Joanna Malczak Analityka Medyczna III rok, gr.e

Białko C-jun

C-jun to nazwa genu i białka, które w połączeniu z c-Fos, tworzy AP-1 czynnik transkrypcyjny wczesnej odpowiedzi. Po raz pierwszy został zidentyfikowany jako białko wiążące Fos - p39 i dopiero później został na nowoodkryty jako produkt genu C-jun. Jest on aktywowany poprzez podwójną fosforylację na szlaku JNK, ale ma również funkcję niezależną od fosforylacji. Brak C-jun jest śmiertelny, ale zwierzęta transgeniczne z mutacją w genie c-Jun, która uniemożliwia fosforylację (zwana c-JunAA) mogą przetrwać.

Ostatnie badania przeprowadzano w celu oceny roli c-Jun w proliferacji i apoptozie błony śluzowej macicy w ciągu całego cyklu miesiączkowego. Wyniki sugerują, że cykliczna zmiana białka C-jun ma istotne znaczenie w proliferacji i apoptozie komórek nabłonka gruczołowego. Ciągła ekspresja białka C-jun może chronić komórki podścieliska przed wejściem w proces apoptozy podczas późnej fazy wydzielniczej cyklu.

Gen ten jest przypuszczalnie genem transformującym gen wirusa ptasiego mięsaka 17. Koduje on białko, które jest bardzo podobne do wirusowego białka, a to oddziałuje bezpośrednio ze specyficznymi sekwencjami DNA docelowych regulacji ekspresji genów. Gen ten nie ma intronów i jest umiejscowiony w 1p32-p31, regionie chromosomu odpowiedzialnym za translokacje i delecje, które prowadzą do występowania nowotworów u ludzi.

Interakcje

Wykazano, że białko C-jun oddziałuje z takimi białkami jak:

• białko Homeobox TGIF1

• ERG

• białko siatkówczaka (Retinoblastoma)

• białko wiążące CREB

• czynnik inicjacji transkrypcji 2

• kofaktor BRCA1

• BRCA1

• C-Fos

• NFE2L1

• DDX21

• NFE2L2

• białko wiążące sekwencję TATA

• RELA

• MAPK8

• RFWD2

• PIN1

• FOSL

• czynnik transkrypcyjny II B

• CSNK2A2

• kinaza kazeinowa 2

• receptor androgenowy

• STAT3

• ETS2

• ATF3

• NACA

• MyoD

• RUNX2

• RUNX1

Publikacja nr 1

“Identification and Characterization of a Novel Class of c-Jun N-terminal Kinase Inhibitors”

http://molpharm.aspetjournals.org/content/early/2012/03/20/mol.111.077446.long

W wysiłkach zmierzających do identyfikacji nowatorskich małych cząsteczek o właściwościach przeciwzapalnych, odkryto unikalną serię tetracyklicznych pochodnych, które hamowały lipopolisacharyd (LPS)- indukowany aktywacją NF-κB/AP-1. Związek IQ-1

okazał się silnym, nie-cytotoksycznym inhibitorem prozapalnych cytokin [interleukin (IL)-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α, interferon (IFN)-γ i GM-CSF] i produkcji tlenku azotu przez człowieka, a także mysich monocytów / makrofagów. Trzy dodatkowe silne inhibitory cytokin zostały zidentyfikowane poprzez dalsze badania przesiewowe analogów IQ-1.

Sól sodowa IQ-1 hamuje LPS indukowany TNF- α i produkcję IL-6 w komórkach MonoMac-6 z wartościami IC50 w granicach 0,25 i 0,61 μM odpowiednio. Badania przesiewowe 131 kinaz białkowych wykazały, że pochodna IQ-3 była specyficznym inhibitorem N-końca białka C-jun (JNK) rodziny kinaz, z preferencją dla JNK3. Ten związek, a także IQ-1, okazały się inhibitorami o wysokim powinowactwie JNK z nanomolarnym powinowactwo do wiązania i zdolnością do hamowania fosforylacji c-Jun.

Ponadto, badania wykazały, że interakcje wiązania wodoru z aktywnymi formami Asn152, Gln155 i Met149 z JNK3 odegrały ważną rolę w enzymatycznej aktywności wiązania. Wreszcie pokazano, że sól sodowa IQ-1 miała korzystną farmakokinetykę i hamowała owalbuminę indukowaną CD4 + limfocytów T odpowiedź immunologiczna w

mysiej nadwrażliwości typu późnego (DTH). Wniosek jest taki, że te związki z mogą służyć jako specyficzne małe cząsteczki modulatorów dla mechanistycznych badań nad JNK, jak również jako potencjalna droga do rozwoju leków przeciwzapalnych.

