Określanie stężenia DNA za pomocą Invitrogen™ Qubit®

Zestaw składa się z następujących elementów:

Fluorometr Qubit® bufor

Odczynnik fluorescencyjny na bazie EtBr)

Dwa standardy do kalibracji RT-PCR

(czerwony i żółty)

Przygotowanie buforu do pomiaru:

199ul (bufor) + 1ul (odczynnik EtBr) = 200ul

Przygotowanie próby:

Warto co jakiś czas zrobić kalibrację metody:

• „0” DNA 190 ul(bufor z EtBr) + 10 ul DNA (0 ng – prawdopodobnie sam TE)

• Próba 100 ng DNA 190 ul (bufor z EtBr) + 10 ul DNA (100 ng)

Przykładowe postępowanie:

• Próba X – 199 ul (bufor z EtBr) + 1ul DNA (o szukanym stężeniu). Czekamy 2 minuty na prawidłowe związanie się barwnika z DNA

• Włączamy urządzenie. Wybieramy opcję „dsDNA” i umieszczamy próbę w urządzeniu.

• Naciskamy przycisk „GO”. Pojawi się wynik:

Wynik = 0,238 ug/mL

Czyli 0,238 ug/mL = ng/uL

• Wybieramy opcję „calculate sample concentration”

• Wybieramy ilość DNA jaką dodaliśmy do próby

1ul DNA

• Komputer przeliczy tą ilość na ng/ml:

DNA sample = 47,6 ng/mL

Te dane wykorzystujemy do metodyki (np. PCR). Gdy żądane stężenie matrycy wynosi np. 10 ng, korzystamy z proporcji:

1 ul ------------------------ 47,6 ng/mL

X ------------------------ 10 ng/mL

Skrócony sposób przeprowadzenia doświadczenia: