1. PRODUKCJA I ZASTOSOWANIE PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH

• SKRINNING I SELEKCJA MIKROORGANIZMÓW WZGLĘDEM AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ.

Definicja i zasady skriningu

Skrining to zespół selektywnych zabiegów, które mają na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby drobnoustrojów tylko tych, które odpowiadają konkretnym wymaganiom technologicznym oraz wstępne sprawdzenie ich przydatności do danego procesu.

Jest niezwykle szeroki wybór stosowanych metod podczas poszukiwania użytecznych szczepów i ich produktów. Postęp w poznawaniu mechanizmów licznych procesów biologicznych oraz opanowanie nowych technik badawczych umożliwiają oprzeć skrining drobnoustrojów i wytwarzanych przez nie produktów na bardziej racjonalnych zasadach. W tym zakresie zostały wypracowane i nadal są doskonalone programy badawcze.

W początkowym etapie skriningu niejednokrotnie mamy do czynienia z nieznanym szczepem, który wytwarza nieznane substancje w małych stężeniach. W tym przypadku zasadniczym zadaniem jest wykrycie metabolitów o przypuszczalnym znaczeniu użytkowym [Chmiel, 1998].

Szczepy drobnoustrojów przemysłowych poddawane są zabiegom skriningu w sposób ciągły- podczas ich pozyskiwania ze środowiska, doskonalenia ich cech czy wykorzystania tych szczepów w konkretnych technologiach [Galas i in., 1995].

Ogólna strategia nowoczesnego skriningu:

1. Pozyskiwanie szczepów:

- izolacja drobnoustrojów ze środowiska, eliminacja powtórzeń, klasyfikacja i przechowywanie,

- modyfikacja genotypu w celu pozyskania nadprodukcji metabolitu o odmiennej strukturze lub produkcji całkowicie obcej dla mikroorganizmu struktury chemicznej;

2. Skrining produktów:

- opracowanie metod oraz dokładnie ukierunkowanego skriningu in vitro,

- izolacja i identyfikacja produktu,

- testowanie aktywności in vivo;

3. Optymalizacja produkcji:

- opracowanie podłoża i warunków fizycznych bioprocesu,

- powiększenie skali i wdrażanie przemysłowe,

- prowadzenie i usprawnienie procesu technologicznego [Chmiel, 1998].

Szybkie metody selekcji (skrining) mogą występować w dwóch formach, jako:

- nieselektywne, przypadkowe wyszukiwanie, kiedy każdy z wyizolowanych szczepów jest oddzielnie badany pod względem pozyskania oczekiwanej cechy,

- selektywne lub racjonalne poszukiwanie szczepów [Bednarski, 1993].

METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

Ilość enzymu w układzie można oznaczyć na podstawie pomiaru szybkości katalizowanej przez niego reakcji. Szybkość reakcji nie zawsze jest jednak proporcjonalna do stężenia enzymu i najczęściej mierząc szybkość reakcji enzymatycznej określa się aktywność enzymu w określonych warunkach. Szybkość reakcji enzymatycznej, a więc konsekwentnie i aktywność enzymu jest zależna od wielu czynników zarówno fizycznych, jak i chemicznych. Oprócz stężenia enzymu i stężenia substratu, na aktywność enzymu mają wpływ takie czynniki jak: temperatura, pH roztworu w którym zachodzi reakcja, działanie aktywatorów lub inhibitorów oraz efektorów allosterycznych. Szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta zwykle wraz ze wzrostem temperatury i dla większości enzymów temperatura optymalna zbliżona jest do 40^oC. Nie jest to jednak reguła i znane są enzymy, dla których optymalna temperatura jest wyższa bądź niższa. Nadmierne podwyższenie temperatury prowadzi do ograniczenia lub zahamowania szybkości reakcji enzymatycznej na skutek denaturacji termicznej białka enzymatycznego. Termostabilność enzymu określa się podając najwyższą temperaturę, w której nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu. Równie ważnym czynnikiem jak temperatura jest pH środowiska reakcji. Szybkość reakcji jest maksymalna przy optymalnym pH dla danego enzymu. Rozpiętość optimum pH dla reakcji enzymatycznych jest znaczna i waha się w zakresie od 1 do 9. Małe odchylenia od optymalnej wartości pH dla danego enzymu powodują zwykle nieznaczne zmniejszenie szybkości reakcji, jednak duże odchylenia pH od wartości optymalnej mogą prowadzić nawet do nieodwracalnej denaturacji białka enzymatycznego. Do innych czynników wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych należą aktywatory i inhibitory. Mogą to być związki nisko- lub wielkocząsteczkowe zarówno nieorganiczne, jak i organiczne. Wiele enzymów wrażliwych jest nawet na małe stężenia soli metali ciężkich, które mają katalityczny wpływ na utlenianie grup hydrosulfidowych tlenem atmosferycznym. Inhibitorami mogą być również związki kompleksujące metale będące częścią centrum katalitycznego enzymu lub biorące udział w procesie katalitycznym. Do tej grupy związków zaliczane są cyjanki, azydki, H2S oraz CO. Za aktywowanie dużej grupy enzymów odpowiada z kolei obecność elektrolitów (Cl-, Br-, NO3-). Do tej grupy enzymów należą amylazy.

Metody analityczne stosowane do oznaczeń aktywności enzymów

- analiza klasyczna (np. miareczkowanie)

- analiza instrumentalna – metody spektrofotometryczne, polarymetryczne, refraktometryczne, potencjometryczne itd.

Pomiar bichromatyczny

- przy dwóch długościach fali

- pozwala na eliminowanie wpływu substancji

towarzyszących i zanieczyszczeń

Metody oznaczania aktywności enzymów

• metody statyczne

– dwupunktowe – porównanie ilości substratu lub produktu w 2 punktach czasu: w czasie zero i po zakończeniu inkubacji

- należy zapewnić warunki reakcji aby zapewnić stałą szybkość reakcji przez cały czas inkubacji

• metody kinetyczne

- pomiar zmian stężenia substratu lub produktu w jednostce czasu, w początkowym okresie reakcji

- wymagają ciągłej rejestracji zmian stężeń badanego składnika w czasie (pomiar wielopunktowy lub ciągły)

Metody oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych

Szybkość reakcji enzymatycznej można oznaczać:

• poprzez określenie szybkości ubytku substratu bądź też

• poprzez określenie ilości powstałych produktów w jednostce czasu.

W przypadku enzymów z grupy amylaz mogą być zastosowane obydwa sposoby oznaczania aktywności enzymatycznej. Jak już wspomniano, produktami hydrolizy skrobi wobec α-amylazy są kolejno: • amylodekstryny zawierające powyżej 30 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami glikozydowymi

• erytrodekstryny zawierające 8-12 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami

glikozydowymi oraz

• achrodekstryny zawierające poniżej 6 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami

glikozydowymi,

• a także maltoteraoza, maltotrioza oraz maltoza.

Początkowe produkty degradacji skrobi tworzą z jodem barwne kompleksy, jednak achrodekstryny już tych kompleksów barwnych nie tworzą. Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych poprzez mierzenie ubytku substratu w czasie bazuje na zmniejszeniu się zabarwienia hydrolizatu po dodaniu jego porcji do roztworu jodu (aż do uzyskania tzw. punktu achromowego, w którym roztwór jodu nie zmienia zabarwienia po dodaniu próbki hydrolizatu). Do takich metod należy miedzy innymi metoda Heinkela pozwalająca na podanie aktywności α-amylazy w jednostkach Wohlgemutha. Inną metodą pozwalającą na oznaczenie w ten sposób aktywności α-amylazy jest metoda Sandstedta, Kneena i Blisha. Aktywność amylaz możemy również określić na podstawie przyrostu redukcyjności roztworu. Powstające w wyniku reakcji cukry redukujące możemy oznaczać na różne sposoby np.:

• z wykorzystaniem metody polegającej na pomiarze stopnia osłabienia intensywności zabarwienia alkalicznego roztworu heksascyjanożelazianu(III) potasu. W metodzie tej cukry redukujące reagują z alkalicznym roztworem heksascyjanożelazianu(III) potasu (którego roztwór ma barwę intensywnie żółtą) przekształcając go w bezbarwny heksascyjanożelazian(II) potasu

• z wykorzystaniem metody Bernfelda, która polega na utlenianiu kwasem 3,5-dinitrosalicylowym grup redukujących uwolnionych podczas hydrolizy skrobi w obecności amylaz. W środowisku zasadowym grupa nitrowa soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 zostaje zredukowana do grupy aminowej, a powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują światło przy długości fali 530 nm. Intensywność barwy będącą pochodną ilości powstających produktów oznacza się fotometrycznie

• z wykorzystaniem metody Somogyi i Nelsona wykorzystującej, podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, właściwości redukujące sacharydów, które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi(II) do jonów miedzi(I) w obecności winianu sodowo-potasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO w postaci ceglastego osadu. Po dodaniu kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do utworzonego tlenku miedzi zachodzi redukcja tego kwasu do odpowiedniego barwnika o kolorze błękitnym, intensywność otrzymanej barwy można mierzyć w zakresie długości fali od 500-620 nm i jest ona proporcjonalna do Oznaczanie aktywności enzymów 6 ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych.

Szybkość reakcji mierzona ilością przereagowanego związku w jednostce czasu w przeliczeniu na określoną ilość materiału badanego jest miarą aktywności enzymu. Aktywność ta jest wyrażana w jednostkach umownych i często różniących się w zależności od ustaleń autorów opracowujących daną metodę analityczną.

Porównywanie wyników aktywności uzyskiwanych różnymi metodami może być mylące i dlatego Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej wprowadziła pojęcie bezwzględnej międzynarodowej jednostki standardowej (U). Jednostką (U) każdego enzymu jest ta jego ilość, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu (lub 1 µmola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30oC i w optymalnych warunkach pH i temperatury dla danego enzymu.

• WYBRANE ELEMENTY TECHNOLOGII POZYSKIWANIA ENZYMATYCZNYCH PREPARATÓW MIKROBIOLOGICZNYCH: METODY PRODUKCJI, UTRWALANIA, STABILIZACJI ENZYMÓW. POŻYWKI, TYPY HODOWLI, WYDZIELANIE I OCZYSZCZANIE, FORMY PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH.

Preparaty enzymatyczne

Enzymy w ciągu ostatniego dziesięciolecia zostały szeroko wprowadzone do praktyki przemysłowej. Są one wykorzystywane przez: przemysł spożywczy, tekstylny, skórzany, fotochemiczny, kosmetyczny, papierniczy, gumowy, pralnictwo, a także w analityce i w medycynie. O ile zastosowanie enzymów w lecznictwie jest jeszcze ograniczone, choć w przyszłości ich wykorzystanie w medycynie na pewno znacznie się powiększy, o tyle znaczenie enzymów w analityce jest ustalone.

W analityce stosuje się je przy oznaczeniach stężeń różnych związków oraz jako wybiórcze układy pomocnicze w pomiarach czynności enzymów trudnych do oznaczenia na innej drodze. Wymagana jest tutaj bardzo wysoka czystość chemiczna związków czynnych, Ogranicza to stosowanie enzymów w postaci preparatów dla rutynowych analiz w procesach przemysłowych. Jednakże i tutaj zaczynają te metody odgrywać coraz większą rolę.

Rozszerzenie zastosowania enzymów związane jest z koniecznością stabilizacji ich preparatów. Zagadnienie to jest badane. Wykorzystuje się w tym celu odpowiednie nośniki wiążące białka enzymatyczne.

Obszerną grupę preparatów enzymatycznych wykorzystywanych w skali przemysłowej stanowią enzymy amylolityczne a-amylazy oraz amyloglukozydaza. Różnią się one pochodzeniem (bakteryjne lub grzybowe),, sposobem otrzymywania, stopniem oczyszczenia, a także zawartością enzymów towarzyszących. Preparaty te są stosowane w gorzelnictwie do scukrzania zacierów skrobiowych, w przemyśle ziemniaczanym, przy produkcji glukozy, syropu glukozowego ze skrobi, zmodyfikowanych krochmali. Stosuje się je również w piekarnictwie w celu poprawienia jakości pieczywa, w przemyśle koncentratów spożywczych, w przetwórstwie owocowo-warzywnym, a także w przemyśle tekstylnym i papierniczym przy otrzymywaniu wysokogatunkowego papieru,do rozłożenia pulpy drzewnej, w przemyśle paszowym. Szczególnie czynną- amylazę ma Aspergillus ilavusoryzae. W skali przemysłowej powszechnie wykorzystywane są do produkcji tych enzymów szczepy Bacillus subtilis.