Oznaczanie enzymów kinetycznych JNK3

Enzymatyczna aktywność JNK3 była determinowana przez pomiar fosforylacji S-transferazy glutationowej aktywującej czynnik 2 inicjacji transkrypcji (GST-ATF2) przez RBC. Reakcje enzymatyczne były prowadzone w buforze zawierającym 25 mM Hepes w pH = 7.5, 2 mM ditiotreitol, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0.02% Brij35, 0.01 mM Na₃VO₄, 0.02 mg/ml BSA i 1% DMSO. Te oznaczenia zawierały 25 nM ludzkie rekombinowane pełnej długości JNK3, 5 μM ludzkie rekombinowaneGST-ATF2, nieradioaktywny ATP (10-100 μM) i ATP (γ-33). IQ-3 został dodany do mieszaniny przy użyciu akustycznej technologii i inkubowano go przez 20 min., aby mógł się związać z enzymem. Różne stężenia molowe ATP zostały dodane, by zainicjować reakcję, i aktywność była monitorowana co 5-15 min.

Western Blotting

Monocytowe komórki MonoMac-6 zostały wstępnie potraktowane różnymi stężeniami mieszaniny i obserwowane przez 30 min. Następnie podano LPS(200 ng/ml) i również czekano 30 min. Komórki przemyto dwukrotnie roztworem soli Hank, później powstały lizat został przygotowany przy użyciu buforu z JNK kinase assay kit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Lizaty komórek (od 5 x 106 komórek) został oddzielone w 10% SDS poliakrylamidowym żelu, przeniesione na nitrocelulozową membranę. Następnie przeprowadzono reakcję z przeciwciałami przeciwko c-Jun, fosfo-c-Jun(S63) i GAPD i użyciem peroksydazy chrzanowej połączonej z drugim przeciwciałem. Próbki były poddawane działaniu chemiluminescencyjnemu substratu i zwizualizowane przez FluorChem FC2 system obrazowania.

Ryc.1 Farmakologiczna inhibicja fosforylacji c-JUN. Western blotting.

Publikacja nr 2

„The function of heterodimeric AP-1 comprised of c-Jun and c-Fos in activin mediated Spemann organizer gene expression.”

Białko aktywujące -1 (AP-1) jest przekaźnikiem BMP lub FGR podczas embriogenezyXenopus. Jakkolwiek, specyficzna rola AP-1 w aktywowaniu sygnałów nie została wyjaśniona podczas rozwoju kręgowców. Nadekspresja heterodimerycznego AP-1 zawierającego c-Jun i c-Fos (AP-1-c-Jun/c-Fos) indukuje ekspresję BMP, który normalnie wykazuję dużą ekspresję przez dużą dawkę aktywiny. AP-1-c-Jun/c-Fos wzmacnia aktywację promotora w genach, ale obniża odpowiedź genu BMP4. Spadek funkcji jest demonstrowany, w ten sposób, że AP-1-c-Jun/c-Fos jest niezbędny do indukcji aktywiny i nerwowej ekspresji genów. Co więcej, fizyczna interakcja AP-1-c-Jun/c-Fos i Smad3 razem wzmacniają transkrypcyjną aktywność GSC poprzez celowe wiązanie się z jego promotorem. Mutanty Smad3 zawodzą w wiązaniu c-Jun.

Źródła:

• „The function of heterodimeric AP-1 comprised of c-Jun and c-Fos in activin mediated Spemann organizer gene expression.”

Lee SY, Yoon J, Lee HS, Hwang YS, Cha SW, Jeong CH, Kim JI, Park JB, Lee JY, Kim S, Park MJ, Dong Z, Kim J.

Department of Biochemistry, College of Medicine, Hallym University, ChunCheon, Kangwon-Do, Republic of Korea.

• “Identification and Characterization of a Novel Class of c-Jun N-terminal Kinase Inhibitors”

Igor A. Schepetkin, Liliya N. Kirpotina, Andrei I. Khlebnikov, Tracey S. Hanks, Irina Kochetkova, David W. Pascual, Mark A. Jutila, and Mark T. Quinn

Department of Immunology and Infectious Diseases, Montana State University, Bozeman, MT, USA (I.A.S., L.N.K., T.S.H., I.K., D.W.P., M.A.J., and M.T.Q.) and Department of Chemistry, Altai State Technical University, Barnaul, Russia (A.I.K.)