Laboratorium biochemii

Amfoteryczny charakter białek i aminokwasów (ćw. I)

1. Cel ćwiczenia

• Wykonanie krzywych miareczkowania kwasu glutaminowego i glicyny,

• Określenie punktów izoelektrycznych, pK grup funkcyjnych i przedziałów buforowania tych aminokwasów,

• Wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazeiny.

1. Odczynniki

• 1M NaOH

• 1M HCl

• Wodny roztwór 0.1M glicyny

• Wodny roztwór 0.05M kwasu glutaminowego

• 1 M kwas octowy

• 0.1 M CH₃COONa zawierający kazeinę w końcowym stężeniu 0.2%

• Bufory wzorcowe do kalibracji pehametru o pH 4.01, 7.01, 9.18

1. Szkło i aparatura

• Probówki chemiczne na 20 ml i na 5 ml

• Pipety automatyczne oraz tipsy

• Pipety szklane

• Cylinder miarowy

• Zlewki o pojemności 50ml

• Mieszadło magnetyczne

• Mieszadełka magnetyczne małe i duże

• Pehametr laboratoryjny z elektrodą

1. Wykonanie ćwiczenia

1. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny

1. Wykalibrowano pehametr za pomocą buforów wzorcowych o pH 4.01, 7.01, 9.18, każdorazowo płucząc elektrodę wodą destylowaną,

2. Przygotowano 18 suchych probówek chemicznych oraz stoper,

3. W 9 ponumerowanych probówkach dużych przygotowano serię rozcieńczeń kwasu octowego wg schematu:

1 probówka: 13.6 ml H₂Odest + 6.4ml 1M CH₃COOH

2 probówka: 5.0ml H₂Odest + 5.0ml próbki 1

3 probówka : 5.0ml H₂Odest + 5.0ml próbki 2

(…)

9 probówka: 5.0ml H₂Odest + 5.0ml próbki 8

1. W pierwszej i ostatniej probówce wyrównano objętość do 5 ml,

2. Do 9 kolejnych małych probówek chemicznych odmierzono po 3ml przygotowanych rozcieńczeń kwasu octowego

3. Zmierzono pH każdego z roztworów, umieszczając elektrodę bezpośrednio w małych probówkach, odczytane wartości zanotowano w tabeli 1.,

4. Przelano roztwory z małych probówek do dużych,

5. Do każdego rozcieńczenia (1-9) dodano po 1 ml 0.2% roztworu kazeiny i włączono stoper,

6. Wymieszano mieszaniny,

7. Zbadano wygląd prób białka i zanotowano obserwacje,

8. Odstawiono próby kazeiny do intubacji w temperaturze pokojowej na 30min,

9. Wygląd prób ponownie zbadano i zanotowano obserwacje po czasie inkubacji.

1. Miareczkowanie kontrolne wody

1. Do czystej zlewki o pojemności 50 ml odmierzono 40 ml wody destylowanej,

2. Umieszczono w wodzie czyste mieszadełko magnetyczne,

3. Uruchomiono mieszanie,

4. Opłukano elektrodę wodą destylowaną i zanurzono ją w roztworze,

5. Do zlewki przelano 10ml titranta (HCl),

6. Porcjami dodawano 1 M HCl. Zmiany wartości pH roztworu i objętości dodawanego HCl zanotowano w tabeli 2.,

7. Dodawanie kwasu solnego zakończono po osiągnięciu pH= 1,52,

8. Analogicznie przeprowadzono miareczkowanie wody przez 1 M NaOH, kończąc po osiągnięciu pH = 12,75.

1. Miareczkowanie roztworów aminokwasów (analogicznie dla obu aminokwasów)

1. Do czystej zlewki odmierzono 40ml aminokwasu,

2. Umieszczono w roztworze czyste mieszadełko magnetyczne,

3. Uruchomiono mieszanie,

4. Opłukano elektrodę wodą destylowaną i zanurzono ją w roztworze,

5. Porcjami dodawano 1 M HCl. Zmiany wartości pH roztworu i objętości dodawanego HCl zanotowano w tabeli 3.,

6. Dodawanie kwasu solnego zakończono po osiągnięciu pH= 1,94 dla kwasu glutaminowego i pH= 2,01 dla glicyny

7. Analogicznie przeprowadzono miareczkowanie aminokwasów przez 1 M NaOH, kończąc po osiągnięciu pH = 12,38 dla kwasu glutaminowego i pH = 12,41 dla glicyny.