Szeroko stosowane są także preparaty pektolityczne i celulolityczne, które jako jedne z pierwszych wprowadzono do przetwórstwa owocowo-warzywnego.

Enzymy proteolityczne, których znaczenie terapeutyczne, są szeroko stosowane w przemyśle spożywczym: w przetwórstwie rybnym, mięsnym, gdzie przyspieszają dojrzewanie, poprawiają jakość, zmieniają konsystencję szeregu produktów. W przemyśle mleczarskim mogą zastąpić podpuszczkę i skrócić proces dojrzewania serów twardych i twarogów. Proponuje się też ich zastosowanie do otrzymywania hydrolizatów kazeiny oraz w celu ulepszenia cech użytkowych mleka w proszku. W piwowarstwie stabilizują klarowność piwa, w piekarnictwie, podobnie jak amylazy, poprawiają jakość pieczywa. W przemyśle paszowym mogą być wykorzystane do hydrolizy surowców białkowych słabo przyswajalnych przez organizm zwierzęcy. W przemyśle skórzanym stosuje się je do odwłaszania i wytrawiania skór, a w przemyśle fotochemicznym, do regeneracji zużytych błon filmowych.

Proteazy, amylazy i lipazy mają zastosowanie w proszkach piorących, w przemyśle kosmetycznym, a także w tekstylnym.

Inne preparaty enzymatyczne o znaczeniu technicznym to: inwertaza (a-fruktofuranozydaza) otrzymywana z drożdży, stosowana w przemyśle cukierniczym do częściowej inwersji mas karmelowych i produkcji cukierków, laktaza (p-galaktozydaza) stosowana w produkcji zagęszczonego mleka słodzonego, koncentratów serwatkowych itp.r zapobiega krystalizacji laktozy oraz powstawaniu ziarnistości w tych produktach, katalaza jest wykorzystywana m. in. w przemyśle gumowym dla nadania porowatej struktury pianom, oksydaza glukozowa, stosowana do podniesienia jakości i trwałości niektórych produktów spożywczych (stabilizacja suszonego białka jaj, stabilizacja tłuszczów, majonezu, piwa, wina).

W perspektywie należy widzieć stosowanie preparatów enzymatycznych z drobnoustrojów dla celów chemii stosowanej, a także dla unieszkodliwienia dymów i oczyszczania powietrza. Kompleksowe preparaty enzymatyczne są coraz częściej używane w oczyszczaniu ścieków.

Drobnoustroje są doskonałym źródłem w produkcji preparatów enzymatycznych zarówno ze względu na szybkość rozmnażania się, bogactwo wyposażenia enzymatycznego i duże zdolności adaptacyjne. Produkcja ta stanowi obecnie samodzielną gałąź przemysłu mikrobiologicznego o dużych perspektywach rozwoju.

Jeżeli szybkość wzrostu drobnoustrojów jest równa szybkości rozcieńczania środowiska, a stężenie składników odżywczych i szybkość rozcieńczania nie przewyższają wartości krytycznej dla szybkości wzrostu mikroorganizmów, ustala się stan tzw. równowagi dynamicznej, w której mnożenie się komórek równe jest ich wymywaniu. Pełna automatyzacja procesu zabezpiecza długotrwałą stałość warunków rozwojowych, które przy właściwym doborze chronią populację przed degeneracją.

Hodowle ciągłe mogą być prowadzone w systemie jednostopniowym, tzn. w jednym fermentorze (np. produkcja drożdży) lub w systemie wielostopniowym, w kilku szeregowo połączonych naczyniach (np. produkcja etanolu). Mogą poza tym istnieć różne modyfikacje.

Do każdego wymienionego systemu może mieć zastosowanie zasada chemostatu lub turbidistatu. W pierwszym przypadku jest to regulacja systemu poprzez dopływ podłoża, w drugim ? poprzez fotoelektryczną regulację stężenia komórek w fermentorze. Hodowle takie pozwalają na otrzymanie biomasy komórek o wyrównanym stanie fizjologicznym, szybsze prowadzenie procesu, ekonomiczne wykorzystanie sub- stratu, pełną automatyzację produkcji, a także zmniejszenie wymiaru aparatury. Duże znaczenie ma tu możliwość opracowania podstaw matematycznych dla określonego procesu biologicznego. Korzyści tej metody są bezsporne w odniesieniu do pierwotnych produktów metabolizmu (np. alkohole, kwasy, a także biomasy), obserwuje się jednak trudności z zaadaptowaniem tej metody dla otrzymania wtórnych metabolitów, do których należą niektóre enzymy i antybiotyki.

Stosowanie hodowli ciągłej dla tych procesów wymaga doskonałej znajomości kinetyki tworzenia odpowiednich produktów, a także fizjologii szczepów w procesie ciągłym. Zdaniem specjalistów z tego zakresu dotychczasowe niepowodzenia szeregu procesów ciągłych mają jako główną przyczynę brak znajomości fizjologii mikroorganizmów przy pracy ciągłej.

Unieruchomione enzymy

Wydzielanie i oczyszczanie enzymów, zwłaszcza wewnątrzkomórkowych jest kosztowne. Zgodnie z zasadą najlepszego wykorzystania surowców dąży sie do wielokrotnego użycia enzymu - katalizatora. Nie można tego uzyskać w przypadku stosowaniu roztworów enzymów. Oddzielenie enzymów od płynu poreakcyjnego jest zbyt kosztowne. Rozwiązaniem problemu jest unieruchomienie enzymów (bądź całych komórek) na odpowiednim nośniku. Technika taka pozwala także na stosowanie reaktorów przepływowych, to znaczy o działaniu ciągłym.

Unieruchomione enzymy wykazują większą stabilność i efektywność działania, wolniej się dezaktywują. W praktyce przemysłowej wykorzystywana jest unieruchomiona deacylaza penicylinowa w produkcji penicylin półsyntetycznych, orfilizomeraza glukozowa w produkcji syropów glukozowo-fruktozowych.

Kataliza enzymatyczna

W mediach niekonwencjonalnych woda stanowi naturalne środowisko działania enzymów. Możliwe jest też prowadzenie przemian enzymatycznych w niekonwencjonalnych rozpuszczalnikach, obejmujących rozpuszczalniki organiczne i płyny w stanie nadkrytycznym. Możliwości prowadzenia reakcji w tego rodzaju środowisku są szczególnie interesujące w przypadku substratów słabo rozpuszczalnych w wodzie. Do głównych zalet katalizy enzymatycznej w niekonwencjonalnych rozpuszczalnikach można zaliczyć: wysoką rozpuszczalność substratów i produktów przemian, możliwość zmniejszenia efektów inhibicji, łatwiejsze wydzielenie produktu, przesunięcie równowagi reakcji. Należy się jednak liczyć z możliwością denaturacji enzymów oraz wzrostem złożoności układów reakcyjnych.

Dobór odpowiedniego rozpuszczalnika stanowi kluczowy element w nie-konwencjonalnej katalizie enzymatycznej. Podstawowymi kryteriami doboru jest: z jednej strony - uzyskiwanie wysokich wydajności reakcji i łatwość wydzielania produktu, z drugiej zaś - trwałość preparatu enzymatycznego. Biokataliza w organicznych rozpuszczalnikach może być prowadzona przez:

- homogeniczne układy z rozpuszczalnikami mieszającymi się z wodą,

- układy dwufazowe,

- mikroemulsje

- odwrócone micelle,

- rozproszenie enzymu w rozpuszczalniku bez fazy wodnej,

- kowalencyjne modyfikowanie enzymów rozproszonych fazie organicznej.

W większości przypadków prowadzenia przemian enzymatycznych w rozpuszczalnikach organicznych w układzie występuje niewielka ilość wody. Stanowi ona otoczkę hydratacyjną enzymu, zapewniając jego stabilność.

Innym, interesującym obszarem niekonwencjonalnej katalizy enzymatycznej jest prowadzenie procesu w gazach w stanie nadkrytycznym. Najczęściej stosowany jest dwutlenek węgla, dla którego temperatura krytyczna wynosi 304 K, zaś ciśnienie krytyczne 7,38 MPa. Zalety płynące Z przeprowadzenia reakcji w stanie nadkrytycznym dwutlenku węgla to:

- niska temperatura procesu,

- ograniczona rozpuszczalność białek w rozpuszczalnika, co umożliwia ich łatwą separacje z mieszaniny reakcyjnej,

- znaczne zmiany rozpuszczalności przy niewielkich zmianach temperatury lub ciśnienia ułatwiające separację produktów,

- możliwość frakcjonowania i oczyszczania produktów reakcji bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej bez konieczności zmiany rozpuszczalnika,

- możliwość uzyskania drobnoziarnistego produktu w wyniku rozprężenia roztworu nadkrytycznego przez dysze,

- brak pozostałości rozpuszczalnika w końcowym produkcie.

Dwutlenek węgla w stanie nadkrytycznym jest nietoksycznym, tanimi obojętnym dla środowiska rozpuszczalnikiem. Niedogodnością jest konieczność stosowania aparatury ciśnieniowej.

Produkcja przemysłowa

1.  Do produkcji enzymów polecane są szczepy, które produkują enzymy

pozakomórkowo.

2.  Najważniejsze cechy charakterystyczne procesów produkcji:

- najczęściej oczyszczenie metodą wgłębną (rzadziej powierzchniową)

- prowadzi się w bioreaktorach - fermentatorach o pojemności od kilku dm³ do kilku m³.

- stosowanymi źródłami C, N i substancji wzbogacających są: mąka ziemniaczana, kukurydziana, sojowa, mannok kukurydziany, melasa buraczana, otręby pszenne, ekstrakty drożdżowe, mączka rybna lub żelatyna.

- dla enzymów hydrolitycznych (hydrolaz stosuje się substancje zawierające typ hydrolizowanego wiązania (Aspergillus na pożywce zawierającej skrobię wytwarza glukoamylazę - rozkłądającą skrobię, hodowla na pożywce

tłuszczowej X wytwarzane lipazy rozkładające tłuszcz ‘)

- podczas hodowli technologicznej krytyczne jest odpowiednie wymieszanie i

napowietrzanie.

Schemat otrzymywania preparatu enzymu wewnątrzkomórkowego

Pożywki

Media hodowlane mogą być przygotowywane z surowców naturalnych. np. melasa. otręby pszenna, słoma itp. lub zestawiane sztucznie. Z reguły surowce naturalne są tańsze i bardziej efektywne.

Typowe surowce naturalne dla hodowli wgłębnej to: melasa. skrobia ziemniaczana lub kukurydziana, namok kukurydziany, mąka sojowa, wytłoki słodowe (odpad z produkcji piwa, źródło azotu. soli mineralnych), drożdże piwowarskie (zwykle w postaci suszone] lub autolizalu), wywar pogorzelniany.

W przypadku produkcji enzymów indukowanych odpowiedni induktor musi znajdować się w pożywce. W niektórych przypadkach induktorem jest substrat danej przemiany enzymatycznej, np. skrobia dla amylaz. Induktorami są również analogi substratu lub jego pochodne. Wysoką wydajność wytwarzania enzymów uzyskuje sie dzięki optymalizacji składu pożywki.

Do hodowli w podłożach stałych używa się otrąb pszennych, ryżu, wysłodków buraczanych wzbogaconych w sole mineralne.

Typy hodowli

Stosowane są dwa główne systemy hodowli mikroorganizmów: W podłożach stałych (HPS) i hodowle wgłębne (HPC). Hodowle w podłożach stałych znajdują zastosowanie do hodowli grzybów mikroskopowych. Hodowla prowadzona jest w złożu substratu podstawowego (np.: ryż. otręby pszenne, ziarna). Należy rozwinąć odpowiednio powierzchnię, na której mogą rosnąć grzyby mikroskopowe Wilgotność początkowa złoża wynosi ok. 40-70%. Dodawane są składniki mineralne: sole fosforowe i amonowe. Czas hodowli wynosi od I doby do 7.

W hodowlach w podłożach ciekłych stosuje się typowe aparaty i techniki,, takie same jak przy produkcji antybiotyków, czy biomasy. Różnice występują w składzie pożywek i warunkach prowadzenia procesu. Stosowane są reaktory o pojemności 10-100 m³, czas hodowli wynosi od 50 do 150 h. Hodowle prowadzone są w sposób okresowy. Zastosowanie hodowli ciągłej nie jest wskazane z uwagi na wykorzystanie szczepów zmutowanych. często o ograniczonej stabilności.

