1
IZOLACJA I RESTRYKCJA PLAZMIDOWEGO DNA
DNA plazmidowego wektora genetycznego może zostać wyizolowany z bakterii różnymi metodami. Wybór
odpowiedniej techniki zależy od tego, jaką ilości i czystości DNA zamierzamy uzyskać. Wspólną cechą większości technik
izolacji plazmidów jest sposób, w jaki następuje oddzielenie DNA genoforowego od DNA plazmidowego. W tym celu
wykorzystuje się fakt, że w lizacie bakteryjnym poddanym alkalicznej lub termicznej denaturacji a następnie renaturacji,
następuje wytrącenie DNA genoforowego wraz z białkami, podczas gdy zrenaturowane cząsteczki plazmidów pozostają w
roztworze. Różnice pomiędzy różnymi technikami, stosowanymi do izolacji plazmidów, dotyczą głównie tych etapów,
podczas których następuje oddzielenie plazmidowego DNA od białek, RNA i pozostałych składników lizatu. W tym celu
stosowane są następujące zabiegi:
1. Ekstrakcja fenolem i chloroformem. Oczyszczanie tą metodą stosuje się obecnie coraz rzadziej, ze względu na jej
czasochłonność i szkodliwość fenolu. Niskie koszty tych zabiegów sprawiają jednak, że ekstrakcję tego typu wciąż stosuje
się przy wykonywaniu tzw. minilizatów, czyli podczas jednoczesnej izolacji wielu preparatów DNA w małej skali.
Minilizaty wykonywane są głównie w celu identyfikacji stransformowanych klonów bakteryjnych.
2. Wirowanie w gradiencie chlorku cezu. Ze względu na dużą pracochłonność tej techniki, jak również z powodu dużych
kosztów wykorzystuje się ją tylko wtedy, gdy wymagana jest bardzo wysoka czystość plazmidowego DNA, np.
przygotowując wektor do transfekcji, czyli wprowadzenia do linii komórkowych.
3. Oczyszczenie na minikolumnach. W tym przypadku izolację przeprowadza się z wykorzystaniem niewielkich kolumienek,
w których DNA plazmidowy zostaje związane do membrany, podczas gdy pozostałe składniki lizatu zostają wypłukane
przy zastosowaniu odpowiednich buforów. Ponieważ technika ta umożliwia izolację DNA o stosunkowo wysokiej
czystości w bardzo krótkim czasie, obecnie zdobywa ona coraz większą popularność.
Izolacja plazmidowego DNA z klonów uzyskanych po transformacji
Technika przedstawiona w niniejszym ćwiczeniu stosowana jest do charakterystyki klonów uzyskanych po transformacji
bakterii. Ponieważ obejmuje ona tylko kilka prostych etapów, można ją wykorzystać do izolacji DNA z wielu klonów
jednocześnie. Do jej wykonania wymagana jest niewielka objętość hodowli co znacznie ułatwia ich przygotowanie.
Wydajność techniki i czystość uzyskanych preparatów są wystarczające do tego, by można je było poddać analizie
restrykcyjnej.
Sprzęt i odczynniki
− hodowle bakteryjne
− bufor GTE (50mM glukoza,
25mM Tris pH 8,0; 10mM
EDTA)
− NaOH 4M
− SDS 20%
− octan potasu 3M; pH4,8
− chloroform
− izopropanol
− etanol 75%
− buf TE
10/1
(10mM Tris, 1mM
EDTA)
− RNase A (1 mg/ml)
− H
2
O
− enzymy restrykcyjne
− buf. do enzymów
− sprzęt i odczynniki do
elektroforezy agarozowe
Procedura
1. Z szalki po transformacji pobrać sterylnie pojedyncze, białe kolonie i przenieść je indywidualnie do probówek
zawierających po 0,5 ml płynnej pożywki LB z ampicyliną (100
μg/ml).