1. Tabele pomiarowe

Tabela 1. – wygląd prób kazeiny po upływie 30 min.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
pH	2,71	2,77	2,95	3,13	3,3	3,45	3,65	3,81	4,04
zmętnienie	­/-	+/+	+/+	+/++	++/++	+/++	-/+	­/-	­/-
osad	­/-	­/-	+/-	++/+	+/-	­-/-	­/-	­/-	­/-

Tabela 2. – Miareczkowanie kontrolne wody za pomocą kwasu i zasady

Lp	Vtitranta [ml]	pH
miareczkowanie kwasem
0	0,000	8,16
1	0,005	3,99
2	0,010	3,63
3	0,015	3,44
4	0,025	3,18
5	0,035	3,03
6	0,085	2,64
7	0,135	2,47
8	0,185	2,34
9	0,285	2,17
10	0,385	2,03
11	0,485	1,94
12	0,585	1,85
13	0,685	1,78
14	0,785	1,73
15	0,885	1,68
16	0,985	1,65
17	1,085	1,62
18	1,185	1,58
19	1,285	1,55
20	1,385	1,52

Lp	Vtitranta [ml]	pH
miareczkowanie zasadą
0	0,000	4,05
1	0,005	8,81
2	0,010	9,73
3	0,015	10,22
4	0,020	10,60
5	0,025	10,72
6	0,035	10,89
7	0,045	10,99
8	0,055	11,08
9	0,105	11,34
10	0,155	11,49
11	0,205	11,60
12	0,305	11,71
13	0,505	11,92
14	0,705	12,05
15	0,905	12,14
16	1,205	12,22
17	1,505	12,29
18	2,005	12,36
19	2,505	12,41
20	3,105	12,47
21	4,105	12,52
22	5,105	12,56
23	6,105	12,60
24	8,105	12,65
25	9,105	12,67
26	11,105	12,70
27	14,105	12,75

Tabela 3.