Czas prowadzenia hodowli zależy pod rodzaju enzymu. Dla jednych enzymów największa szybkość ich wytwarzania odpowiada fazie wzrostu wykładniczego, inne wydzielane są w największych ilościach W fazie stacjonarnej. Jednym z rozwiązań jest prowadzenie hodowli dwuetapowo: W etapie pierwszym następuje intensywne namnożenie biomasy mikroorganizmów, zaś w etapie drugim. który może być prowadzony w odrębnym reaktorze i zmienionych warunkach, następuje wytwarzanie enzymu.

Wydzielanie i oczyszczanie enzymów

Metody wydzielania i oczyszczania różnych enzymów są zbliżone. Podstawowe zróżnicowanie pojawia się na pierwszych etapach procesu i wynika z typu hodowli: W podłożu stałym lub wgłębna bądź z rodzaju enzymu.

Podstawową techniką wydzielania enzymów z fazy stałej po HPS jest ekstrakcja wodna. Czasami. w celu dłuższego przechowania, złoże jest suszone. Następne etapy procesu są zbliżone do metod postępowania z roztworami otrzymanymi z hodowli wgłębnych.

Enzymy zewnątrzkomórkowe wydzielane są do płynu hodowlanego i wymagają jedynie oddzielenia biomasy.

W produkcji enzymów wewnątrzkomórkowych dodatkowym etapem jest dezintegracja ścian komórkowych. niezbędna do uwolnienia płynu wewnątrzkomórkowego.

Naturalnym dążeniem technologicznym jest używanie takich mikroorganizmów, które wydzielają enzymy do środowiska hodowlanego. Do tej grupy należą hydrolazy. Jednakże znaczna część enzymów należy do enzymów wewnątrzkomórkowych. Dla przykładu. enzymem wewnątrzkomórkowym jest izomeraza glukozowa - enzym używany w dużych ilościach w produkcji syropów glukozowo-fruktozowych.

W celu uniknięcia kłopotów z wydzielaniem enzymu, do zastosowań praktycznych używa się całych komórek.

Na rys. 17.1 przedstawiono ogólny schemat wytwarzania preparatów enzymatycznych. Wyróżnić w nim można trzy zespoły operacji: hodowle. wydzielanie enzymu i oczyszczanie. zatężanie i zestawianie końcowej formy preparatu enzymatycznego.

Wielostopniowe procesy oczyszczania i zatężania enzymów pozwalają na otrzymywanie czystych preparatów białkowych, lecz ogólna wydajność tych procesów nie jest duża.

Formy preparatów enzymatycznych

Gotowe preparaty enzymatyczne występują w kilku podstawowych formach:

- roztwory o różnym stopniu zatężenia,

- preparaty stałe.

- unieruchomione enzymy,

- unieruchomione całe komórki.

Ciekłe preparaty enzymatyczne

Stosuje się różne stopnie koncentracji płynu pohodowlanego z od 2 do 100. Zatężanie prowadzi się przez ultrafiltrację bądź w wyparkach próżniowych. Stosunkowo łatwo jest otrzymać preparat standaryzowany. tzn. o określonej aktywności. Im mniejsze jest zatężenie preparatu, tym zwykle mniejsza jest jego trwałość.

Ciekłe preparaty enzymatyczne o niskim stopniu zatężenia i oczyszczenia są tanie i znajdują zastosowanie wszędzie tam. gdzie istotna jest jedynie aktywność preparatu, a nie jego czystość. W tej formie sprzedawane są niektóre preparaty amylolityczne i pektynolityczne. Wadą preparatów ciekłych, zwłaszcza o niskim zatężeniu jest konieczność transportowania i przechowywania znacznych objętości płynu.

Stałe preparaty enzymatyczne

Otrzymywanie preparatów enzymatycznych w formie stałej ma na celu uzyskanie stabilnego. zdatnego do dłuższego przechowywania, preparatu o zwiększonej, w stosunku do roztworów wodnych. jednostkowej aktywności. Do suszenia preparatów enzymatycznych stosuje się suszarnie próżniowe, suszarnie rozpyłowe lub liofilizację. Wybór danej metody suszenia musi uwzględniać wpływ procesu na aktywność enzymatyczną preparatu.

Jedynie w specjalnych przypadkach, stała forma preparatu odpowiada oczyszczonemu białku. Zwykle uzyskuje się preparaty w formie stałej w wyniku dodania odpowiedniego wypełniacza. Wypełniacz dobiera się tak, aby był nie tylko substancją obojętną, ale raczej by spełniał rolę stabilizatora enzymu. Wypełniacz dodawany jest bądź do ostatniego etapu zatężania, np. suszenia rozpylowego, bądź na wcześniejszych etapach wytwarzania preparatu.

Typowe wypełniacze dla preparatów enzymatycznych to: skrobia, zwłaszcza dla enzymów amylolitycznych, chlorek sodu, żelatyna, bentonit.

W przypadku preparatów enzymatycznych. stosowanych jako składniki proszków do prania, istotnego znaczenia nabiera przeciwdziałanie pyleniu się preparatu. W tym celu preparat jest poddawany granulacji. Znanych jest wiele technik granulacji: tabletkowanie, prasowanie, obtaczanie; szczególnie efektywne jest zastosowanie złoża fluidalnego. Otrzymywanie preparatów granulowanych obejmuje kilka operacji technologicznych: nawilżanie, mieszanie, granulację i suszenie.

• OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA ENZYMÓW LIPOLITYCZNYCH, AMYLOLITYCZNYCH I PROTEOLITYCZNYCH. AKTYWATORY I INHIBITORY ENZYMÓW PROTEOLITYCZNYCH. DOSKONALENIE WŁAŚCIWOŚCI ENZYMÓW. METODY IMMOBILIZACJI PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH.

Enzymy lipolityczne

Lipazy rozkładające tłuszcze właściwe, czyli triacyloglicerole, są typowymi enzymami trawiennymi. Występują one w trzustce, w ścianach jelita i w soku żołądkowym, a także w bogatych w tłuszcz nasionach roślin oleistych. Wykazują małą specyficzność do rodzaju kwasu tłuszczowego, są natomiast bardzo specyficzne odnoście wiązania estrowego w cząsteczce tłuszczu. Szybkość hydrolizy glicerydów rośnie wraz z liczbą występujących w nim reszt kwasów tłuszczowych i stopniem nasycenia kwasów tłuszczowych.

W żywności i produktach spożywczych mogą występować lipazy rodzime, jak również pochodzenia mikrobiologicznego. W produktach bogatych w tłuszcz działalność lipaz jest oceniana na ogół jako szkodliwa, ze względu na hydrolizę tłuszczu, np. w maśle, śmietanie, margarynie, smalcu, majonezie. Są jednak wyjątki, np. hydroliza tłuszczu w serach dojrzewających, zwłaszcza pleśniowych, przyczynia się do wytworzenia w nich odpowiedniego smaku i zapachu.

Preparaty enzymów lipolitycznych, które zawierają także niewielkie ilości a-amylazy i proteaz są stosowane w celu:

- poprawienia właściwości pianotwórczych albuminy jaj,

- modyfikowania tłuszczu,

- otrzymywania wolnych kwasów tłuszczowych z tłuszczu maślanego.

Wolne kwasy tłuszczowe, dodane w niewielkich ilościach, uwydatniają naturalny smak i zapach produktu, w większych ilościach powodują smak i zapach masła, a w jeszcze większych – sera. Kwasy te są stosowane w produkcji sosów, produktów piekarskich i czekoladowych.

Lipazy (EC. 3.1.1.3) są jednymi z najbardziej wszechstronnych enzymów. Znajdują zastosowanie w przemysłach: farmaceutycznym, mleczarskim, środków czyszczących, kosmetycznym, oleochemicznym i innych. Według aktualnych opinii przemysłu i naukowców, w nadchodzących latach nastąpi ogromny wzrost ich przemysłowego wykorzystania.

Lipazy triacyloglicerolowe katalizują hydrolizę nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (zwanych dawniej triglicerydami). Reakcja ta zachodzi na granicy międzyfazowej wody, (czyli fazy, w której rozpuszczone są lipazy) z lipidami, (czyli fazy substratu) i prowadzi do powstania kwasów tłuszczowych, diacylogliceroli (DAG), monoacylogliceroli (MAG) i glicerolu. Lipazy katalizują również hydrolizę rozpuszczalnych w wodzie, krótkołańcuchowych estrów kwasów karboksylowych, która zachodzi jednak bardzo powoli.

Hydroliza triacylogliceroli (TAG) jest reakcją odwracalną ze względu na niewielką różnicę w zmianie energii swobodnej w kierunku hydroliza-synteza. Kierunek reakcji jest zdeterminowany jej środowiskiem, przy czym nadmiar wody wywołuje hydrolizę, natomiast niska zawartość wody reakcję odwrotną - estryfikację glicerolu. Podczas syntezy grupy acylowe są przenoszone z cząsteczek donora na nukleofilowy akceptor (inny niż woda) taki jak alkohole, aminy czy tioestry. W środowisku alkoholu (zamiast wody) zachodzi transestryfikacja. Katalizowanie reakcji przez lipazy w środowisku o kontrolowanej zawartości wody (współczynniku aktywności wodnej) możliwe jest w środowisku rozpuszczalników organicznych, płynów nadkrytycznych, cieczy jonowych, stałych buforów etc.

Enzymy amylolityczne

Termin amylaza odnosi się do grupy enzymów, która odpowiedzialna jest za rozkład enzymatyczny cukrów, głównie skrobi. Są to enzymy rozpowszechnione w przyrodzie, występują zarówno u zwierząt, jak i roślin. Są produkowane również przez wiele mikroorganizmów. U człowieka amylazy są produkowane w trzustce oraz gruczołach ślinowych. Amylazy katalizują hydrolizę skrobi, czyli jej rozkład na mniejsze cząsteczki, takie jak maltoza. Istnieją różne rodzaje amylazy w zależności od sposobu rozrywania wiązania glikozydowego. W związku z tym faktem powstają różne produkty hydrolizy, takie jak: maltoza, glukoza, fruktoza, dekstryny. 

Znaczenie amylaz

Amylazy odgrywają znaczącą rolę w procesie trawienia wielocukrów, które są podstawowym źródłem energii dla człowieka lub mogą zostać zmagazynowane w organizmie jako materiał zapasowy. Enzymy te biorą również udział w procesach antyzapalnych, w które zaangażowana jest m. in. histamina. Obecnie prowadzone są badania nad znaczeniem roli amylaz w astmie, przewlekłej chorobie płuc.

Budowa amylaz

Jak wcześniej zostało wspomniane rozróżniamy 2 rodzaje amylaz: α-amylazę oraz β-amylazę. W świecie organizmów żywych α-amylaza jest szeroko rozpowszechniona. Jest produkowana przez człowieka oraz inne ssaki w śliniankach oraz wydzielana przez trzustkę do jelita cienkiego. Natomiast β-amylaza jest obecna u drożdży, bakterii oraz roślin, szczególnie w nasionach. Amylazy wymagają do pełnej aktywności obecności jonu Ca²⁺, który poprawia stabilność enzymu oraz bierze udział w reakcji katalitycznej. Enzymy z tej grupy są aktywowane w obecności jonów chlorkowych lub innych anionów.

Zastosowanie amylaz

Amylazy znajdują zastosowanie głównie w przemyśle spożywczym. Pozyskuje się je z surowców naturalnych, takich jak ziarna zbóż. Jednakże ilość tak pozyskiwanych amylaz jest często niewystarczająca oraz ich efektywność jest niska. Z tego powodu dodaje się amylazy zsyntetyzowane w warunkach przemysłowych. Najczęściej jest to mieszanka różnych typów amylaz. W przemyśle amylazy są głównie wykorzystywane w konwersji skrobi w inne rodzaje cukrów. Amylazy w kilkustopniowym procesie rozkładają skrobię zawartą w kukurydzy i ziemniakach do tzw. syropów, zawierających prostsze cukry (syrop glukozowy lub fruktozowy). Syropy te są wykorzystywane do produkcji, m. in. lodów, wyrobów piekarniczych, keczupu. Ponadto syrop glukozowy stanowi podstawowy składnik wielu produktów oraz dodatków spożywczych.

