Metoda pozwala na otrzymanie dobrze oczyszczonego materiału. W pierwszej kolejności zachodzi liza komórek bakteryjnych, denaturacja białek, oraz DNA. W drugim etapie "pokomórkowy gruz" jest strącany, a w roztworze pozostają cząsteczki plazmidów. Metoda, podczas oddzielania DNA plazmidowego, wykorzystuje różnicę w zdolności do renaturacji plazmidów i chromosomu bakteryjnego. To pierwsze ulega szybkiej renaturacji po usunięciu czynnika denaturującego (w tym wypadku zneutralizowaniu alkalicznego pH) i jest to trzeci etap procedury. Otrzymany plazmid może być oczyszczany na przystosowanych do tego minikolumnach, lub precypitowany w alkoholu w celu przechowania.
Metoda jest szybka i prosta w wykonaniu, przez co stała się popularnym sposobem uzyskiwania oczyszczonego plazmidu z komórek bakteryjnych
1. Z szalki po transformacji pobrać sterylnie pojedyncze, białe kolonie i przenieść je indywidualnie do probówek
zawierających po 0,5 ml płynnej pożywki LB z ampicyliną (100μg/ml).
2. Hodowlę inkubować przez noc w +37oC.
3. Bakterie zwirować w mikrowirówce przez 2 min przy 8000 RPM. Usunąć pożywkę znad osadu bakterii.
4. Osad bardzo dokładnie zawiesić w 50 μl buforu GTE.
5. Do próby dodać 100μl roztworu denaturującego zawierającego 0,2M NaOH i 1%SDS. Roztwór denaturujący przygotować
bezpośrednio przed użyciem w osobnej probówce eppendorfa. Obliczyć, jakie ilości 4M NaOH i 20% SDS należy pobrać,
aby po rozcieńczeniu wodą uzyskać 1ml roztworu o właściwym stężeniu obu składników.
6. Denaturację DNA prowadzić do uzyskania klarownego roztworu, który powinien stać się kleisty na skutek denaturacji
DNA genoforowego.
7. Do całości dodać 75 μl 3M octanu potasu (pH 4,8) w celu renaturacji plazmidowego DNA.
8. Do mieszaniny dodać następnie 1 objętość chloroformu. Całość wytrząsać przez 5 minut.
9. Próbę wirować 10 min w celu oddzielenia wytrąconego DNA plazmidowego (faza wodna) od białek i DNA genoforowego
(faza dolna).
10. Fazę wodną przenieść do nowej probówki Eppendorfa. Kwasy nukleinowe wytrącić przez dodanie 1 objętości
izopropanolu.
11. Wytrącony DNA odwirować 10 min w mikrowirówce.
12. Supernatant bardzo ostrożnie usunąć a osad przepłukać 100 μl 75% etanolu i odwirować w mikrowirówce.
2
13. Po dokładnym usunięciu supernatantu osad osuszyć i rozpuścić w 20 μl buf. TE10/1. Dodać 2μl RNA-zy A o stężeniu
1mg/ml. Trawienie RNA prowadzić przez 10 min. w +37oC.
po izolacji DNA na żelu widac 3 formy cząsteczki plazmidu: formę CCC (superzwinietą) formę OC (kolistą) i liniową. Nie chcę cię wprowadzić w błąd w jakiej kolejności mogrują w żelu bo nie pamiętam ale CCC najszybciej.
pzdr
Podróża zależy od tego ile miejsca zajmuje coś na żelu: CCC jest najbardziej zwinięty: migruje najszybciej. OC jest lekko otwarty, więc wolniej. Najwolniej liniowy -- stawia największy opór
Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem. Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w póYnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane. Do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się w tym celu chloramfenikol, który selektywnie zapobiega replikacji chromosomu bakteryjnego.
We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:
- DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu,
- podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed circle).
Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie. Bakterie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany może być również lizozym - enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w pH<8.0). W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach. W przypadku otrzymywania plazmidowego DNA metodą termiczną, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i plazmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim pH.
Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim białek. Zwykle stosuje się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem i alkoholem izoamylowym. Białka można również usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie kwasu RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNazy), przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości (patrz, dalej). W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji, natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do renaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu.
Z odbiałczonych próbek DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego.
Wszystkie metody otrzymywania plazmidowego DNA, z wyjątkiem lizy alkalicznej, wymagają oddzielenia tego DNA od DNA genomowego w gradiencie chlorku cezu w obecności bromku etydyny. Wykorzystuje się tu fakt, że bromek etydyny intensywniej interkaluje do zdenaturowanego DNA genomowego niż do DNA plazmidowego, powodując częściowe rozwinięcie helisy DNA i wydłużenie cząsteczki, co powoduje zmniejszenie jej gęstości pławnej. Różnica w gęstości pomiędzy formą CCC a liniową i kolistą OC (ang. open circle) wynosi około 0.04 g/ml i jest wystarczająca do oddzielenia superzwiniętego DNA podczas wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu w obecności bromku etydyny. Pasmo superzwiniętego DNA układa się poniżej pasma utworzonego przez liniowe fragmenty chromosomowego DNA oraz formy liniowej i OC plazmidu. Cząsteczki RNA mają największą gęstość i zbierają się na dnie probówki wirowniczej, zaś białka pozostają w górnej warstwie roztworu.