Lp	pH	Vtitranta [ml]	V H2O titranta [ml]	V aa titranta [ml]	ntitr [mmol]	ntit/naa
glicyna - miareczkowanie kwasem
0	5,92	0	0,0000	0,0000	0,0000	0,0000
1	5,42	0,005	0,0000	0,0050	0,0050	0,0013
2	5,02	0,010	0,0000	0,0100	0,0100	0,0025
3	4,8	0,015	0,0000	0,0150	0,0150	0,0038
4	4,64	0,020	0,0000	0,0200	0,0200	0,0050
5	4,53	0,025	0,0000	0,0250	0,0250	0,0063
6	4,36	0,035	0,0000	0,0350	0,0350	0,0088
7	4,23	0,045	0,0000	0,0450	0,0450	0,0113
8	4,14	0,055	0,0000	0,0550	0,0550	0,0138
9	3,83	0,105	0,0075	0,0975	0,0975	0,0244
10	3,68	0,155	0,0090	0,1460	0,1460	0,0365
11	3,54	0,205	0,0125	0,1925	0,1925	0,0481
12	3,34	0,305	0,0200	0,2850	0,2850	0,0713
13	3,26	0,405	0,0200	0,3850	0,3850	0,0963
14	3,02	0,605	0,0350	0,5700	0,5700	0,1425
15	2,85	0,805	0,0500	0,7550	0,7550	0,1888
16	2,73	1,005	0,0600	0,9450	0,9450	0,2363
17	2,63	1,205	0,0850	1,1200	1,1200	0,2800
18	2,47	1,505	0,1350	1,3700	1,3700	0,3425
19	2,35	1,805	0,1850	1,6200	1,6200	0,4050
20	2,22	2,105	0,2350	1,8700	1,8700	0,4675
21	2,11	2,405	0,3350	2,0700	2,0700	0,5175
22	2,01	2,705	0,3850	2,3200	2,3200	0,5800
glicyna - miareczkowanie zasadą
0	6,5	0	0	0,0000	0,000	0,0000
1	6,75	0,005	0	0,0050	0,005	0,0013
2	7,01	0,010	0	0,0100	0,010	0,0025
3	7,24	0,015	0	0,0150	0,015	0,0038
4	7,45	0,025	0	0,0250	0,025	0,0063
5	7,58	0,035	0	0,0350	0,035	0,0088
6	7,86	0,085	0	0,0850	0,085	0,0213
7	8,06	0,135	0	0,1350	0,135	0,0338
8	8,19	0,185	0	0,1850	0,185	0,0463
9	8,33	0,285	0	0,2850	0,285	0,0713
10	8,46	0,385	0	0,3850	0,385	0,0963
11	8,75	0,585	0	0,5850	0,585	0,1463
12	8,94	0,785	0,0050	0,7800	0,780	0,1950
13	9,10	0,985	0,0050	0,9800	0,980	0,2450
14	9,28	1,285	0,0075	1,2775	1,278	0,3194
15	9,44	1,585	0,0080	1,5770	1,577	0,3943
16	9,58	1,885	0,0090	1,8760	1,876	0,4690
17	9,79	2,285	0,0100	2,2750	2,275	0,5688
18	10,01	2,685	0,0125	2,6725	2,673	0,6681
19	10,29	3,085	0,0150	3,0700	3,070	0,7675
20	10,84	3,485	0,0350	3,4500	3,450	0,8625
21	11,42	3,785	0,1300	3,6550	3,655	0,9138
22	11,48	3,885	0,1550	3,7300	3,730	0,9325
23	11,64	4,085	0,2525	3,8325	3,833	0,9581
24	11,76	4,285	0,3050	3,9800	3,980	0,9950
25	11,86	4,585	0,4050	4,1800	4,180	1,0450
26	11,95	4,885	0,5050	4,3800	4,380	1,0950
27	12,04	5,485	0,7050	4,7800	4,780	1,1950
28	12,10	5,985	0,8050	5,1800	5,180	1,2950
29	12,18	6,985	1,0550	5,9300	5,930	1,4825
30	12,24	7,985	1,2050	6,7800	6,780	1,6950
31	12,28	8,985	1,5050	7,4800	7,480	1,8700
32	12,33	10,985	1,7550	9,2300	9,230	2,3075
33	12,37	12,985	2,0050	10,9800	10,980	2,7450
34	12,41	14,985	2,5050	12,4800	12,480	3,1200

kwas glutaminowy - miareczkowanie kwasem
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
kwas glutaminowy - miareczkowanie zasadą
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

1. Obliczenia

• Obliczanie objętości titranta zużytej do zmiareczkowania cząsteczek aminokwasu (analogiczne dla obu aminokwasów, miareczkowanie zarówno kwasem jak i zasadą),

V_{aa titranta} =  V_titranta −  V_{H2O titranta}

• Obliczanie liczności titranta zużytej do zmiareczkowania cząsteczek aminokwasu (analogiczne dla obu aminokwasów, miareczkowanie zarówno kwasem jak i zasadą),

n_titranta =  C_NaOH/HCl •  V_{aa titranta} gdzie: C_NaOH/HCl = 1M

• Obliczanie liczności aminokwasu w roztworze

Glicyna: n_aa =  C_GLY • V_GLY = 0.1 • 40 = 4 [mmol]

Kwas Glutaminowy: n_aa =  C_GLU • V_GLU = 0.05 • 40 = 2 [mmol]

• Obliczanie liczności cząsteczek titranta przypadających na liczność aminokwasu (analogiczne dla obu aminokwasów, miareczkowanie zarówno kwasem jak i zasadą),

$$\frac{n_{\text{titranta}}}{n_{\text{aa}}}$$

Obliczanie pI, pK grup funkcyjnych oraz przedziałów buforowania dla glicyny:

Z modelu krzywej miareczkowania odczytujemy, że pK₁ jest równe wartości pH, w którym stosunek n_kwasu/n_aa jest równe -0,5, zaś pK₂ równe wartości pH, w którym stosunek n_zasady/n_aa jest równe 0,5.

$$\text{pK}_{1} = pH - log\frac{\left\lbrack \text{II} \right\rbrack}{\lbrack I\rbrack}\text{\ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ pK}_{2} = pH - log\frac{\left\lbrack \text{III} \right\rbrack}{\lbrack\text{II}\rbrack}\backslash n$$