W przemyśle alkoholowym alkohol produkuje się głównie ze skrobi (np. ze zbóż lub ziemniaków). W pierwszym etapie skrobia przy wykorzystaniu amylaz jest rozkładana do cukrów prostszych, które poddawane są fermentacji. Natomiast w produkcji piwa na etapie słodowania amylazy naturalnie występujące w pszenicy rozkładają skrobię. Jednakże w celu optymalizacji tego procesu dodawane są amylazy zsyntetyzowane chemicznie oraz inne enzymy. Proces ten jest szeroko rozpowszechniony na świecie z wyjątkiem Niemiec, gdzie prawo tego zabrania.

Duże znaczenie amylazy odgrywają w piekarnictwie i cukiernictwie, ponieważ dodatek amylaz, które przyczyniają się do rozkładu skrobi, znaczenie poprawia wydajność drożdży. W związku z tym, poprawia się również jakość produktów, szczególnie w przypadku białego pieczywa. Amylazy wykorzystuje się również jako dodatek do soków owocowych, w celu eliminacji skrobi. Kolejnym przykładowym zastosowaniem amylaz na szeroką skalę jest przemysł tekstylny.

Produkcja amylaz na skalę przemysłową

Ze względu na szerokie spektrum zastosowania amylaz w przemyśle, enzymy te produkuje się na skalę przemysłową. W tym celu wykorzystuje się produkcję amylaz w różnorodnych kulturach bakteryjnych oraz grzybiczych. Jednakże bakteryjne amylazy są bardziej odporne na zmiany temperatury niż amylazy otrzymywane z kultur grzybiczych. Obecnie bakteryjne amylazy produkuje się głównie z zmodyfikowanych genetycznie mikroorganizmach (różne typy Bacillus). Natomiast w przypadku drugiego typu kultur najczęściej wykorzystuje się grzyby niemodyfikowane genetycznie.

Podsumowanie

Amylazy są bardzo ważnymi enzymami, które powszechnie występują wśród organizmów żywych. Odgrywają znaczącą rolę w wielu procesach fizjologicznych, a nie tylko ograniczają się do procesów trawiennych. Enzymy te znalazły również liczne zastosowania na skalę przemysłową. 

Enzymy proteolityczne

Proteazy (inaczej peptydazy, proteinazy) są enzymami, które odgrywają bardzo ważną rolę w każdej żywej komórce. Prowadzą proces proteolizy, czyli hydrolizują wiązania peptydowe pomiędzy aminokwasami, dzieląc długie łańcuchy aminokwasowe (zwane peptydami) na mniejsze części. Aminokwasy są budulcem białek żywych organizmów, które uzyskują je z pokarmu bądź też na drodze biosyntezy. Aminokwasy tworzą wyżej zorganizowane struktury zwane polipeptydami. Proteazy są odpowiedzialne za syntezę wszystkich białek, poprzez kontrolę ich składu, rozmiaru, kształtu, regulują również procesy ich degradacji. Miejsce cięcia przez peptydazy jest niezwykle precyzyjne, ponieważ większość tych enzymów tnie w miejscu występowania specyficznej dla danej peptydazy sekwencji aminokwasów. Dodatkowo enzymy te dokonują cięcia tylko w określonych dla danego enzymu warunkach środowiska.

Wyróżniamy wiele rodzajów proteaz. U człowieka wykryto około 500 peptydaz, które są kodowane przez 2% wszystkich ludzkich genów. Proteazy są aktywne w specyficznym pH, w związku z tym dzielimy je na: proteazy kwaśne, obojętne oraz zasadowe. Według innego podziału, uwzględniającego mechanizm działania tych enzymów, wyróżniamy następujące rodzaje peptydaz:

- proteazy serynowe

- proteazy treoninowe

- proteazy cysteinowe 

- proteazy asparaginowe

- metaloproteazy

- proteazy glutaminianowe

Inhibitory proteaz

Cząsteczki, które mogą w różnym stopniu hamować aktywność enzymów zwane są inhibitorami. Wiele inhibitorów może bezpośrednio wpływać na funkcjonowanie proteaz poprzez wiązanie się z ich miejscem aktywnym, uniemożliwiając w ten sposób wiązanie substratu. Natomiast inne zasłaniają miejsce wiązania substratu lub zmieniają kształt miejsca aktywnego enzymu. Inhibitory peptydaz mają istotne znaczenie w regulacji funkcjonowania tych enzymów w wielu procesach fizjologicznych. Mechanizm ten znalazł szerokie zastosowanie w medycynie, które szerzej zostało opisane w dalszej części artykułu.

Znaczenie proteaz

Proteazy odgrywają istotną rolę w wielu procesach, takich jak: zapłodnienie, trawienie, wzrost, dojrzewanie, starzenie się, a nawet śmierć organizmu. Enzymy te regulują liczne procesy fizjologiczne poprzez kontrolę aktywacji, syntezy oraz degradacji białek. Pełnią również istotną funkcję w replikacji oraz rozprzestrzenianiu się wirusów, bakterii oraz parazytów. Odpowiedzialne są za efektywną transmisję choroby wywoływanej przez te patogeny. Z tego powodu peptydazy stanowią istotny cel w przypadku leczenia wielu chorób. Obecnie wiadomo, że podłożem niektórych chorób genetycznych u ludzi jest pojedyncza mutacja w sekwencji aminokwasowej. Także nieprawidłowy poziom proteaz prowadzi do wielu nieprawidłowości fizjologicznych, czego konsekwencją jest choroba.

Przykłady wykorzystania mechanizmów regulacji proteaz w leczeniu chorób:

- inhibicja proteaz wirusowych odpowiedzialnych za replikację wirusa HIV jest obecnie najefektywniejszym sposobem leczenia AIDS

- blokowanie ludzkiej trombiny zaangażowanej w procesy krzepnięcia krwi jest skutecznym sposobem leczenia choroby wieńcowej

- zahamowanie działania proteazy ACE, która przyczynia się do wzrostu ciśnienia krwi, jest jedną z metod leczenia nadciśnienia tętniczego

Inne inhibitory proteaz są wykorzystywane w leczeniu: infekcji wywoływanych przez parazyty, grzyby oraz wirusy, różnego typu zapaleń, chorób immunologicznych, związanych z układem krążenia, oddechowym, nerwowym oraz nowotworów. Poziom ludzkich peptydaz wykorzystywany jest również jako wskaźnik wielu chorób, np. kalikreiny (specyficzny antygen prostaty) dają optymistyczną prognozę w przypadku terapii nowotworu prostaty. Innymi ważnymi peptydazami, będącymi indykatorami w diagnostyce medycznej są metaloproteinazy oraz katepsyny.

Obecnie prowadzone są eksperymenty wykorzystujące proteazy jako szczepionki w walce z licznymi chorobami wywoływanymi przez parazyty oraz wirusy. W fazie badań znajdują się szczepionki używane w leczeniu przede wszystkim chorób krajów trzecich, takich jak: malaria, schistosomoza oraz gorączka Denga. W szczepionkach wykorzystywane są także proteazy związane z rozwojem niektórych toksyn produkowanych przez bakterie, takie jak: Clostridium tytani (toksyny tężca) oraz Bacillus anthracis (toksyny wąglika). Dodatkową zaletą stosowania proteinaz w lecznictwie jest fakt, że ostatnie doniesienia naukowców głoszą, że mogą one skutecznie omijać przewód pokarmowy i zostać wchłonięte do krwioobiegu przy jednoczesnym zachowaniu ich pełnej aktywności enzymatycznej.

Proteazy mają również duże znaczenie w rolnictwie, ponieważ regulują życie owadów i innych szkodników gospodarskich. Wpływają również na wzrost i zdrowie zwierząt gospodarskich. Pełnią również kluczową rolę w kontroli wzrostu roślin. Szczegółowe badania nad proteazami mogłyby znacznie zwiększyć efektywność gospodarki poprzez poprawę niektórych właściwości roślin, takich jak: szybszy wzrost, zwiększona produkcja biomasy oraz odporność. Badania umożliwiłyby również rozwój nowych pestycydów, a także wzrost produkcji przemysłu spożywczego.

Wpływ proteaz na receptory

Komórki w różny sposób reagują na sygnały zewnętrzne. Hormony oraz małe cząsteczki, znajdujące się na zewnątrz komórki mogą bezpośrednio oddziaływać z receptorami, znajdującymi się na zewnętrznej powierzchni komórki. W ten sposób regulują wiele procesów życiowych. Obecnie wiadomo, że celem niektórych proteaz są właśnie receptory. W ten sposób peptydazy wpływają na system immunologiczny, rozwój nowotworów, zapaleń, astmy oraz alergii. Przykładowo roztocza wydzielają proteazy, które powodują astmę oraz alergie, ponieważ wpływają na białka powierzchniowe dróg oddechowych. Natomiast inna grupa proteaz modyfikuje receptory od wewnętrznej strony błony komórkowej, uczestnicząc w ten sposób w przekazywaniu sygnałów komórkowych.

Proteazy należą do ważnej grupy enzymów, ponieważ kontrolują wiele procesów biochemicznych zachodzących w żywych komórkach. Uczestniczą w ten sposób w licznych procesach fizjologicznych. Z tego powodu bardzo istotne jest szczegółowe poznanie molekularnych mechanizmów działania tych enzymów. Umożliwi to wykorzystanie peptydaz w biotechnologii na szeroką skalę. 

Doskonalenie właściwości enzymów i immobilizacja

Właściwości enzymów, w tym ich biokatalityczną aktywność, można modelować technikami klasycznymi, np. przez immobilizację, modyfikację chemiczną oraz technikami molekularnymi, np. przez ukierunkowaną ewolucję molekularną.

Str. „Podstawy biotechnologii przemysłowej” 336-354

• ZASTOSOWANIE PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH W WARUNKACH PRZEMYSŁOWYCH – ENZYMATYCZNA MODYFIKACJA SKŁADNIKÓW ŻYWNOŚCI.

Preparaty enzymatyczne stanowią nieodłączną część nowoczesnego przetwórstwa żywności. Enzymy są katalizatorami (biokatalizatorami) przemian chemicznych, wytwarzanymi przez żywe organizmy. Jedynie w ich obecności może zachodzić wiele reakcji metabolicznych we względnie łagodnych warunkach, tzn. w temperaturze poniżej 100 ºC, przy ciśnieniu atmosferycznym i obojętnym pH. Praktyczne wykorzystywanie działania enzymów nastąpiło na długo przed tym, zanim potrafiono uzasadnić to naukowo. Pierwszym enzymem otrzymanym na skalę przemysłową dla przemysłu spożywczego była podpuszczka, uzyskana przez duńskiego naukowca Christiana Hansena w 1874 r. z żołądków cieląt i użyta w produkcji serów. Na początku XXI w. trudno podać przykład produkcji żywności bez udziału preparatów enzymatycznych; wykorzystywanych jest ponad 100 znanych enzymów, a liczba ta każdego roku zwiększa się.

Atrakcyjność preparatów enzymatycznych związana jest z ich szerokim zastosowaniem praktycznie w każdej gałęzi przemysłu spożywczego. Ułatwiają one otrzymanie pożądanych zmian surowca, poprawę jakości produktu gotowego oraz zmniejszenie kosztów produkcji. Na skalę przemysłową otrzymuje się enzymy, wykorzystując do tego celu mikroorganizmy. Procesy biosyntezy ulegają stałemu rozwojowi spowodowanemu głównie nowymi możliwościami wykorzystania inżynierii genetycznej do modyfikacji organizmów oraz nowych rozwiązań konstrukcyjnych bioreaktorów. Dzięki inżynierii genetycznej możemy otrzymać  obecnie preparaty o wybranej ściśle określonej specyficzności, a dzięki temu o nowych właściwościach i zastosowaniach w przemyśle. Mimo to, organizmy genetycznie zmodyfikowane cechuje duża zmienność i niska stabilność  w procesach technologicznych. Dlatego też w dalszym ciągu prowadzone są doświadczenia na szczepach pochodzących ze środowiska naturalnego, których genom nie został wcześniej zmodyfikowany na drodze inżynierii genetycznej. Jedną z najstarszych i najbardziej rozpowszechnionych grup enzymów są enzymy amylolityczne .