2. Hodowlę inkubować przez noc w +37
o
C.
3. Bakterie zwirować w mikrowirówce przez 2 min przy 8000 RPM. Usunąć pożywkę znad osadu bakterii.
4. Osad bardzo dokładnie zawiesić w 50
μl buforu GTE.
5. Do próby dodać 100
μl roztworu denaturującego zawierającego 0,2M NaOH i 1%SDS. Roztwór denaturujący przygotować
bezpośrednio przed użyciem w osobnej probówce eppendorfa. Obliczyć, jakie ilości 4M NaOH i 20% SDS należy pobrać,
aby po rozcieńczeniu wodą uzyskać 1ml roztworu o właściwym stężeniu obu składników.
6. Denaturację DNA prowadzić do uzyskania klarownego roztworu, który powinien stać się kleisty na skutek denaturacji
DNA genoforowego.
7. Do całości dodać 75
μl 3M octanu potasu (pH 4,8) w celu renaturacji plazmidowego DNA.
8. Do mieszaniny dodać następnie 1 objętość chloroformu. Całość wytrząsać przez 5 minut.
9. Próbę wirować 10 min w celu oddzielenia wytrąconego DNA plazmidowego (faza wodna) od białek i DNA genoforowego
(faza dolna).
10. Fazę wodną przenieść do nowej probówki Eppendorfa. Kwasy nukleinowe wytrącić przez dodanie 1 objętości
izopropanolu.
11. Wytrącony DNA odwirować 10 min w mikrowirówce.
12. Supernatant bardzo ostrożnie usunąć a osad przepłukać 100
μl 75% etanolu i odwirować w mikrowirówce.
2
13. Po dokładnym usunięciu supernatantu osad osuszyć i rozpuścić w 20
μl buf. TE
10/1
. Dodać 2
μl RNA-zy A o stężeniu
1mg/ml. Trawienie RNA prowadzić przez 10 min. w +37
o
C.
14. DNA preparatów zawierających insert poddać analizie restrykcyjnej. Do reakcji należy użyć enzymy restrykcyjne, które
wycinają cały insert z wektora. Obliczyć ilości składników dla pojedynczej reakcji restrykcyjnej wg podanego poniżej
schematu. W przypadku, gdy przygotowywanych jest kilka reakcji restrykcyjnych, składniki powtarzające się we
wszystkich reakcjach, czyli H
2
O, bufor i enzym, powinny zostać przygotowane w postaci mieszaniny wspólnej dla
wszystkich prób, tzw. mix. Odpowiednia ilość mieszaniny powinna zostać następnie dodana do każdej z badanych prób
DNA.
DNA
buf
(10X do 1X)
H
2
O
(do 20
μl)
enzym 1
(2u z 10u/
μl)
enzym 2
(2u z 10u/
μl)
obj. na 1 reakcję
10
μl
obj. dla wszystkich reakcji, tzw. mix
-
obj. mix’u podana do 1 reakcji
-
15. Mieszaninę restrykcyjną inkubować minimum przez 1 godz., w temp. +37
o
C.
16. Preparaty nietrawione i po restrykcji nałożyć na 1% żel agarozowy. Na podstawie porównania migracji preparatów
nietrawionych wobec próby kontrolnej, nie zawierającej insertu, ustalić, która próba zawiera wbudowany insert. Na
podstawie preparatów trawionych obliczyć wielkość uzyskanych insertów.
ANALIZA RESTRYKCYJNA
Enzymy
restrykcyjne,
dzięki zdolności do rozpoznawania i przecinania specyficznych sekwencji DNA, należą do
podstawowych narzędzi inżynierii genetycznej. Fakt, że wiele z nich generuje specyficzne lepkie końce pomaga również w
łączeniu (ligacji) różnych fragmentów DNA. Wszystkie znane enzymy restrykcyjne zostały podzielone na trzy grupy. W
praktyce laboratoryjnej najczęściej stosowane są enzymy typu II. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych pochodzi od nazwy
bakterii, z której zostały wyizolowane. Np. Eco RI: Pierwsza litera – rodzaj (Escherichia), dwie następne – gatunek (coli),
duże litery - szczep lub typ (R), litery rzymskie - nr kolejny enzymu wyizolowanego z danego szczepu (I). Te enzymy
restrykcyjne, które pochodzą z różnych źródeł, lecz rozpoznają te same miejsca restrykcyjne nazywamy izoschizomerami.