Wyniki poprane z tabeli 3.:

n_kwasu/n_aa = - 0,5175 ≈ - 0,5 ↔ pH = 2,11

n_zasady/n_aa = 0,4690 ≈ 0,5 ↔ pH = 9,58

przedział buforowania, to pK ± 0,5

• Obliczanie właściwego pI glicyny:

$$pI = \frac{\text{pK}_{1} + \text{pK}_{2}}{2} = \frac{2,11 + 9,58}{2} = 5,845$$

Obliczanie pI, pK grup funkcyjnych oraz przedziałów buforowania dla kwasu glutaminowego:

Z modelu krzywej miareczkowania odczytujemy, że pK₁ jest równe wartości pH, w którym stosunek n_kwasu/n_aa jest równe -0,(3), pK₂ równe wartości pH, w którym stosunek n_zasady/n_aa jest równe 0,(3), zaś pK₃ równe wartości pH, w którym stosunek n_zasady/n_aa jest równy 1.

$\text{pK}_{1} = pH - log\frac{\left\lbrack \text{II} \right\rbrack}{\lbrack I\rbrack}$, $\text{pK}_{2} = pH - log\frac{\left\lbrack \text{III} \right\rbrack}{\lbrack\text{II}\rbrack},$ $\text{pK}_{3} = pH - log\frac{\left\lbrack \text{IV} \right\rbrack}{\lbrack III\rbrack}$

Wyniki poprane z tabeli 3.:

n_kwasu/n_aa = - 0,3225 ≈ - 0,(3) ↔ pH = 2,3

n_zasady/n_aa = 0,3600 ≈ 0,(3) ↔ pH = 3,81

n_zasady/n_aa = 1,0100 ≈ 1 ↔ pH = 8,63

przedział buforowania, to pK ± 0,5

• Obliczanie właściwego pI kwasu asparaginowego:

$$pI = \frac{\text{pK}_{1} + \text{pK}_{3}}{2} = \frac{2,3 + 8,63}{2} = 5,465$$

1. Analiza wyników i wnioski

Wykres 1. – Miareczkowanie wody za pomocą kwasu i zasady

Wykres 2. – krzywe miareczkowanie aminokwasów za pomocą kwasu i zasady

Tabela 4. – porównanie wyznaczonych pK i pI z danymi teoretycznymi

Aminokwas	Wartość obliczona	Wartość literaturowa	Przedział buforowania
Glicyna	pI	5,845	6,06
	pK1	2,110	2,35
	pK2	9,580	9,78
Kwas glutaminowy	pI	5,465	5,65
	pK1	2,300	2,20
	pK2	3,810	4,30
	pK3	8,630	9,10

• Zaobserwowano, że glicyna ma jedynie dwie grupy podlegające jonizacji - grupę α-aminową oraz α-karboksylową, zaś kwas glutaminowy, dodatkowo posiada trzecią – β-karboksylową,

• pK grup α-aminowych przyjmują najwyższe wartości, zaś pK grup α-karboksylowych najniższe. pK₂ kwasu glutaminowego dotyczy łańcucha bocznego i przyjmuje wartości bliskie pK grup α-karboksylowych,

• Na podstawie doświadczenia stwierdzić można, że aminokwasy, a co za tym idzie i białka posiadają charakter amfoteryczny. W praktyce oznacza to, że w zależności od zjonizowania aminokwasy reagują jako słabe kwasy lub jako słabe zasady,

• Przedziały buforowania ± 0,5 pK to miejsca, w których dodawania titranta nie powoduje znaczących zmian pH,

• Dane doświadczalne nie odbiegają znacząco od literaturowych. Odchylenia spowodowane mogą być niedokładnym oraz zbyt szybkim miareczkowaniem,

• Roztwór kazeiny o największym stopniu zmętnienia i osadu to roztwór 4 o pH = 3,13. Wynika z tego, iż pI kazeiny wynosi 3,13. Dane literaturowe wskazują, że pI kazeiny wynosi ok. 4,7. Rozbieżność wyniku doświadczalnego od literaturowego spowodowana może być niedokładnym rozcieńczeniem kwasu octowego oraz złym porównaniem ilości zmętnienia i osadu w próbkach,

• Wszystkie cele doświadczenia zostały zrealizowane.