Preparaty enzymów amylolitycznych

Amylazami nazywa się wiele enzymów używanych do hydrolizy skrobi na cukry prostsze. Od dawna amylazy pochodzenia roślinnego były używane w przemyśle spożywczym, a zwłaszcza w przemyśle piwowarskim i spirytusowym. Obecnie w przemyśle spożywczym są najpowszechniej  stosowane są amylazy otrzymywane przy użyciu drobnoustrojów.

Do grupy amylaz należą m. in.

Do amylaz rozszczepiających  wiązania α – 1,4 – glikozydowe skrobi należy:

α – amylaza,

β – amylaza,

egzo – α – amylazy.

Wiązania α – 1,6 – glikozydowe rozszczepia izoamylaza i pullulanaza. Glukoamylaza i niektóre pullulanazy mogą rozszczepiać wiązania α – 1,4 – i 1,6 – glikozydowe. Biorąc pod uwagę położenie rozszczepianego wiązania w łańcuchu skrobi, rozróżniamy endoamylazy, np. α – amylazy, amylazy znoszące rozgałęzienia cyklodektrynazy oraz egzoamylazy, tj. glukoamylazy, β – amylazy, egzo - α – amylazy. Biorąc pod uwagę technologiczny  punkt widzenia wyróżniamy amylazy upłynniające - α – amylazy, pullulanazy, cyklodekstrynazy oraz scukrzające – niektóre α – amylazy, β – amylazy, glukoamylazy. Badania nad enzymatyczną degradacją skrobi są prowadzone od dawna. W przemyśle skrobiowym można stosować rożne enzymy lub ich mieszaniny, co umożliwia uzyskanie różnych produktów spełniających określone wymagania odbiorców. Końcowe produkty hydrolizy skrobi są różne i zależne od użytego enzymu. Podatność skrobi na działanie enzymów amylolitycznych zależy od jej pochodzenia. Zaobserwowano, że skrobia kukurydziana i sojowa ulega hydrolizie szybciej od skrobi ziemniaczanej. Enzymy amylolityczne dzięki swoim właściwościom znajdują powszechne zastosowanie m. in. w przemyśle piwowarskim, w procesie zacierania słodu do upłynniania i scukrzania skrobi, w celu przygotowania jej do fermentacji przez drożdże. Dzięki za zastosowaniu enzymów amylolitycznych można obniżyć temperaturę kiełkowania skrobi z ok. 75 - 80°C do temperatury maksymalnie 70°C. Scukrzanie skrobi następuje w wyniku współdziałania „cukrującej” β – amylazy i „dekstrującej” α – amylazy, na co zdecydowany wpływ ma temperatura i pH środowiska.Należy pamiętać, że na końcowy efekt działania enzymów ma wpływ wiele czynników technologicznych, w tym ogromne znaczenie mają temperatura i pH.

Preparaty amylolityczne pochodzenia mikrobiologicznego nabierają szczególnego znaczenia w tym przemyśle w związku ze stosowaniem do otrzymywania brzeczek z niesłodowanych surowców (śruty jęczmiennej, ryżowej czy kukurydzianej, pszennej), w których proporcje związków białkowych do skrobi są inne niż w słodzie jęczmiennym. Amylazy pochodzenia mikrobiologicznego znajdują zastosowanie w gorzelnictwie rolniczym przy scukrzaniu skrobi ziemniaczanej lub zbożowej, umożliwiają częściowe lub całkowite wyeliminowanie słodu, co skutkuje znacznymi efektami ekonomicznymi. Zastosowanie amylazy pochodzenia pleśniowego umożliwia zastąpienie słodu o 50 – 60%, natomiast użycie termostabilnej, bakteryjnej α – amylazy oraz amyloglukozydazy (glukoamylazy) pochodzenia grzybowego pozwala na całkowicie wyeliminowanie słodu. Dawka enzymów w przeliczeniu na skrobię wynosi 0,1 – 0,5% α – amylazy i 0,15 – 0 4% amyloglukozydazy.

Zastosowanie preparatów amylolitycznych w piekarnictwie powoduje zwiększenie puli cukrów fermentowanych wykorzystywanych przez drożdże, co z kolei zwiększa pulchność ciasta.

Enzymy amylolityczne stosuje się także w:

•    przemyśle zbożowym – do produkcji dekstryn, krystalicznej glukozy, tzw. syropu zbożowego,

•    cukiernictwie – do odzyskiwania cukru z odpadów cukierniczych,

•    przemyśle ziemniaczano – krochmalniczym – do produkcji różnych preparatów: środków zagęszczających, dodatków do sosów, budyni, składników odżywek dla dzieci, do produkcji dekstryn i amylozy służącej jako materiał do opakowań środków spożywczych. Preparaty stosuje się często przy produkcji glukozy i syropów dla przemysłu cukierniczego (do produkcji cukierków i chałwy), owocowo – warzywnego (do produkcji dżemów i marmolad), a także jako środek słodzący w przemyśle piekarniczym i piwowarskim.
W zakładach wytwórczych glukozy na całym świecie daje się zauważyć tendencję do coraz częstszego stosowania kwasowo – enzymatycznych i enzymatycznych metod hydrolizy skrobi zamiast hydrolizy kwasowej.

Enzym α – amylaza hydrolizuje wiązania α – 1,4 – glikozydowi wewnątrz łańcucha cząsteczki skrobi, co zmniejsza lepkość roztworu.

Stosuje się go w pierwszym etapie przetwarzania skrobi, powodując jej szybkie upłynnienie. Produktami końcowymi hydrolizy skrobi, w zależności od pochodzenia enzymu, może być maltoza i niewielkie ilości dekstryn granicznych.

Przy użyciu Aspergillus oryzae, otrzymana α – amylaza w hodowli powierzchniowej, była pierwszym enzymem produkowanym na skalę przemysłową. 

Aspergillus oryzae jest grzybem używanym najczęściej w badaniach nad optymalizacją biosyntezy α – amylazy, co umożliwia opracowanie warunków jej przemysłowego otrzymywania podczas hodowli wgłębnej.

W zależności od drobnoustroju użytego do produkcji α – amylazy, otrzymane enzymy różnią się miejscem hydrolizowanego wiązania  α – 1,4 – glikozydowego w skrobi oraz optymalnymi warunkami hydrolizy, tj.  optymalną temperaturą i kwasowością. Tym samym końcowe produkty hydrolizy skrobi mogą być różne, zależnie od pochodzenia α – amylazy. Enzym ten, syntetyzowany przez bakterie, może upłynniać lub upłynniać i scukrzać skrobię.

W wyniku działania enzymu upłynniającego ze skrobi otrzymujemy syrop o DE 30 (równoważnik dekstrozowy, tj. liczba cukrów redukujących przypadająca na jednostkę suchej substancji produktu), zawierający glukozę, maltozę, maltotriozy, znaczne ilości oligosacharydów zawierających 6 reszt glukozowych oraz dekstryny graniczne.
W wyniku działania enzymów scukrzających na skrobię otrzymuje się cząsteczki zawierające 1 - 6 reszt glukozowych oraz α – dekstryny graniczne. W następstwie hydrolizy skrobi otrzymuje się syrop o DE 50.

Dzięki α – amylazom syntetyzowanym przez grzyby skrobi można uzyskać syrop o DE 30 – 80, zawierający glukozę, maltozę, oligosacharydy zawierające 3 – 6 reszt glukozy oraz α – dekstryny graniczne.

Należy podkreślić , że α – amylazy grzybowe, w przeciwieństwie do α – amylazy bakteryjnej, wykazują większą aktywność w środowisku o niższej temperaturze i wyższym pH. Używając wyselekcjonowanego szczepu szczepu Bacillus licheniformis, otrzymano termostabilną α – amylazę o optymalnej temperaturze hydrolizy skrobi 95°C; przez krótki czas jest ona nawet aktywna w temp. 105 - 110°.

Preparaty enzymów proteolitycznych

Z punktu widzenia handlowego najważniejszą grupę enzymów stanowią enzymy proteolityczne (proteazy). Głównie wynika to ze stosowania proteaz do produkcji detergentów  (proszki do prania), niemniej należy też podkreślić ich ważną rolę w przetwórstwie żywności. Obejmują one białka enzymatyczne, wśród których można wyróżnić cztery grupy różniące się budową centrum aktywnego. Jedną z grup tych enzymów są proteazy serynowe,  głownie pochodzenia bakteryjnego. Należy tu m. in. subtilizyna. Proteazy serynowe działają w środowisku zasadowym i wykorzystuje się je do obróbki skór rzeźnych oraz do usuwania sierści. Inną grupę enzymów proteolitycznych stanowią proteazy cysteinowe, których najbardziej znanym przedstawicielem jest roślinny enzym papaina. Działa ona w środowisku obojętnym i jest szeroko wykorzystywana w browarnictwie do klarowania piwa oraz do tenderyzacji  (zwiększania kruchości) mięsa. 

W przemyśle spożywczym duże zastosowanie znalazły proteazy asparaginowe, produkowane głównie przez pleśnie z gatunków Mucor miehi i M. pusillus. Ich optimum pH wynosi 4 – 4,5. Najważniejszym enzymem z tej grupy jest podpuszczka stosowana w przemyśle serowarskim do koagulacji białek mleka. Tradycyjnie enzym ten był otrzymywany z treści żołądków cieląt. Kwaśne proteazy pleśniowe, podobnie jak cielęca renina, nie hydrolizują kazeiny, tylko powodują jej ścinanie w drodze koagulacji. Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że od preparatów kwaśnych proteaz wymagana jest wysoka czystość, jakiekolwiek bowiem zanieczyszczenia innymi protezami i lipazami mogą prowadzić do rozkładu kazeiny oraz powstania gorzkiego smaku. Kwaśne proteazy wytwarzane przez grzyby z rodzaju Mucor  stosuje się głównie do wyrobu serów typu cheddar. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku skonstruowano rekombinowane genetycznie drożdże i bakterie, zdolne do syntezy proteaz podpuszczkowych znanych pod nazwą chymozyny. Enzymy te są obecnie szeroko stosowane w przemyśle serowarskim.

Proteaz pleśniowych używa się także w piekarnictwie do poprawiania tekstury ciasta, skrócenia czasu jego miesienia i zwiększania objętości pieczywa. Enzymy te są również dodawane do piwa w celu zwiększenia jego klarowności i polepszenia warunków filtracji. W przemyśle mleczarskim proteazy pleśniowe są wykorzystywane do stabilizacji zagęszczanego mleka i produkcji hydrolizatów białkowych.

Należy dodać, że jedynym enzymem proteolitycznym pochodzenia zwierzęcego, oprócz podpuszczki, który ma zastosowanie przemysłowe i dla którego optimum pH wynosi 1,8 – 2,5, jest pepsyna pozyskiwana z błony śluzowej żołądków kurcząt rzeźnych. 

Udokumentowanie wiodącej roli enzymów endogennych w procesie dojrzewania ryb solonych i marynat rybnych nasunęło wniosek wykorzystania preparatów proteolitycznych dla stymulacji tego procesu. W latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych prowadzono bardzo intensywne badania w tym zakresie w wielu krajach, szczególnie w Holandii, W. Brytanii, Norwegii, ZSRR i w Polsce. Uzyskano kilkadziesiąt różnego rodzaju patentów i otrzymane  wyniki wydawały się początkowo bardzo obiecujące, przynajmniej w skali laboratoryjnej i ćwierćtechnicznej. Dotyczyły one głównie zastosowania: wysuszonych i częściowo oczyszczonych wyrostków pylorycznych z ryb, mieszanki enzymów wyizolowanych z solanek rybnych, dodawania preparatów proteolitycznych pochodzenia zwierzęcego (głównie trypsyna), roślinnego (papaina, bromelaina, ficyna) lub mikrobiologicznego (głównie ze szczepów Aspergillus i Bacillus). W Polsce do produkcji enzymatycznie solonych ryb został dopuszczony preparat proteolityczny typu Proteopol BP-S (Pektowin, Jasło), otrzymywany w procesie biosyntezy z wykorzystaniem szczepu bakterii Bacillus subtilis, na bazie naturalnych podłoży pochodzenia roślinnego. Enzymy zawarte w preparacie hydrolizują białka do polipeptydów, peptydów i aminokwasów w środowisku o odczynie zbliżonym do obojętnego (pH 6-8). Preparat ten, jak również inne enzymy, był przedmiotem naszych badań podczas dojrzewania ryb solonych. Odnotowano, że enzymy te są bardzo efektywne, lecz ich działanie ogranicza się głównie do powierzchniowych warstw mięsa, które po pewnym czasie staje się papkowate, podczas gdy zmiękczenie tkanki wewnątrz fileta lub tuszy jest niedostateczne. Wiąże się to z utrudnioną dyfuzją enzymów jako makromolekuł w głąb mięsa. Przy nastrzykiwaniu filetów solanką z dodatkiem enzymu wyniki są korzystniejsze. Jednak żaden z dotychczas przebadanych preparatów enzymatycznych nie gwarantował uzyskania typowego, w pełni dojrzałego produktu solonego, tak pod względem smakowo-zapachowym jak i tekstury. Zauważono również, że proteazy pochodzenia roślinnego (np. papaina) są zbyt aktywne i powodują szybkie upłynnianie mięsa oraz, że obecność domieszki lipaz w preparacie proteolitycznym pogarsza jego przydatność technologiczną. Stosowanie odpowiednio oczyszczonych enzymów łączy się ze sprawą kosztów i obowiązkiem ich inaktywacji w gotowym produkcie.

