Paulina Plesner 193333 01.04.2014

Joanna Ratajczyk 191837 08.04.2014

Gr. 6 wt. 13:15

LABORATORIUM Z INŻYNIERII GENETYCZNEJ

ĆWICZENIE NR IV

„Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue”

ĆWICZENIE NR V

„Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA wektora ekdysteroidowego ( EcRDBD/BamHI) przy użyciu ligazy T4. „

1. Cel ćwiczenia :

• ĆWICZENIE IV:

• Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue.

• ĆWICZENIE V:

• Przygotowanie komórek do ligacji wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA wektora ekdysteroidowego ( EcRDBD/BamHI) za pomocą ligazy T4.

• Transformacja komórek kompetentnych.

1. Protokół:

• ĆWICZENIE IV:

• 4 ml całonocnej hodowli bakteryjnej przeniosłyśmy szklaną pipetą do 60 ml świeżej pożywki płynnej LB ( tetracyklina o stężeniu końcowym 12,5 µg/ml w 250 ml w kolbie Erlenmajera ).

• Przeprowadziłyśmy inkubacje w temperaturze 37°C na wytrząsarce rotacyjnej przy 182 obr/min.

• Pobrałyśmy 2ml kultury bakteryjnej do szklanej kuwety i zmierzyłyśmy OD₆₀₀ względem odnośnika- czystego medium LB.

• Gdy OD ₆₀₀ osiągnęło wartość 0,502 zakończyliśmy inkubacje.

• Następnie przelałyśmy po 10 ml hodowli do 2 zimnych probówek o pojemności

50 ml.

• Po czym chłodziłyśmy je jeszcze przez ok.10 min. na lodzie.

• Probówki odwirowałyśmy w temp. 4°C przy 4500xg.

• Supernatant odrzuciłyśmy a osad bakterii w obu probówkach zawiesiłyśmy w 1,2 ml zimnego roztworu A .

• Po dokładnym zamieszaniu bakterii dodałyśmy jeszcze 2ml schłodzonego roztworu A
  (100 mM MgCl₂ ) i ponownie inkubowałyśmy przez 10min. na lodzie.

• Kolejny raz bakterie odwirowałyśmy w temp. 4 °C przez 10 min za pomocą wirówki Eppendorf 5810R, rotor F-34-6-38; 6,5x10³ obr/min.

• Supernatant odrzuciłyśmy a osad zawiesiłyśmy w 1,2 ml zimnego roztworu B, a następnie dodałyśmy jeszcze 2 ml zimnego roztworu B (100 mM CaCl₂).

• Próbkę inkubowałyśmy na lodzie przez 30 min. mieszając od czasu do czasu.

• Bakterie odwirowałyśmy przez 10 min. w temperaturze 4°C przy 4500xg.

• Następnie Supernatant odrzuciłyśmy a osad bakterii w każdej z probówek zawiesiłyśmy w 500µl zimnego roztworu C (100mM CaCl₂, 20% glicerol).

• Zawiesinę bakterii podzieliłyśmy po 110µl do umieszczonych na lodzie probówek Eppendorfa.

• Zawiesinę komórek w probówkach zamroziłyśmy w ciekłym azocie i przeniosłyśmy do schłodzonych pudełek .

• Przechowywałyśmy w temperaturze -80°C.

• ĆWICZENIE V:

1. Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA wektora ekdysteroidowego ( EcRDBD/BamHI) przy użyciu ligazy T4.

• Sporządziłyśmy mieszaninę ligacyjną poprzez zmieszanie w probówce Eppendorfa:

- 2 µl buforu dla ligazy T4,

- 25µl H₂Omili Q,

- 5 µl plazmidowego DNA ( pGEX-2T/BamHI) zlinearyzowanego enzymem BamHI,

- 2 µl insertu (EcRDBD/BamHI) trawionego tym samym enzymem restrykcyjnym ,

- 1 µl Ligazy T4

• W dalszej kolejności przygotowałyśmy próbkę kontrolną zawierającą:

- 5 µl plazmidowego DNA zlinearyzowanego enzymem BamHI (pGEX-2T/BamHI),

- 2µl buforu dla ligazy T4,

- 27 µl H₂Omili Q

- 1µl Ligazy T4.

• Przeprowadziłyśmy reakcje ligacji w temperaturze 20°C w czasie ok. 1h.

1. Transformacja komórek kompetentnych (Maniatis i wsp., 1989).

Rys.1 Transformacja komórek kompetentnych- Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Inżynierii genetycznej [2].

• 110µl zawiesiny komórek kompetentnych (XL1-Blue) rozmroziłyśmy na lodzie i 100 µl przeniosłyśmy do schłodzonej probówki Eppendorfa zawierającej mieszaninę po ligacji.

• Całość wymieszałyśmy i inkubowałyśmy na lodzie przez 20 min., a potem jeszcze przez 5 min. w temperaturze 37°C.

• Dodałyśmy 100µl pożywki płynnej LB.