Należy pamiętać o tym, że niektóre izoschizomery przecinają rozpoznawaną sekwencję w różnych miejscach generując różne
końce DNA, np.:
Sma I 5’CCCGGG
3’
Xma I 5’CCCGGG 3’
3’GGGCCC
5’
3’GGGCCC
5’
Enzymy restrykcyjne przechowywane są w buforach zawierających 50% glicerol, w temp. –20
0
C. W mieszaninach
reakcyjnych, zawierających glicerol w stężeniu przekraczającym 5%, u wielu enzymów restrykcyjnych może ujawnić się
aktywność niespecyficzna, tzw. „star aktywność”, objawiająca się przecinaniem DNA w miejscach nietypowych dla danego
enzymu. Z tego powodu do mieszaniny reakcyjnej należy dodać taką objętość enzymu, żeby stężenie glicerolu nie
przekraczało 5%. Podczas przygotowywania reakcji restrykcyjnej probówkę ze stężonym enzymem trzymać w lodzie i po
użyciu należy niezwłocznie przenieść ją do –20
o
C.
Ilość enzymu, jaką należy pobrać do reakcji oraz czas trwania reakcji, zależą od aktywności enzymu i ilości DNA
przeznaczonego do trawienia. Aktywność enzymu podawana jest w jednostkach enzymatycznych. Jedna jednostka (u) jest to
ilość enzymu niezbędna do pełnego strawienia 1
μg wzorcowego DNA, np. faga λ, w optymalnych warunkach, w ciągu jednej
godziny. Ponieważ dłużej przechowywane enzymy restrykcyjne stopniowo tracą aktywność, do reakcji można podać ilość
enzymu nieznacznie większą od ilość sugerowanej przez producenta.
Przeciętna długość fragmentów DNA uzyskanych po restrykcji zależy od wielkości motywu rozpoznawanego przez dany
enzym, np.: motyw 4 nukleotydowy występuje statystyczne raz na 256pz (4
4
), podczas gdy 6 nukleotydowy - 4096pz (4
6
).
Znajomość tego faktu ma znaczenie przy doborze enzymów do niektórych badań. Np. do badań polimorfizmu genomów
metodą RFLP, często używamy enzymy trawiące preparat w wielu miejscach, co zwiększa szansę na identyfikacją miejsca
restrykcyjnego które uległo modyfikacji w wyniku mutacji. Natomiast do klonowania długich fragmentów DNA, np. podczas
przygotowania biblioteki genetycznej, przydatne są enzymy trawiące DNA stosunkowo rzadko. Należy pamiętać o tym, że
DNA izolowany z tkanek eukariotycznych często zawiera grupy metylowe, uniemożliwiające pełne trawienie wszystkich
potencjalnych miejsc restrykcyjnych.
W niektórych przypadkach trawienie należy wykonać w takich warunkach, aby nie uzyskać pełnego strawienia preparatu
DNA, czyli tak, aby tylko część miejsc restrykcyjnych została przecięta (ang. partial digestion). Trawienie tego typu
wykonujemy np. przygotowując bibliotekę genomową, której klony powinny mieć długość znacznie większą, niż odległości
pomiędzy miejscami restrykcyjnymi występującymi w genomie. Aby to osiągnąć należy odpowiednio zaniżyć ilość enzymu
lub czas trawienia reakcji restrykcyjnej.