Preparaty enzymów pektynolitycznych  i celulolitycznych

Już w latach 30. XX wieku do produkcji soku owocowego stosowano pektynazy. Ich użycie ograniczało się początkowo do obróbki miazgi i soku podczas przerobu owoców jagodowych  i do depektynizacji soku z owoców ziarnkowych. Operacje te stworzyły możliwość oferowania konsumentom klarownych, stabilnych soków owocowych. 

Jednym z ważniejszych kierunków zastosowania tych preparatów enzymatycznych jest maceracja miazgi owoców i warzyw. Proces ten ułatwia tłoczenie i przyczynia się do zwiększenia uzysku soku. Preparaty używane do maceracji miazgi stanowią kompozycję enzymów pektynolitycznych, hemiceluloz i celulaz. Działanie enzymów hemicelulolitycznych, oprócz wspomagania procesu tłoczenia, zapobiega występowaniu wtórnych zmętnień w soku, spowodowanych nadmierną ilością rozpuszczalnej hemicelulozy w soku. Odpowiednio dobrany, do konkretnych surowców preparat enzymatyczny, ułatwia również dalszą obróbkę soku, tj. depektynizację, klarowanie i filtrację

Preparaty enzymów lipolitycznych

W produkcji żywności coraz częściej sięga się po enzymy  lipolityczne (lipazy). Należą one do esteraz rozkładających triglicerydy wyższych kwasów tłuszczowych. Ponieważ lipidy nie rozpuszczają się w wodzie reakcja lipaz zachodzi na granicy fazy wodnej, w której rozpuszczone są enzymy, oraz fazy stałej (produkt zawierający tłuszcze).  Do produkcji lipaz wykorzystuje się głównie grzyby strzępkowe z rodzaju Rhizopus, Aspergillus i Mucor.

Dotychczas lipazy były wykorzystywane głównie w serowarstwie do przyspieszania dojrzewania i poprawiania aromatu serów. Ostatnio rośnie jednak zainteresowanie ich stosowaniem do regulowania składu kwasów tłuszczowych w triglicerydach, co ma znaczenie w kształtowaniu wartości odżywczej margaryn.

Zastosowanie innych enzymów jest znacznie mniejsze i ogranicza się do specjalnych celów. Spośród enzymów z grupy oksydaz w produkcji żywności stosuje się oksydazę glukozową  do usuwania glukozy lub tlenu z produktów spożywczych (masa jajowa, piwo, soki cytrusowe) lub dla zapobieżenia utlenianiu lipidów (np. majonez). Pewne zastosowanie znalazła także katalaza, która chroni produkty spożywcze przed szkodliwym działaniem nadtlenku wodoru (mleko, susze). Innym przykładem zastosowania enzymów oksydacyjnych jest lipooksydaza sojowa stosowana do zapobiegania ciemnieniu mąki pszennej.

Dzięki postępom enzymologii jest możliwe wytwarzanie fruktozylotransferaz o dużej aktywności w postaci immobilizowanej i preparatów ciekłych do stosowania w procesach biokonwersji sacharozy.

Z kolei zastosowanie powszechnie znanej reakcji hydrolizy laktozy w przemyśle mleczarskim może wspomagać przetwórstwo mleka i produktów ubocznych w celu: usunięcia laktozy z mleka, kontroli krystalizacji laktozy w koncentratach mleczarskich, pełnego wykorzystania serwatki i jej permeatu, produkcji karmy dla zwierząt, syntezy oligosacharydów i egzopolisacharydów, intensyfikacji syntezy kultur starterowych, poprawy i zwiększenia syntezy związków smakowo-zapachowych, otrzymania nowych, modyfikowanych produktów, np. serów serwatkowych, serów o nowych cechach smakowozapachowych, produktów do smarowania pieczywa.

Obecnie duże zainteresowanie towarzyszy zastosowaniu laktozy jako substratu w reakcjach enzymatycznej syntezy prebiotycznych galaktooligosacharydów. Kataliza reakcji transgalaktozylacji prowadzona jest z udziałem enzymów o różnym stopniu oczyszczenia oraz katalizatorów niewydzielonych ze struktur komórkowych (całokomórkowe, ang. whole-cell system) .

Podsumowanie

Stosowanie preparatów enzymatycznych w praktyce jest szerokie, gdyż obejmuje prawie wszystkie gałęzie przemysłu spożywczego. Najważniejsze korzyści płynące z zastosowania enzymów to: przyspieszenie procesów technologicznych, możliwość uruchomienia produkcji nowych asortymentów żywności (w tym żywności funkcjonalnej), podniesienie jakości i atrakcyjności oraz wydłużenie trwałości produktów żywnościowych, możliwość zwiększenia wydajności tradycyjnie stosowanych surowców i zmniejszenie kosztów produkcji.

ENZYMATYCZNA MODYFIKACJA SKŁADNIKÓW ŻYWNOŚCI

Współczesny przemysł spożywczy systematycznie zwiększa ofertę produktów wdrażanych z uwzględnieniem wyników badań żywieniowych, informujących o zależności stanu zdrowia konsumentów od składu chemicznego, wartości odżywczej i właściwości funkcjonalnych produktów spożywczych.

Na rynku dostępne są produkty spożywcze:

· przeznaczone dla określonych grup wiekowych,

· żywność o podwyższonej wartości energetycznej dla sportowców oraz osób ciężko pracujących fizycznie,

· żywność o obniżonej wartości kalorycznej (diety odchudzające),

· żywność pozbawiona cholesterolu,

· żywność hypoalergenna.

Obecnie dla oznakowania produktu i zwrócenia uwagi konsumenta na specyficzne walory żywności spotyka się następujące określenia: żywność projektowana, nowatorska, probiotyczna, zdrowa, ekologiczna, hypoantygenowa itp. Zmierza to do przekonania konsumenta, że spożywanie takiego pokarmu zmniejsza ryzyko choroby wieńcowej, nowotworowej i wielu innych chorób cywilizacyjnych, np. osteoporozy.

Wraz ze wzrostem świadomości żywieniowej konsumentów wzrasta ich zainteresowanie produktami spożywczymi, które oprócz zaspokojenia głodu, spełniają dodatkowe funkcje fizjologiczno – żywieniowe, wpływając na poprawę stanu zdrowia lub zmniejszając ryzyko wystąpienia chorób cywilizacyjnych. Produkty o takich walorach określa się mianem żywności funkcjonalnej.

Żywność funkcjonalna, to żywność wzbogacona w biologicznie czynne substancje, które poza wartością odżywczą mają także korzystny wpływ na zdrowie człowieka, cechujące się działaniem profilaktycznym lub wręcz leczniczym.  Naukowcy podkreślają wyraźną przewagę skuteczności żywności funkcjonalnej nad przyjmowaniem pojedynczych substancji czy związków. Coraz bardziej skłaniają się ku twierdzeniu, że produkt spożywczy będący naturalną kompozycją składników bioaktywnych występujących w optymalnych proporcjach, jest bardziej efektywny w działaniu na organizm człowieka.

Uatrakcyjnienie żywności przetworzonej dąży do polepszenia cech funkcjonalnych składników żywności białek, sacharydów, lipidów. Zwraca się uwagę na polepszenie struktury, konsystencji, smaku, zapachu, zdolności emulgowania, pienienia, wiązania wody itp.

W modyfikacji składu oraz właściwości funkcjonalnych składników żywności dość powszechnie stosuje się metody biotechnologiczne.

Białka

Białka należą do najważniejszych składników pokarmowych, niezbędnych do utrzymania życia. Są to makrocząsteczki o złożonej strukturze chemicznej, których elementarne części składowe stanowią aminokwasy, zbudowane z atomów węgla, tlenu, azotu, wodoru oraz siarki. Atomy te tworzą proste związki noszące nazwę aminokwasów, które stanowią elementarne części składowe białek.

Do dobrych źródeł białka w żywieniu należą jaja, mleko i jego przetwory, sery twarogowe i żółte oraz mięso zwierząt hodowlanych, drobiu i ryb. Mleko i jaja sama natura przeznaczyła do zapewnienia wzrostu i rozwoju młodych organizmów. Te produkty są szczególnie zalecane w żywieniu niemowląt, dzieci oraz ludzi w wieku podeszłym i starczym.

Jednakże czasami spożycie mleka może być ryzykowne, ze względu na dysfunkcje trawienne, problemy z absorpcją, metabolizmem i reakcją immunologiczną. Mleko krowie zawiera ponad 30 białek i większość z nich może wzbudzić IgE – zależną odpowiedź u dzieci alergicznych. Zmian immunoreaktywnych poszczególnych składników żywności można dokonać m.in. w wyniku procesów enzymatycznych .

Enzymatyczna modyfikacja składu i właściwości białek

Wpływ enzymów proteolitycznych na zmiany immunoreaktywności białek mleka jest jednym z ważniejszych etapów podczas przygotowywania odżywek dziecięcych. Dotychczas nie udało się dobrać idealnych warunków hydrolizy, zapewniających uzyskanie produktu końcowego o uniwersalnych właściwościach. Modyfikacje białek mleka, uzyskane w wyniku reakcji enzymatycznych, nie są jednak idealnym rozwiązaniem, gdyż mimo tego, że pozwalają uzyskać hydrolizaty o poprawionych właściwościach immunoreaktywnych, powodują jednak powstanie niekorzystnych cech funkcjonalnych uzyskanego w ten sposób produktu. Istotną cechą spożywanego produktu jest jego smak, natomiast konsekwencją reakcji hydrolizy jest niejednokrotnie smak gorzki, pojawiający się w wyniku obecności tzw. „gorzkich i cierpkich peptydów”.

Jednakże, gorzkość można zmniejszyć, usuwając hydrofobowe aminokwasy i gorzkie peptydy, modyfikując skład hydrolizatu za pomocą reakcji plasteinowej (polegającej na amidowym wiązaniu pożądanych reszt aminokwasów do peptydów hydrolizatu białkowego) lub oddając substancje maskujące smak, np. polifosforany, dekstryny, skrobię, żelatyny lub izobaty białkowe.

Enzymatyczna modyfikacja białek serwatkowych

    Leman J. (2006) ocenił przydatność enzymatycznej modyfikacji białek serwatkowych do otrzymywania żywności o zaplanowanych i pożądanych właściwościach, w tym hydrolizatów o ściśle zdefiniowanym profilu peptydowym. Również szczególną uwagę zwrócił na zastosowanie enzymatycznej hydrolizy, zwłaszcza w kombinacji z ogrzewaniem lub presuryzacją, do dealergizacji białek serwatkowych. Wskazał także na możliwość wykorzystania oporności β-laktoglobuliny na hydrolizę pepsyną lub peptydazami bakteryjnymi do otrzymywania jej wysoko oczyszczonych preparatów oraz na przydatność transglutaminazy do otrzymywania z białek serwatkowych jadalnych osłonek produktów żywnościowych.

Sacharydy

Sacharydy, obok białek i lipidów, są podstawową i różnorodną grupą związków naturalnych. Stanowią one połowę materii organicznej na Ziemi i większość składników organicznych zawartych w roślinach, natomiast u zwierząt występują w znacznie mniejszych ilościach. Różnorodność tej grupy związków jest duża, bowiem należą do niej sacharydy rozpuszczalne, o małej masie cząsteczkowej, wielkocząsteczkowe: skrobia, celuloza, glikogen, chityna, pektyny, gumy oraz śluzy roślinne i bakteryjne, substancje grupowe krwi, lektyny i In. Pełnią w organizmach żywych różne funkcje.

