Hodowla komórkowa

1 Fazy wzrostu komórek w hodowli

• faza lag – adaptacja komórek (odbudowa glikokaliksu), faza G1 cyklu komórkowego

• faza log – duża żywotność komórek, wysoki metabolizm (długość fazy zależy od gęstości wyjściowej hodowli)

• faza plateau (stacjonarna) – konfluencja i zahamowanie wzrostu

Zbyt długa konfluencja może doprowadzić do śmierci komórek.

2 Utrzymanie linii komórkowych

• Transport komórek

• Mrożenie i przechowywanie linii

3 Zmiana pożywki zależy od:

• gęstości komórek w hodowli

• tempa proliferacji komórek

• metabolizmu komórek

Gdy brak składników odżywczych lub nagromadzenie zbyt dużych ilości katabolitów w medium:

• komórki przestają się dzielić

• następuje zmiana morfologii kom

• w komórce pojawiają się ziarnistości

• cytoplazma ulega wakuolizacji

• w końcowej fazie komórki przybierają okrągły kształt i odrywają się od podłoża

4 Czas podwojenia hodowli – czas potrzebny na podwojenie się ilości komórek w hodowli

Indeks mitotyczny – wyznaczanie odsetka komórek dzielących się

Z każdym podwojeniem populacji:

• kom starzeją się

• stopniowo dochodzi do abberacji chromosomowych

• stopniowo dochodzi do zmian w strukturach organelli

• zwiększa się przepuszczalność błon komórkowych

5 Mrożenie i przechowywanie linii komórkowych:

Linie komórkowe osiągające 10 podwojeń populacji

Szybkość zamrażania ok. 1˚C/min

Po zamrożeniu umieszczeni kom w temp ciekłego azotu -196˚C

6 Zamrażanie żywych komórek:

1949r. – Christopher Polge przypadkowo odkrywa, że plemniki kurze przeżywają zamrożenie w obecności 5 – 10% glicerolu.

Glicerol – nie przenika przez błonę komórkową – podczas powolnego zamrażania………..

DMSO – dimetylosulfotlenek przenika przez błonę kom, podczas powolnego zamrażania chelatuje metale białkowe, co przeciwdziała denaturacji białek.

DMSO i glicerol to krioprotektanty

7 Przechowywanie hodowli

• mrożenie w ciekłym azocie (-196˚C)

• linie komórkowe osiągające wiek ok. 10 pokoleń

• w medium o właściwościach krioprotekcyjnych

10% glicerolu + 90% surowicy

10% DMSO + 90% medium z surowicą

10% DMSO + 90% surowicy

8 Rozmrażanie żywych komórek

• SZYBKO

• w łaźni wodnej temp. 37˚C

• jak najszybciej należy przenieść komórki do świeżej pożywki

dla kom DMSO jest toksyczny w temp pokojowej – jak najszybciej należy przenieść kom do świeżej pożywki w celu rozcieńczenia DMSO