3
Bufory optymalne dla poszczególnych enzymów różnią się głównie rodzajem i stężeniem użytych soli (NaCl, KCl) oraz
pH. Szczegółowe informacje na temat wymagań konkretnych enzymów można znaleźć w katalogach firm, które je produkują.
W podanym poniżej przykładzie bufor A jest optymalny dla Eco RI, natomiast bufor B dla Hind III.
Enzym
Buf. A (100mM NaCl)
Buf. B (50mM NaCl)
Eco RI
100%
50%
Hind III
50%
100%
Informacje te są istotne jeżeli przygotowujemy reakcję, w której zamierzamy użyć kilku enzymów o różnych wymaganiach
buforowych. W tym przypadku reakcję należy zaplanować tak, by wszystkie enzymy wykazywały w niej tą samą aktywność.
Pomimo,
że temperatura optymalna dla aktywności większość enzymów wynosi +37
o
C, niektóre popularne enzymy
trawią DNA w innych temperaturach, np. SmaI w +30
o
C, Taq I w +65
o
C. Reakcje w wyższych temperaturach powinny być
przeprowadzane w warunkach uniemożliwiających parowanie mieszaniny restrykcyjnej, tzn. pod olejkiem parafilmowym lub
w termocyklerze z gorącym nakryciem.
Identyfikacja rozkładu miejsc restrykcyjnych.
Podczas
wielu
eksperymentów przygotowuje się mapy restrykcyjne badanego DNA, czyli identyfikuje się pozycje
wybranych miejsc restrykcyjnych. Ustalenia te są konieczne na przykład w celu subklonowania fragmentów DNA lub
poznania orientacji insertu w obrębie wektora. W przypadku, gdy znana jest pełna sekwencja insertu, do identyfikacji miejsc
restrykcyjnych wykorzystujemy programy komputerowe przeznaczone do analizy sekwencji DNA. W przypadku, gdy nie
znamy dokładnej sekwencji DNA, mapa restrykcyjna może zostać odczytana na podstawie wielości fragmentów DNA
uzyskanych po restrykcji i rozdziale elektroforetycznym. Do wykonania tego typu analizy konieczna jest również znajomość
miejsc restrykcyjnych obecnych w wektorze, do którego wklonowano badaną cząsteczkę. Dane o wektorach dostępne w
katalogach firm biotechnologicznych.
Przykład 1
Do wektora genetycznego (3000pz) w miejsce EcoRI wklonowano insert (600pz) zawierający miejsca restrykcyjne
przedstawione na schemacie. Jaką analizę restrykcyjną, tzn. przy użyciu jakiego enzymu, należy wykonać, aby ustalić
orientację wklonowanego insertu względem promotora znajdującego się w wektorze? Jakie będą wielkości fragmentów
restrykcyjnych dla poprawnej i niepoprawnej orientacji insertu?
wektor
3 kpz
prom.
EcoRI
BamHI
EcoRI
EcoRI
BamHI
insert
600pz
ORF
Przykład 2
Na schemacie przedstawiony jest wektor DNA, o wielkości 3000 pz, do którego wklonowano insert o wielkości 1000pz.
Klonowanie wykonano z użyciem miejsca restrykcyjnego Eco RI. Konstrukt ten trawiono restrykcyjnie w czterech różnych
reakcjach a uzyskane fragmenty restrykcyjne posiadały następujące wielkości:
1. Bam HI
3400, 600pz
2. Hind III
3300, 700pz
3. Pst I
3100, 500, 400pz
4. Bam HI, Pst I
3100, 400, 300, 200pz
W polilinkerze wektora, enzymy te rozpoznają zaznaczone na schemacie, unikatowe miejsca restrykcyjne. Na podstawie
powyższych informacji należy ustalić położenie poszczególnych miejsc restrykcyjnych w obrębie insertu.
Bam HI
Pst I
Eco RI
Eco RI
Hind III
100 pz
wektor
insert