• Ponownie inkubowałyśmy w temperaturze 37°C przez 20 min.

• Następnie 200µl zawiesiny transformowanych komórek wysiałyśmy na szalkę Petriego z podłożem LB-agar i za pomocą głaszczki dokładnie rozprowadziłyśmy i wygłaskałyśmy w podłożę.

• Pozostawiłyśmy tak wysiane płytki do inkubacji w temperaturze 37°C przez 12h.

1. Obliczenia :

C_DNA= 51,27 ng/µl

M _wektora = 4948· 640[g/mol]= 3166720 [g/mol]

M _DNA = 640 [g/mol]

3166720g – 1mol

20·10⁹ g - x

X wektora= 6,31 · 10 ^-15 mola

Insert : x wektora · 3 = 6,31· 10 ^-15 · 3 = 1,9 · 10^-14 mola

M _insertu = 306 · 640 g /mol = 195840 [g/mol]

1 mol – 195840 g

1,9· 10^-14 mola – x

X insertu = 3,7 ng= 3,7 · 10⁹ g ~4,0 ng

1. Wyniki :

Rys 2. Obraz płytki po ligacji i płytki kontrolnej z wyrosłymi koloniami transformantów .

• L _kol. ¹ - Liczba kolonii transformantów wyrosła na płytce po ligacji: 432

• L _kol. ² - Liczba kolonii transformantów wyrosła na płytce kontrolnej po ligacji: 0

• Stopień relegacji wektora:

$$S_{\text{relegacji}} = \frac{L_{\text{kol.}}^{2}}{L_{\text{kol.}}^{1}} \bullet 100\% = 100\lbrack\%\rbrack$$

1. Wnioski:

Podczas pierwszej części doświadczenia, przeprowadzonej w ćwiczeniu IV przygotowaliśmy komórki kompetentne XL1-Blue. Komórki te charakteryzują się zdolnością do przyjęcia obcego DNA. Proces przygotowania takich komórek polega na ich zamrożeniu i poddaniu szokowi cieplnemu w wysokiej temperaturze. Niska temperatura powoduje ,że błona jest bardziej przepuszczalna. Natomiast podwyższenie temperatury prowadzi do rozciągnięcie się błony i wówczas możliwe jest wejście DNA. Jednak na początku zawiesinę bakteryjną inkubowaliśmy i gdy bakterie znalazły się w odpowiedniej fazie co stwierdziliśmy na podstawie pomiaru OD₆₀₀ ( gęstości optycznej ), które dla naszych komórek wyniosło 0,502 ( OD₆₀₀ dla komórek kompetentnych 0,4-0,5) osad bakterii zawieszaliśmy w kolejnych buforach:

- bufor A – dostarcza jonów Mg²⁺

- bufor B – jonów Cl^-

- bufor C – jony Ca²⁺ oraz zawiera on glicerol , który zwiększa gęstość roztworu dzięki czemu białka bakteryjne i oddziaływania między nimi są bardziej stabilne. Zapobiega on również lizie.

Dostarczane wraz z buforami jony neutralizują ładunek błony pochodzący od szkieletu fosfocukrowego i fosfolipidów. Po zakończeniu procesu zawieszania osadu bakteryjnego w kolejnych buforach zamroziliśmy je w ciekłym azocie i przechowywaliśmy w - 80°C.

W drugiej części doświadczenia obejmującej ćwiczenie V przeprowadziliśmy ligacje czyli proces przyłączania molekuł DNA do siebie. Wykorzystany przez nas enzym ligacyjnym jest Ligaza T4 pochodząca z bakteriofaga. Ligaza T4 ma szerokie spectrum działania, ponieważ może łączyć DNA o tępych końcach, ale także wypełnia ona pojedyncze miejsca w których nie występują wiązania fosfodiestrowe ( ligacja końców lepkich). Obecność glicerolu w tym enzymie ligacyjnym zagęszcza roztwór i w ten sposób umożliwia tępym końcom zbliżenie się. Liniowy DNA ciężko przedostaje się do wnętrza komórki i brak insertu w kontroli powoduje powstawanie takiego liniowego DNA co z kolei wpływa na to ,że po inkubacji kolonie bakterii nie wyrastają na płytce kontrolnej. Tak też było w naszym przypadku. Natomiast na płytce ligacyjnej kolonie bakteryjne wyrastają, ponieważ dodany insert (EcRDBD/BamHI) spowodował, że DNA mogło swobodnie przechodzić i powstały komórki transformantów.

LITERATURA:

[1] Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Inżynierii genetycznej, „Przygotowanie komórek kompetentnych XL1-Blue (Cohen, 1972; Sambrook& Russell, 2001)” , Ćwiczenie nr IV, semestr letni 2014.

[2] Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z Inżynierii genetycznej, „ Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA wektora ekdysteroidowego ( EcRDBD/BamHI) przy użyciu ligazy T4.”, Ćwiczenie nr V, semestr letni 2014.

[3]