Oczyszczanie plazmidowego DNA przeprowadzić można również metodą wirowania lizatów komórkowych w gradiencie alkalicznej sacharozy (w środowisku alkalicznym formy liniowe i OC ulegają rozdzieleniu na pojedyncze nici i sedymentują 3-4 razy wolniej niż niezdenaturowana superzwinięta forma CCC), stosując wymieniacze jonowe (np. kolumienki Qiagen) lub filtrację na żelach.
Otrzymywanie DNA plazmidowego na małą skalę (minilizaty)
Kolumny :
Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż
krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy ang. chaotropes, czyli ,,czyniące chaos'' są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych.
W zależności od skali, w jakiej przeprowadza się oczyszczanie, mogą to być tzw. minikolumny (rys. 1), w których przepływ roztworu przez membranę zawierającą złoża krzemionkowe uzyskuje się w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce, lub większe kolumny, w których roztwór przepływa grawitacyjnie. Złoża, przez które przechodzi roztwór, wychwytują specyficzne dla nich kwasy nukleinowe, tzn. DNA lub RNA, a pozostałe składniki roztworu, stanowiące zanieczyszczenie dla badanych prób, zostają zebrane w probówce znajdującej się poniżej filtra.
Transformacja - Pobranie przez komórki bakteryjne „nagiego” DNA ze środowiska. Komórki różnią się między sobą zdolnością do transformacji. Transformacja u wielu bakterii zachodzi samoistnie, co wpływa między innymi na rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki.
W procesie transformacji można wyróżnić 4 główne etapy:
- sorpcja DNA na powierzchni komórki bakteryjnej
- transport zasorbowanej cząsteczki do wnętrza komórki
- włączenie DNA do genomu
- fenotypowe procesy zewnętrznego wyrażania nowej cechy
Istnieje kilka metod transformacji:
- wykorzystanie naturalnej kompetencji niektórych komórek bakteryjnych (np. Bacillus, Mycobacterium)
- indukcja kompetencji (zastosowanie chlorku wapnia)
- protoplastyzacja komórek
- elektroporacja
Indukcja kompetencji metodą chemiczną - bakterie traktowane są zimnym roztworem CaCl2, a następnie szybko ogrzane pobierają DNA plazmidowy z otoczenia. Wydajność procesu transformacji zależy od:
- szczepu bakterii
- fazy wzrostu komórki
- metody nadającej kompetentność bakteriom
- ilości i wielkości DNA użytego do transformacji
- czasu inkubacji DNA z komórkami kompetentnymi.
Elektroporacja - metoda stosowana w transformacji drobnoustrojów, pozwalająca uzyskać zwiększoną przepuszczalność błon biologicznych poprzez działanie pola elektrycznego. Mieszaninę zawierającą DNA i komórki przeznaczone do transformacji poddaje się działaniu pola elektrycznego. Pod wpływem impulsu elektrycznego komórki pobierają DNA z roztworu.
Wysokie wartości transformacji można uzyskać poprzez zoptymalizowanie różnych parametrów:
- siła pola elektrycznego,
- długość impulsu elektrycznego,
- stężenie DNA.
Ważnymi czynnikami dla wydajności procesu transformacji są:
- czystość odczynników,
- stan komórek poddawanych transformacji,
- czystość wyrobów szklanych i plastikowych.
Biolistyka - termin wprowadzony przez J. Sanforda w 1988 roku , to inne określenie mikrowstrzeliwania wzięło się od zbitki słownej „biobalistyka” (biologia i balistyka). Theodore M. Klein, John C. Sanford to pionierzy biolistyki, którzy jako nośnika dla DNA wybrali wolfram – metal o dużej gęstości, charakteryzujący się dużą wytrzymałością (był wykorzystywany do produkcji pocisków przeciwpancernych).
Pierwszy raz wolframowe pociski opłaszczone plazmidowym DNA zawierające gen reporterowy z sekwencją kodującą acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT), wystrzelono w kierunku epidermalnej tkanki cebuli. Tak przygotowane pociski umieszczono w specjalnie do tego celu skonstruowanej „strzelbie”, która nadawała pociskom naddźwiękową prędkość. W ostrzelanej tkance cebuli można było zaobserwować przejściową ekspresję CAT. Jakiś czas po tym wydarzeniu pojawiły się głosy o wykorzystywaniu tej metody do transformacji bakterii, drożdży, roślin wyższych, zwierząt, a także kultur komórkowych i tkankowych. Świetnie spisuje się również w terapii genowej, a to wszystko świadczy o uniwersalności tej metody.
Metoda biolistyki jest stosowana głównie do transformacji genetycznej roślin uprawnych, a najczęściej są nimi zboża. Ta metoda przyczyniła się do komercjalizacji, a następnie wprowadzenia na rynek takich odmian transgenicznych roślin jak soja, która posiada odporność na owady i toleruje herbicydy. Tuż za soją na transgenicznym podium znalazła się kukurydza, określana jako „Bt-maize”. Skrót Bt pochodzi od Bacillus thuringiensis, bakterii która jest dawcą genu, którego produkt jest zabójczy dla gąsienic owadów roślinożernych.