Ponadto sacharydy są jednym z ważniejszych ilościowo, obfitym składnikiem żywości. Do najważniejszych zalicza się:

· polisacharydy, np.: skrobię, celulozę, hemicelulozę, pektyny, β-glukany, fruktany,

· disacharydy, np.: sacharozę, maltozę,

· monosacharydy, np.: glukozę, fruktozę.

Ważne znaczenie w życiu człowieka ma błonnik. W jego składzie występują substancje o unikalnej strukturze chemicznej, charakterystycznych właściwościach fizykochemicznych oraz fizjologicznych. Oprócz lignin wszystkie te składniki są sacharydami występującymi naturalnie.

W produkcji żywności przetworzonej duże znaczenie ma polepszenie właściwości fizycznych, funkcjonalnych i fizjologicznych sacharydów. Przykładem może być enzymatyczna hydroliza laktozy, skrobi, β-glukanu, celulozy (tab.1).

Tabela 1. Przykłady enzymatycznej hydrolizy sacharydów

Proces	Substrat	Produkt
Hydroliza enzymatyczna	celuloza	glukoza
	ksylany	ksyloza
	laktoza	glukoza galaktoza
	β-glukan	β-glukan hydrolizowany do oligosacharydów

Laktoza (disacharyd), jeden z głównych składników mleka, jest jednym z głównych substratów reakcji chemicznych, których celem jest zwiększenie jej wartości użytkowej, funkcjonalnej. Laktoza może być substratem w reakcjach hydrolizy, fruktozylotransferu, transgalaktozylacji, izomeryzacji, oksydacji i redukcji, w wyniku, których powstają odpowiednio: glukoza i galaktoza, laktosacharoza, galaktooligosacharydy, laktuloza, kwas laktobionowy i laktikol. Zastosowanie powszechnie znanej reakcji hydrolizy laktozy w przemyśle mleczarskim może wspomagać przetwórstwo mleka i produktów ubocznych w celu: usunięcia laktozy z mleka, kontroli krystalizacji laktozy w koncentratach mleczarskich, pełnego wykorzystania serwatki i jej permeatu, produkcji karmy dla zwierząt, syntezy oligosacharydów i egzopolisacharydów, intensyfikacji syntezy kultur starterowych, poprawy i zwiększenia syntezy związków smakowo-zapachowych, otrzymania nowych, modyfikowanych produktów, np. serów serwatkowych, serów o nowych cechach smakowo zapachowych, produktów do smarowania pieczywa. Obecnie duże zainteresowanie towarzyszy zastosowaniu laktozy, jako substratu w reakcjach enzymatycznej syntezy prebiotycznych galaktooligosacharydów. Kataliza reakcji transgalaktozylacji prowadzona jest z udziałem enzymów o różnym stopniu oczyszczenia oraz katalizatorów niewydzielonych ze struktur komórkowych (całokomórkowe, ang. whole-cell system).

 

Niektóre możliwości stosowania enzymów rozkładających sacharydy w przetwórstwie owocowo-warzywnym 

W przemyśle spożywczym wykorzystuje się głownie trzy grupy enzymów rozkładających sacharydy: amylazy (hydrolizujące skrobię), pektynazy (hydrolizujące związki pektynowe) i celulazy (hydrolizujące celulozę). Jednym z większych obszarów stosowania preparatów enzymatycznych jest przemysł sokowniczy, w którym ich stosowanie jest powszechne. Już w latach 30. XX wieku do produkcji soku owocowego stosowano pektynazy. Ich użycie ograniczało się początkowo do obróbki miazgi i soku podczas przerobu owoców jagodowych i do depektynizacji soku z owoców ziarnkowych. Operacje te stworzyły możliwość oferowania konsumentom klarownych, stabilnych soków owocowych.

Gwałtowny rozwój technik współczesnej biotechnologii, wydzielenie indywidualnych enzymów komórkowych oraz identyfikacja nowych enzymów, o nieznanych dotychczas właściwościach, spowodowały, że stały się one nowym elementem kształtowania procesów technologicznych. Jednym z głównych kierunków zastosowania preparatów enzymatycznych jest maceracja miazgi owoców i warzyw. Proces ten ułatwia tłoczenie i przyczynia się do zwiększenia uzysku soku. Preparaty używane do maceracji miazgi stanowią kompozycję enzymów pektynolitycznych, hemiceluloz i celulaz. Działanie enzymów hemicelulolitycznych, oprócz wspomagania procesu tłoczenia, zapobiega występowaniu wtórnych zmętnień w soku, spowodowanych nadmierną ilością rozpuszczalnej hemicelulozy w soku. Odpowiednio dobrany, do konkretnych surowców preparat enzymatyczny, ułatwia również dalszą obróbkę soku, tj. depektynizację, klarowanie i filtrację soku.

Lipidy. Postępy biokatalizy w modyfikacji lipidów

Lipidy obejmują dużą grupę związków chemicznych, które można określić, jako rozpuszczalne w tzw. rozpuszczalnikach organicznych. Ich wpływ na organizm ludzki jest nie do przecenienia, ponieważ są one nośnikami energii, elementami budulcowymi struktur komórkowych, regulują funkcje fizjologiczne organizmu, etc. Tłuszcze są często postrzegane, jako związki chemiczne niekorzystnie oddziaływujące na nasz organizm. Odpowiedzią na te wątpliwości jest propozycja strukturyzacji lipidów. Doskonalenie właściwości lipaz i fosfolipaz umożliwia otrzymywanie produktów biokatalizy o ściśle zdefiniowanej budowie stereochemicznej i składzie chemicznym. Zastosowanie metagenomu i metod ukierunkowanej ewolucji molekularnej w pozyskiwaniu enzymów o nowych właściwościach biochemicznych może przyczynić się do znacznego postępu w modyfikacji lipidów. Powszechnie stosowane i wciąż doskonalone są metody inżynierii środowiska reakcji, inżynierii rozpuszczalnikowej mające na celu poprawę efektu biokatalizy. Celem strukturyzacji lipidów jest otrzymania triacylogliceroli, fosfolipidów zawierających zestryfikowane w odpowiednich sn-pozycjach z cząsteczką glicerolu polienowe kwasy tłuszczowe, w tym sprzężone, a także średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Strukturyzacja lipidów polega także na otrzymywaniu acylogliceroli, a ważnym kierunkiem modyfikacji lipidów jest enzymatyczna modyfikacja aktywności biologicznej witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Enzymatyczna modyfikacja lipidów daje szansa na przyjazne dla substratów tłuszczowych i środowiska warunki realizacji procesu. Jest to szczególnie ważne z uwagi na możliwość ograniczenia powstawania izomerów trans kwasów tłuszczowych.

Cele enzymatycznej modyfikacji lipidów

Enzymatyczna modyfikacja triacylogliceroli może być prowadzona w celu osiągnięcia następujących celów, w zakresie modyfikacji wartości żywieniowej, poprawy właściwości prozdrowotnych oraz fizykochemicznych:

• ograniczenia spożycia kwasów tłuszczowych nasyconych i syntezy izomerów trans kwasów tłuszczowych,

• zwiększenia zawartości kwasów tłuszczowych polienowych, w tym z grupy n-3 i n-6,

• zmniejszenia wartości kalorycznej tłuszczów i olejów,

• poprawy właściwości fizyko-chemicznych tłuszczów i olejów, np. stabilności oksydacyjnej, temperatury krzepnięcia i topnienia,

• syntezy tłuszczów i olejów przydatnych w różnych gałęziach przemysłu, np. tłuszczów piekarniczych i cukierniczych oraz olejów smażalniczych.

• otrzymania tłuszczów i olejów charakteryzujących się właściwościami prozdrowotnymi, np. synteza triacylogliceroli zawierających podwyższone stężenie sprzężonych dienów kwasu linolenowego (CLA, ang. conjugated linolenic acid) lub kwasu stearydynowego (18:4, n-3),

• otrzymania substytutów tłuszczów i olejów charakteryzujących się pożądanymi cechami fizyko-chemicznymi (substytuty masła kakaowego i oleju jojoba) oraz żywieniowymi (substytut tłuszczu mleka kobiecego).

Modyfikacja tłuszczu mlekowego

Zmniejszające się spożycie tłuszczu mlekowego oraz wysokotłuszczowych produktów mlecznych spowodowało wzrost zainteresowania nowymi metodami produkcji ustrukturyzowanego tłuszczu lub modyfikowanego tłuszczu mlekowego o lepszych właściwościach fizycznych, zmniejszonej kaloryczności i pożądanych walorach smakowo-zapachowych. Enzymatyczna modyfikacja tłuszczu mlekowego najczęściej prowadzona jest metoda interestryfikacji. Produkty tego typu reakcji charakteryzują się tym samym składem kwasów tłuszczowych, zmianie ulega rozmieszczenie kwasów tłuszczowych w trójacyloglicerolach (TAG), co prowadzi do zmian fizycznych właściwości tłuszczu mlekowego.

Procesy enzymatyczne stanowią podstawę najstarszych procesów technologicznych, dotyczących przetwórstwa żywności, tj. fermentacje alkoholowe czy wytwarzanie serów. Jednak o świadomym wykorzystywaniu enzymów można mówić dopiero na przełomie XIX i XX wieku.

Postępy biotechnologii w ostatnich latach pozwoliły na dalsze udoskonalenie zastosowania enzymów w przemyśle spożywczym. Znaleziono rozwiązania dla wielu poprzednio występujących problemów technologicznych i wytyczono drogę dla wielu nowych ekscytujących możliwości. Obecnie zastosowanie znajduje wiele oczyszczonych enzymów. Prawdopodobnie najbardziej uderzającym przykładem korzyści odniesionych dzięki nowoczesnej technologii z zastosowaniem enzymów jest rozkład skrobi do cukrów prostych. Ten proces wymagał gotowania skrobi z obecnością kwasu, wiązał się z dużym nakładem energii i powstawaniem niepożądanych produktów ubocznych tej reakcji. Zastosowanie procesu enzymatycznego nie wymaga specjalnych warunków, oszczędza energię i zapobiega powstawaniu zanieczyszczeń, dlatego stanowi bardzo dobrą alternatywę dla innych procesów.

1. MIKROBIOLOGICZNA SYNTEZA TŁUSZCZÓW (SCF) I BIAŁEK (SCP) : MIKROORGANIZMY, POŻYWKI, TYPY HODOWLI, METODY WYDZIELANIA, OCZYSZCZANIA I UTRWALANIA BIOPREPARATÓW.

MIKROBIOL SYNTEZA TŁUSZCZÓW ( SCF- tłuszcz z pojedynczych kom).

BAKTERIE nie są najlepszym źródłem tłuszczu, bo w suchej substancji rzadko zawierają więcej niż 10% lipidów. Nie wykazują również uzdolnień do syntezy polienowych kw. tłuszcz. W biosyntezie tłuszczu mogą być wykorzystane szczepy należące do gat.: Noceridia opaca, N. petrophilia i N. hydrocarbons, których lipidy zawierają dużo kwasu tetradekanowego.

DROŻDŻE są częściej wykorzystywane do biosyntezy tłuszczu z węglowodanów ze względu na wysoka zawartość tego składnika w biomasie. Tłuszcz z biomasy drożdży może być łatwo ekstrahowany i oczyszczany, a pozostałe jej składniki można stosować w żywieniu zwierząt. Synteza tłuszczu przez drożdże wymaga przygotowania pożywki o małej zawartość azotu i fosforu. Tłuszcz z drożdży zawiera znaczne ilości triacylogliceroli a zwłaszcza symetrycznie dwunasyconego triacyloglicerolu - 66%, co jest typowe również dla tłuszczu z nasion roślin oleistych. Zasadnicza różnica między nimi dotyczy przede wszystkim większej zawartości trójnasyconych acylogliceroli w tłuszczu drożdżowym. Triacyloglicerole drożdży syntetyzow w podłożu z n-tetradekanem, wykazują znaczna ilość kwasów nasyconych w pozycji 2. Poszczególne gatunki drożdży mogą się różnić między sobą wydajnością biosyntezy masy kom, zawartością lipidów i ich składem. Skład kw. tłuszcz lipidów drożdży zależy też od temp, pH, czasu trwania hodowli oraz składu pożywki. Wpływ temp hodowli na skład lipidów drożdży namnaża met okresową nie jest jednoznaczny. Kwasowość czynna środowiska wpływa wyraźniej na skład lipidów niż na ich zawartość w biomasie. Stwierdzono, że zmiana kwasowości hodowli Hansenula polimorpha prowadzonej na etanolu w pH=3-5, zwiększała stopień nienasycenia lipidów w wyniku zmniejszania udziału kw. palmitynowego i zwiększenia zawartości oleinowego i linolowego. Dalsze podwyższenie kwasowości do pH=7 nie wpływ na wartość współczynnika nasycenia ale zmieniało stosunek kwasu oleinowego do linolowego. Wraz z wiekiem komórek zmienia się skład kw. tłuszcz, przy czym stopień ich nienasycenia i ilość kwasów o krótkich łańcuchach są największe w fazie log wzrostu drożdży. Grzyby wykazują duże predyspozycje do biosyntezy tłuszczu. Spośród innych grzybów mikroskopowych największą zawartością lipidów w suchej masie substancji wyróżniały się Mortierella vinacea- 66% i Penicillium lilacinum-56%. Jakość tłuszczu, wydajność substratu i szybkość procesu są lepsze w przypadku drożdży natomiast grzyby mikroskopowe wytwarzają tłuszcz o większej zawartości kwasów polienowych.

