Obliczenia stężenia

DNA i RNA w

wyizolowanej próbie na

podstawie pomiaru

spektofotometrycznego

Spektrofotometria, jest to technika

pomiarowa polegająca na ilościowym
pomiarze transmisji lub odbicia
światła przez próbkę.

Po skończonej izolacji kwasów

nukleinowych istotna jest wiedza

o tym, jakie jest stężenie i

czystość materiału przed

wykonaniem jakichkolwiek badań.

W pomiarach spektroskopowych zasadnicze znaczenie ma znajomość stężeń molowych kwasów

nukleinowych. Stężenie można otrzymać z pomiaru absorpcji przy długości fali

λ = 260 nm (maksymalna absorpcja promieniowania nadfioletowego przez DNA), jeżeli znamy

molowy

współczynnik ekstynkcji ε

Z poniższego wzoru obliczamy
stężenie

Metody szczegółowych

obliczeń

Po kalibracji aparatury badanie

stężenia DNA w roztworze oznacza się przez pomiar absorpcji przy

długości fali λ = 260 nm,

określanej często jako OD

Następnie odczytuje się

adsorpcję przy 280 i 320 nm

lub tworzy się widmo w

zakresie 200 – 350 nm.

Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych

DNA to bufor o niskim stężeniu jonów, np. bufor TE.

Długość fali

(nm)

substancje absorbujące

230

EDTA, polisacharydy, etanol

260

DNA, RNA

270

fenol

280

białka

320

drobiny komórkowe

Widmo adsorpcji DNA w świetle UV

Jeżeli A

260

równa się 1 to

stężenie dwuniciowego

DNA (dsDNA) wynosi około

50 µg/ml, natomiast

jednoniciowego DNA

(ssDNA) 33 µg/ml, RNA - 40

µg/ml, a

oligonukleotydów 30 µg/ml.

Preparat DNA uznaje się za czysty

jeżeli

A

260

/A

280

wynosi 1,8-2,0. Kiedy próbka

DNA jest zanieczyszczona RNA to

wartość A

260

/A

280

jest

bliższa 2,0 , natomiast w razie gdyby

próbka zanieczyszczona była białkami

to wartość A

260

/A

280

jest niższa od

1,8.

Obecnie większość laboratoriów

dysponuje systemami typu

NanoDrop (Thermo Scientific),

które mierzą parametry w kropli

<1,5μl i automatycznie przeliczają

absorbancję na stężenie i czystość

białkową oraz organiczną.

Wyznaczają także wykres

absorbancji, bardzo pomocny przy

ustalaniu źródła

zanieczyszczeń kwasów

nukleinowych.