Laboratorium biochemii

Profil Topnienia DNA (ćw K.)

1. Cel ćwiczenia

• Wykreślenie profilu topnienia roztworu kwasu dezoksyrybonukleinowego z grasicy cielęcej,

• Wyznaczanie temperatury topnienia i przedziału temperaturowego denaturacji badanej próbki DNA, stopnia przeprowadzonej denaturacji DNA oraz hipochromizmu punktowego.

1. Odczynniki

• Roztwór SSC pH=7,0 (15mM NaCl, 1,5mM cytrynian sodu),

• Próbka kwasu dezoksyrybonukleinowego – roztwór DNA w SSC,

• Olej parafinowy.

1. Szkło i aparatura

• Pipety automatyczne oraz tipsy,

• Kuwety plastikowe,

• Kuwety kwarcowe,

• Spektrofotometr z termostatującą przystawką i mieszadłem magnetycznym,

• Termostat,

• Mieszadełko magnetyczne.

1. Wykonanie ćwiczenia

• Do dwóch kuwet kwarcowych dodano po 3 ml 0,1 M roztworu SSC i wyzerowano spektrofotometr względem tych roztworów,

• Z kuwety „próbka” wylano roztwór SSC, następnie dodano 3 ml otrzymanego roztworu DNA wyizolowanego z grasicy cielęcej z ćwiczenia J,

• Zmierzono absorbancję roztworu DNA przy długości fali 260 nm oraz 280 nm, wyniki zamieszczono w Tabeli 1.,

• Na powierzchnię roztworu w obu kuwetach ostrożnie nawarstwiono olej parafinowy,

• Rozpoczęto ogrzewanie próbek w spektrofotometrze,

1. Obliczenia i wyniki

A 260	A 280	CDNA [mg/ml]	Czystość DNA
0,7505	0,4135	0,037525	1,81

Tabela 1. – absorbancja natywnej formy DNA

• Obliczanie stężenia badanego DNA:

$C_{\text{DNA}} = 0,05\ \bullet \ A_{260} = 0,037525\ \lbrack\frac{\text{mg}}{\text{ml}}\rbrack$

• Obliczanie czystości DNA:

$$\frac{A_{260}}{A_{280}} = \ \frac{0,7505}{0,4135} = 1,81$$

• Obliczanie wartości ΔA₂₆₀ dla każdego kroku denaturacji (obliczenia na kroku 1. pozostałe analogicznie):

A₂₆₀ =  A₂₆₀ − A₂₆₀^RT,   gdzie: A₂₆₀ = absorbancja roztworu DNA w danej temperaturze λ = 260 nm 

A₂₆₀^RT = absorbancja natywnej formy DNA w temp pokojowej 

A₂₆₀= 0,756169 - 0,7505 = 0,005669

• Obliczanie średniej absorbancji roztworu DNA w kolejnych krokach denaturacji (obliczenia na kroku 1. pozostałe analogicznie):

A₂₆₀^T_sr = |A₂₆₀^T_n−A₂₆₀^T_n + 1|,      gdzie n − krok denaturacji

A₂₆₀^T_sr = |0,01472−0,01544| =  0, 00071

• Obliczanie zmiany absorbancji A₂₆₀^T_sr jaka przypada na zmianę temperatury roztworu DNA ΔT (obliczenia na kroku 1. pozostałe analogicznie):

$$\frac{A_{260}^{T_{sr}}}{T} = \ \frac{0,00071}{2} = 0,000355\ \lbrack\frac{1}{}\rbrack$$

Lp.	T [ºC]	A260	Δ A260	Tśr [ºC]	A260^Tsr	$\frac{A_{260}^{T_{sr}}}{T}$ $\lbrack\frac{1}{}\rbrack$
1	60	0,76522	0,01472	61	0,00071	0,000356
2	62	0,76594	0,01544
3	64	0,76804	0,01754	65	0,00190	0,000948
4	66	0,76994	0,01944
5	68	0,77616	0,02566	69	0,01601	0,008006
6	70	0,79217	0,04167
7	72	0,82164	0,07114	73	0,03791	0,018953
8	74	0,85954	0,10904
9	76	0,90035	0,14985	77	0,02955	0,014776
10	78	0,92990	0,17940
11	80	0,95719	0,20669	81	0,01717	0,008582
12	82	0,97436	0,22386
13	84	0,98991	0,23941	85	0,00664	0,003319
14	86	0,99655	0,24605
15	88	1,00148	0,25098	89	0,00217	0,001085
16	90	1,00365	0,25315
17	92	1,00374	0,25324	93	0,00068	0,00034
18	94	1,00306	0,25256

Tabela 2.

Wykres 1.

Wykres 2.

Wykres 3.

• Wyznaczanie temperatury topnienia DNA T_m (temperatura, w której połowa cząsteczek uległa denaturacji):

T_m = 78 ºC

• Wyznaczanie wartości absorbancji po denaturacji (absorbancja przy najwyższej temperaturze):

ΔT_kłębek=94,0911 ºC

A₂₆₀^klebka = 1,00306

• Wyznaczanie wartości absorbancji po renaturacji (ostatnia absorbancja pomiarów):

A₂₆₀^Rn =  0,901257

• Wyznaczanie wartości absorbancji w stanie natywnym (temperatura, w której nie nastąpiła denaturacja):

ΔT_spirala = 60,0377 ºC

A₂₆₀^spirali =  0,76522

• Obliczanie szerokości przejścia formy dwuniciowej do jednoniciowej:

T_{spirala → klebek}= 94,0911 ºC - 60,0377 ºC = 34,0534 ºC

• Obliczanie procentowej wielkości przeprowadzonej renaturacji Rn roztworu DNA:

$Rn = \ \frac{A_{260}^{klebka} - \ A_{260}^{\text{Rn}}}{A_{260}^{klebka} - A_{260}^{\text{spirali}}}\ \bullet 100\% = \ \frac{1,00306 - 0,901257}{1,00306 - 0,76522} \bullet 100\% =$42,80386 %

• Obliczanie hipochromizmu punktowego H₂₆₀ :

$H_{260} = 1 - \frac{A_{260}^{\text{spirali}}}{A_{260}^{klebka}} = 1 - \ \frac{0,76522}{1,00306} = \ $0,23711

1. Analiza wyników i wnioski

• Wykres 1. oraz 2. pokazuje przebieg denaturacji podczas ogrzewania próbek oraz denaturacji podczas chłodzenia DNA,

• Ćwiczenie udowadnia, że wraz ze wzrostem temperatury następuje rozplecenie podwójnej helisy, przez co rośnie jej absorbancja,

• Wyznaczono temperaturę topnienia Tm=78⁰C, czyli temperaturę, w której połowa helisy uległa rozpleceniu,

• Obserwuje się ponowne splecenie nici podczas ochładzania roztworu, pokazuje to spadek absorbancji,

• Określono czystość DNA wynoszącą 1,81, co wskazuje na dobrą czystość preparatu,

• Wykreślono profil topnienia DNA (Wykres 3.). Różnica temperatur przejścia DNA z formy dwuniciowej do jednoniciowej wynosi 34,0534⁰C.

• Wyznaczono stopień przeprowadzonej renaturacji, wynoszący 42,80% po czym wnioskować można, że badane DNA posiada sekwencje unikatowe,

• Obliczono hiperchromizm punktowy wynoszący 0,24.

• Wszystkie cele doświadczenia zostały zrealizowane.