GLONY. W optymalnych warunkach glony syntetyzują duże ilości białka i tłuszczu. W celu uzyskania dużej wydajności biosyntezy tłuszczu należy stosować podłoża z minimalna zawartością związków azotowych. Hodowle glonów prowadzi się przy dostępie światła i war napowietrzenia mieszaniną powietrza ( 95%) i CO2 ( 5%). Czas trwania hodowli wynosi w świetle sztucznym 17-80 dni lub 4-12 dni w war oświetlenia natural.

POŻYWKI. Do najczęściej stosowanych pożywek w procesie mikrobiologicznej syntezy tłuszczu należą n-alkany. Stwarzają one możliwość otrzymania lipidów o zmodyfikowanym składzie, zawierających kw. tłuszcz zwykle nie występujące w tłuszczach pochodzeniu mikrobiologicznym, tzn. o krótkich łańcuchach i parzystej liczbie atomów węgla.

Optymalną wydajność biosyntezy tłuszcze osiąga się wówczas, gdy spełnione są nast. warunki:

- stężenia n-alkanów wynosi 10% (v/v);

-inokulum zawiera kom. pobrane podczas lub w końcu ich log fazy wzrostu;

-inokulum stosuje się w ilości 3-10%.

Zwiększanie wydajności syntezy kw tłuszcz jest możliwe do osiągnięcia przez:

- wstępne namnażanie drobnoustrojów na tanim substracie o wymaganym poziomie azotu w stosunku do węgla i przeszczepienie ich na pożywkę zaw n-alkany. W tych war dochodzi do intensywnej syntezy tłuszczu;

- zastosow stabilnych preparatów enzymat utleniających węglowodory. Duża zdolność wykorzystania przez drożdże większości n-alkanów wynika z ich niewielkiej toksyczności.

Od rodzaju użytych węglowodanów oraz od fazy wzrostu drożdży zależy min skład tłuszczu mikroorg. N-alkany o krótkich łańcuchach są przetwarzane do kw. tłuszczowych z jednoczesnym wydłużeniem i ponowną syntezą po B-oksydacji, substrat zaś o dłuższym łańcuchu stanowi podstawę syntezy kwasów tłuszcz długości takiej samej jak łańcuchów z substratu węglowodorowego. Zastosowanie n-alkanów o wydłużonych łańcuchach prowadzi do zwiększ zawartości triacylogliceroli. W odróżnieniu od tego ilość fosfolipidów nie zależy od długości łańcucha węglowodorów, z wyjątkiem bardzo dużej zawartości tego składnika w biomasie C. tropicalis- namnażanej na n-pentadekanie.

Innym substratem często stosowanym do mikrobiologicznej syntezy tłuszcz jest glukoza. Zależnie od rodzaju, drożdże wykaz pewne zróżnicowanie podczas ich namnażania w pożywce z glukozą. Drożdże Crabtree-pozytywne, metabolizujące glukozę przez fermentacje w cyklu glikolitycznym, wykaz słabnącą zdolność kumulacji lipidów i fosfolipidów gdy stęż glukozy w pożywce zwiększa się od 2-10 g/ dm3. Drożdże Crabtree-negatywne, nie zawierające enzymów cyklu glikolitycznego i metabolizujące glukozę przez utlenianie głównie w cyklu pentozofosforanowym wykazują tendencję do kumulacji lipidów w miarę zwiększenia stęż w pożywce. W drożdżach namnażanych w pożywce z glukozą dominują triacyloglicerole typu nasycone -nienasycone-nasycone. Do celów syntezy tłuszczu mikrobiol wykorzystuje się też odpady przemysłu spożywczego lub chemicznego, przede wszystkim cukrowniczego ( melasa), mleczarskiego ( serwatka) i celulozowego. Najbardziej obiecujące wyniki badań nad biosyntezą tłuszczu uzyskano na pożywce z serwatki z zastosowaniem drożdży Apiotrichum curvatum i Trichosporum cutaneum zdolnych do przemiany laktozy w tłuszcz. To wskazuje na możliwość wdrożenia ich do produkcji przemysł tłuszczu. Perspektywy substytucji tradycyjnych tłuszczów roślinnych stwarzają możliwość ich biosyntezy przez drożdże w pożywce z serwatki lub odcieku po jej ultrafiltracji.

Lipidy stanowią ok. 50% s.s biomasy Apiotrichum curvatum i zaw 80-90% triacylogliceroli oraz niewielką ilość wolnych kw. tłuszcz. Wydajność biosyntezy tłuszczu przez ten szczep namnażany w odcieku po ultrafiltracji serwatki, wynosi 15,6 g/dm3 pożywki. Drożdże predysponowane do biosyntezy tłuszczu w optymat warunkach nie zawierają w suchej substancji mniej niż 55-65% lipidów. W ich składzie kw tłuszczowe jako acyloglicerole stanowią ok. 70%. Wydaje się że najbardziej celowa byłaby mikrobiologiczna produkcja substytutów masła kakaowego którego koszt jest bardzo wysoki ze wzg. na wyjątkowy skład, a zwłaszcza dużą zawartość symetrycznie nasyconych triacylogliceroli. Ich wysoki poziom w lipidach Candida 107 sugeruje możliwość otrzymania z tego źródła substytutów masła kakaowego. Biosynteza tłuszczu jest procesem bardziej opłacalnym niż biosynteza białka.

Najkorzystniejsze wydaje się prowadzenie procesu ciągłego w biosyntezie tłuszczu ze wzg. na jego wydajność oraz opłacalność wynikające z dużej produktywności fermentora oraz ekonomicznego wykorzystania źródła węgla. Duże znaczenie przywiązuje się do wykorzystania w przyszłości celulozy jako jednego z najbardziej rozpowszechnionych źródeł węgla w świecie. Rozwiązanie problemu hydrolizy celulozy do cukrów wykorzyst. w procesie fermentacji może stać się podstawą zastosowania tego surowca do biosyntezy tłuszczu i w innych procesach fermentacyjnych.

MIKROBIOL SYNTEZA BIAŁKA SCP (białka z pojedynczych komórek)

Preparaty mikrobiol. z bakterii, drożdzy, grzybów, glonów.

Aby otrzymać preparaty białkowe SCP należy najpierw zniszczyć otoczkę i ściany kom. biomasy drobnoustrojów w celu umożliwienia przyswojenia przez ludzi jej zawartość. Obejmuje to autolizę, plazmolizę, dezintegracje mech, hydrolizę enzymatyczną lub ekstrakcje białek wodą, roztworem NaOH lub NaCL.

Cechy drobnoustrojów stosowanych do biosyntezy białek:

- zdolność do wszechstronnego i maks wykorzystania składników odżywczych;

- odpowiedni skład chemiczny biomasy (wysoka zawartość białka, tłuszczu, węglowodanów, witamin, niska zawartość kw. nukleinowych)

- dobrze rozbudowany kompleks enzymów oddechowych, warunkujący szybki wzrost biomasy

- właściwości syntetyzowania korzystnych substancji o działaniu oligodynamicznym ( Wit i specyficznych, organicznych połączeń związków mineralnych)

- odporność na niekorzystne zmiany składu podłoża i warunków hodowli;

-korzystne cechy technologiczne, ułatwiające dalszą obróbkę technologiczną biomasy (wydzielanie, dezintegracje);

- brak zdolności syntezy substancji toksycznych; -brak zdolności adsorpcji substancji toksycznych lub rakotwórczych z pożywki.

Korzyści wynikające z zastosowania mikroorg. do syntezy białka są następujące:

- mikroorg. w optymalnych warunkach wykazują bardzo szybki wzrost;

- efektywność biosyntezy białka przez zwierzęta, rośliny ( soja) i drobnoustroje ( drożdże) wyraża się stosunkiem 1:81:100000;

- mikroorg. łatwiej podlegają modyfikacji genetycznej w celu nadania ich biomasie cech korzystnych dla człowieka ( np. szybkość wzrostu, poprawy składu aminokwasowego) niż rośliny i zwierzęta;

- mikroorg. zawierają dużą ilość białka odpowiedniej jakości;

- mikroorg. można namnażać w sposób ciągły, co zapewnia dużą wydajność biosyntezy niezależnie od warunków klimatycznych;

- mikroorg. mogą przetwarzać produkty uboczne, surowce odpadowe i ścieki;

- poprzez mianę składu pożywki i parametrów hodowli można zmieniać skład aminokwasowi białka.

MIKROORGANIZMY:

- bakterie 40-70% bialka w ss, Pseudomonas, Chromobacter, Aerobacter, Escherichia, Micrococcus, Bacillus;

- drożdze 40-50% białka w ss; Kluyveromyces marxianus var marxianus, Kluyveromyces marxianus var lactis, Candida kefyr, Trichosporon cutaneum, Candida tropicalis, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae;

- grzyby 10-25% białka, Tricholoma konigi, Zygorhynchus malleri, Penicilium flavoglaucum, Aspergillus oryzae, Oospora, Fusarium; glony 10-60% białka –Chlamydomonas, Chlorella.

Teoretycznie użycie drożdży do otrzymywania SCP jest korzystniejsze od użycia bakterii, gdyż łatwiej je wydzielić z pożywki, ich kom. są większe niż bakterii, zawartość kw. nukleinowych jest mniejsza. Jednak do produkcji SCP na skale przemysłową używa się bakterii ze wzg. na ich szybki wzrost, wysoka zawartość białka w kom., duży wydatek i mniejsze niż drożdży wymagania pokarmowe.

POŻYWKI WYKORZYSTYWANE DO WYTWARZANIA SCP

–węglowodory ciekłe(n-alkany) i gazowe(metan) z zastosow bakterii (Pseudomonas, Bacillus, Methylomonas methanica, M margaritae, Methylococcus capsulatus) -wykorzystują metan, będący głównym składnikiem gazu ziemnego do biosyntezy białka. W czasie hodowli metan zostaje utleniony do metanolu. Rozwijające się bakterie metanowe wymagają dużych ilości tlenu i wydzielają dużą ilość ciepła. Przy użyciu Pseudomonas methanica produkcja 1tony biomasy (40-50%białka) wymaga 4ton metanu i 4ton powietrza. Natomiast wyprodukowanie 1- biomasy przy użyciu Methylococcus capsulatus wymaga metanu. Wydzieloną po hodowli biomasę należy wyekstrahować co zwiększa koszty produkcji. Z węglowodorów ropy uzyskuje się 0,3- białka SCP

–alkohole jak metanol wykorzystywany do produkcji białka SCP. Są to np. bakterie- Methylomonas, Methylococcus, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus oraz drożdze- Candida, Hansenula, pichia, Torulopsis), grzyby- Trichoderma, Paecilomyces, Glicoladium. Niektóre mikroorg wykorzyst etanol do biosyntezy białka np szczep Methylophilus methylotrophus lub bakterie z rodz Pseudomonas. Ze etanolu uzyskuje się do 100kg ss biomasy o zawartości 60% białka

–odpady i ścieki przemysłu krochmalniczego- źródła skrobii z której po biotechn przetworzeniu uzyskuje się preparaty białkowe i enzymatyczne SCP;

-odpady przemysłu rolnego i leśnego zawierające celulozę i ligninę; - melasa, serwatka, ługi posiarczynowe (szczep Paecilomyces variotii).