOGII FERMENTACJI

SPRAWOZDANIE

ĆWICZENIE

TEMAT: Immobilizacja komórek drożdży na nośnikach ceramicznych

WYDZIAŁ: BIOTECHNOLOGII I NAUK O ŻYWIENIU CZŁOWIEKA

KIERUNEK: BIOTECHNOLOGIA

ROK AKADEMICKI: 2012/2013

IMIĘ I NAZWISKO	NUMER ALBUMU
Michał Orzechowski
Marta Cichoń

OCENA ZE SPRAWOZDANIA …………………

UWAGI PROWADZĄCEGO: …………………………………………….…..………………………………….………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

PODPIS ……………………

1. WSTĘP TEORETYCZNY

Immobilizacja drobnoustrojów może być naturalna lub celowo zaplanowana. Wśród metod unieruchamiania wyróżnia się wiązanie na powierzchni nośnika i wewnątrz matrycy lub bez użycia nośnika oraz blokowanie komórek między półprzepuszczalnymi membranami.

Istnieją duże możliwości przemysłowego wykorzystania immobilizowanych drobnoustrojów i biokatalizatorów, szczególnie do różnych biosyntez i biotransformacji w procesach ciągłych

i półciągłych.

Wśród wielu znanych technik unieruchamiania biokatalizatorów należy wyróżnić takie, które polegają na wiązaniu wewnątrz lub na powierzchni nośników nierozpuszczalnych, zamykaniu wewnątrz membran czy też unieruchamianiu bez udziału nośnika mechanicznego.

Wiązanie na powierzchni nośnika Dotyczy głównie takich drobnoustrojów, które wykazują naturalną skłonność osiadania i przylegania do powierzchni. W obrębie tej grupy metod wyróżnia się adsorpcję i wiązanie kowalencyjne komórek. Ważne jest wysokie powinowactwo komórek do nośnika zapobiegające nadmiernym stratom populacji, szczególnie podczas szybkiego przepływu strumienia substratu w bioreaktorze. Adsorpcja i adhezja polegają na unieruchamianiu komórek na powierzchni poprzez wiązania wodorowe, oddziaływania sił van der Waalsa, jonowe, hydrofobowe, elektrostatyczne, powinowactwa lub kombinacje różnych sił. Taki sposób immobilizacji jest bardzo prosty i tani, jednak ma podstawowe wady – stosunkowo niskie stężenie biomasy na jednostkę objętości bioreaktora oraz skłonność do desorpcji komórek w wyniku zmian pH, stężenia jonowego i innych czynników. Jako nośników używa się różnych materiałów: drewna, celulozy, jonitów, polimerów syntetycznych, szkła porowatego, spieków ceramicznych, tlenków metali, ziemi okrzemkowej i innych. Z kolei wiązanie kowalencyjne polega na utworzeniu chemicznych wiązań peptydowych, estrowych lub innych między nośnikiem i grupami funkcyjnymi ściany komórkowej drobnoustroju. Jako czynnik wiążący stosuje się aldehyd glutarowy, natomiast nośnikami są różne materiały (szkło, ceramika, karboksymetyloceluloza, akrylany i inne). Stosowane czynniki wiążące mogą jednak wywierać toksyczny wpływ na drobnoustroje. Stabilność tak unieruchomionych komórek jest zwykle wysoka i nie obserwuje się nadmiernych oporów dyfuzyjnych.

W metodach immobilizacji ważny jest właściwy dobór nośnika i techniki immobilizacji, ponieważ decydują one o aktywności unieruchomionego biokatalizatora oraz wydajności

procesu technologicznego. Uważa się, że dobry nośnik powinien wykazywać następujące cechy:

-obojętność w stosunku do zatrzymywanych mikroorganizmów,

-prostota i łagodność unieruchamiania,

-duża zdolność zatrzymywania komórek,

-wysoka mechaniczna stabilność,

-obojętność chemiczna,

-duża zdolność dyfuzyjna w stosunku do substratu i produktu,

-możliwość regeneracji i kilkakrotnego użycia,

-łatwa dostępność, niski koszt,

-możliwość zastosowania w skali przemysłowej.

Do unieruchamiania drożdży na powierzchni nośnika, powinno się używać materiał mikroporowaty, o średnicy porów co najmniej czterokrotnie większej niż średnica komórek.

Taka porowatość zapewnia normalny cykl życiowy drożdży (pączkowanie).

Zastosowanie komórek immobilizowanych stwarza korzyści technologiczne oraz ekonomiczne w porównaniu z tradycyjnymi procesami wykorzystującymi komórki wolne.

