Część doświadczalna:

1. Przygotowanie emulsji oleju:

60 ml 2%-owego wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego zmieszaliśmy z 40 ml oleju słonecznikowego i homogenizowaliśmy przez 5 minut. Uzyskana emulsje stosowaliśmy jako substrat w reakcji.

1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i przeprowadzenie reakcji.

Przygotowaliśmy 3 erlenmayerki o pojemności 100 ml i wprowadziliśmy przygotowana w poprzednim punkcie substancji. Doświadczenie przeprowadzaliśmy uwzględniając podaną kolejność:

2 próby właściwe, czyli do dwóch erlenmayerek wprowadziliśmy:

• 5 ml emulsji,

• 4 ml buforu,

• 1 ml preparatu enzymatycznego.

Przygotowanie preparatu enzymatycznego:

Otrzymaną tabletkę Kreonu utarliśmy w moździeźu, następnie rozpuściliśmy proszek w 20 ml buforu amonowego o pH 7 i przesączyliśmy roztwór przez gazę.

Pierwszą próbę inkubowaliśmy 30 minut a drugą 60 minut w temperaturze 37°C. Po wyjęciu z inkubatora dodaliśmy 10 ml etanolu.

1 próba kontrolna, czyli do jednaj erlenmayerki wprowadziliśmy:

• 5 ml emulsji,

• 4 ml buforu,

• 10 ml etanolu,

• 1 ml preparatu enzymatycznego.

Tak przygotowane mieszaniny mieszaniny miareczkowaliśmy 0,05 M NaOH w obecności fenoloftaleiny (2-3 krople) do różowego zabarwienia. Wyniki doświadczenia zestawiliśmy w tabeli:

Tab.1 Objętości NaOH użyte do miareczkowania przygotowanych prób.

Substrat	Próba kontrolna [ml]	V30 [ml]	V60 [ml]	V30’ [ml]	V60’ [ml]
Olej kukurydziany	5,5	9,1	12,05	3,6	6,55
Olej ryżowy	5,3	10,4	10,9	5,1	5,6
Olej słonecznikowy	5,5	7,5	11	2	5,5
Olej z pestek winogron	4,6	9,9	12,5	4,8	7,9

Obliczam aktywność lipazy w 1 dm³ Kreonu (dla oleju słonecznikowego):

$$A = \ \frac{\Delta V*50*20}{1\ ml*t}$$

Gdzie:

ΔV- różnica objętości NaOH użyta do zmiareczkowania próby kontrolnej i preparatu lipazy;

50- współczynnik pozwalający przeliczyć 0,05M NaOH na μM kwasu tłuszczowego;

20- rozcieńczenie preparatu enzymatycznego w próbie

1ml- ilość preparatu lipazy

t- czas w minutach

Jeden U to ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu w czasie 1 minuty.

Dla próby inkubowanej 30 minut:

$$A = \ \frac{2*50*20}{1\ ml*30\ }$$

$$A = 66,67\lbrack\frac{U}{1kreon}\rbrack$$

Dla próby inkubowanej 60 minut:

$$A = \ \frac{5,5*50*20}{1\ ml*60}$$

$$A = 91,67\lbrack\frac{U}{1kreon}\rbrack$$

Tab.2 Zestawienie aktywności olejów inkubowanych w danych temperaturach.

Substrat	A30’ $\lbrack\frac{U}{1kreon}\rbrack$	A60’ $\lbrack\frac{U}{1kreon}\rbrack$
Olej kukurydziany	120	109,2
Olej ryżowy	170	93,3
Olej słonecznikowy	66,67	91,67
Olej z pestek winogron	176,7	131,7

Wnioski:

Z przeprowadzonego doświadczenia wynika, że aktywność lipazy zmniejsza się po upływie czasu. W próbie po upływie 60 minut aktywność lipazy jest mniejsza niż w próbie po upływie 30 minut (wyjątkiem jest olej słonecznikowy). Spowodowane jest to zmniejszeniem się pH (spowodowane jest to dodaniem roztworu NaOH) co obniża aktywność lipazy oraz tym ze wytworzyła się większa ilość produktu (kwasów tłuszczowych) po 60 minutach niż po 30. Ilość NaOH jaką zużyliśmy do zmiareczkowania jest proporcjonalna do powstałych w czasie enzymatycznie zhydrolizowanych tłuszczów. Najmniej podatnym olejem na hydrolizę tłuszczów jest olej słonecznikowy a najbardziej olej z pestek winogron.

1. Oznaczanie w preparacie z tabletki Kreon enzymów- α-amylazy i proteinazy:

Oznaczanie α-amylazy:

Do dwóch próbówek wprowadziliśmy po 5 ml 1% skrobi. Do pierwszej dodaliśmy kilka kropel przygotowanego wcześniej preparatu enzymatycznego (próba właściwa), o drugiej dodaliśmy kilka kropel wody destylowanej (próba kontrolna). Próbówki pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na 30 min. Po upływie wyznaczonego czasu dodaliśmy do próbówek po kilka kropel J₂ w KJ.

Obserwacje:

W próbówce z preparatem enzymatycznym nastąpiło całkowite odbarwienie, próba kontrolna zabarwiła się na granatowo.

Wnioski:

Odbarwienie próby właściwej świadczy o obecności α- amylazy w preparacie Kreon. α- amylaza powoduje hydrolizę skrobi, na krótsze fragmenty (dekstryny), co powoduje zniszczenie struktury helikalnej skrobi przez co wolny jod nie ma się gdzie zagnieździć. W próbie kontrolnej nie nastąpiła hydroliza skrobi ze względu na brak obecności α- amylazy, a wiec struktura skrobi nie została zniszczona i jod utworzył ze skrobią granatowy kompleks.

Oznaczanie proteinazy

Do dwóch próbówek wprowadziliśmy po 2 ml 2% kazeiny mleka. Do pierwszej próbówki (próby właściwej) dodaliśmy 1 ml preparatu enzymatycznego, do drugiej (próby kontrolnej) 1 ml wody. Obie próby pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po tym czasie dodaliśmy do obu próbówek 4ml 5% TCA.

Obserwacje:

W obu próbówkach wytrącił się biały osad, jednak w próbówce zawierającej enzym wytrąciło się go mniej.

Wnioski:

W próbie z enzymem nastąpiła hydroliza białka. TCA powoduje denaturacje białka. A więc w próbie właściwej w której znajdował się enzym osadu denaturowanego białka powstało mniej ponieważ część białka została zhydrolizowana do peptydów i aminokwasów. W próbie kontrolnej całe białko zostało denaturowane i wypadło z roztworu w postaci osadu. Świadczy to o obecności proteinazy w tabletce Kreon, która katalizuje hydrolizę białka.