Do korzyści tych można zaliczyć:

-wydłużenie aktywności i stabilności biokatalizatora, ponieważ nośnik może działać ochronnie w przypadku zmian pH, temperatury i składu podłoża,
-zwiększenie gęstości komórek w przeliczeniu na jednostkę objętości fermentora, co prowadzi do wyższej produktywności, skrócenia czasu fermentacji oraz eliminacji fazy namnażania się komórek,
-lepsze wykorzystanie substratu, w związku z czym proces przebiega z wyższą wydajnością,
-możliwość prowadzenia procesów ciągłych,
-ograniczenie występowanie zakażeń mikrobiologicznych,
-obniżenie pracochłonności i kosztów procesu, ponieważ biokatalizator wykorzystywany jest przez długi okres czasu

Jednak w przypadku stosowania komórek immobilizowanych, obok zalet pojawiają się pewne problemy, które nie występują w układach z komórkami wolnymi. Do wad zaliczy można:

-zmiany metaboliczne wywołane unieruchomieniem i długotrwałym wykorzystaniem tych samych komórek,
-problemy ze skuteczną dyfuzją substratów i produktów,
-problemy z długotrwałą stabilnością nośnika,
-wymywanie komórek z nośnika.

Od wielu lat trwają prace nad możliwością szerszego wykorzystania komórek unieruchomionych w procesach technologicznych. Duży wzrost zainteresowania aplikacją takich systemów w różnych procesach biotechnologicznych, głównie w przemyśle spożywczym, wynika z korzyści, jakie można osiągnąć z użycia immobilizowanej biomasy. Największe szanse przemysłowego wykorzystania istnieją w procesach biosyntezy witamin, aminokwasów i kwasów organicznych, a szczególnie fermentacji etanolowej

2. CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest otrzymanie immobilizowanych drożdży browarniczych metodą wiązania na nośniku ceramicznym .

3. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

Immobilizowaniu zostały poddane komórki pochodzące ze stacjonarnej fazy wzrostu hodowli tlenowej.

3.1. Wykonano pomiar komórek drożdży w hodowli metodą mikroskopową z wykorzystaniem komory Thoma.

Średnia komórek w jednym kwadracie komory = 11,725 - a

Rozcieńczenie = 1 – n

L=4·10⁶· n · a L=4,69 · 10⁷

Zawiesina drożdży została przeniesiona do kolb z brzeczką niechmieloną i nośnikami w ilość 20 sztuk/kolba. Po inkubacji prowadzono dalsze analizy.

3.2. Fermentacja z udziałem immobilizowanych komórek drożdży

Fermentacja odbywała się z próbą nośników szamotowych umieszczonych w 50 ml chmielonej brzeczki.

3.3. Fermentacja z udziałem wolnych komórek drożdży.

Fermentacja 50 ml chmielonej brzeczki w dodatkiem zawiesiny drożdży w ilości 1,2·10⁷ kom/cm³

W celu uzyskania właściwego stężenia biomasy drożdży do brzeczki odwirowano 12,79 ml hodowli.

Obliczenie:

komórek

ml

4. Wyniki

1. Ocena procesu adhezji-barwienie immobilizowanych komórek błękitem metylenowym.

1. Bezpośredni pomiar liczby komórek immobilizowanych na nośnikach stałych.

c) Kontrola przebiegu procesu fermentacji

Obserwacja ubytku masy prób w odstępach 24h.

Dzień	Komorki im mobilizowane [g]	Komórki wolne [g]
1	222,7	160,4
2	222,44	160
3	222,24	159,88
6	221,36	156,64
7	221,02	156,36
8	220,38	156,06
9	219,52	155,66
10	219	155,42
13	217,9	154,38
14	217,76	154,26

Ekstrakt pozorny – 4,5° Blg

4. Wnioski

Wyniki uzyskane podczas ćwiczenia pozwalają stwierdzić, iż drożdże immobilizowane wykazują większą aktywność niż drożdże wolne. Wyraźnie widać to po wielkości ubytku masy prób. Próba z drożdżami immobilizowanymi gazowała o wiele szybciej. Ubyło blisko 5 g próby, wobec niecałych 2g ubytku dla drożdży wolnych. Widoczne było to również poprzez obserwacje makroskopowe- znacznie więcej wydzielanych pęcherzyków CO₂.

Zaletą tej metody jest łatwe oddzielenie drożdży immobilizowanych od próby po zakończeniu procesu, pozwala to wtedy na otrzymanie produktu o wysokiej czystości. Po oddzieleniu nośników od próby pozostała ona niemal całkowicie klarowna. Możliwe jest także wielokrotne wykorzystanie biokatalizatora. Stosowanie immobilizatorów pozwala na przyśpieszenie i polepszenie procesów w przemyśle spożywczym.