LABOLATORIUM Z BIOTECHNOLOGII
KINETYKA PROCESÓW FERMENTACYJNYCH
Prowadzący:
dr inż. Celina Kubik
Wykonała:
Karolina Sędkowska
Data wykonania: 14 kwietnia 2008 r.
Ochrona Środowiska
Grupa dziekańska I
Poniedziałek 8.15-12.00
WSTĘP TEORETYCZNY
Kinetyka wzrostu drobnoustrojów jest uwarunkowana zarówno rodzajem drobnoustrojów, dostępnością substratów oraz ilością tlenu, jak i rodzajem procesu. Inaczej przebiega rozwój drobnoustrojów w klasycznym procesie biosyntezy (hodowle okresowe), a inaczej w procesach ciągłych czy półciągłych.
Według klasyfikacji Gadena produkty fermentacyjne podzielono na trzy grupy. Do pierwszej z nich zalicza się produkty syntezowanie podczas wzrostu drobnoustrojów i zanikające w fazie stacjonarnej hodowli. Druga grupa to taka, gdzie gromadzenie produktu jest pośrednio związane ze wzrostem – zachodzi zarówno w komórkach rosnących jak i nierosnących. W trzeciej grupie tworzenie produktu nie jest związane ze wzrostem komórek drobnoustrojów, ma miejsce tylko w komórkach nierozwijających się.
Aby móc wydajnie kierować procesem biosyntez mikrobiologicznej, ważne jest, aby poznać zależność pomiędzy wzrostem szczepu a tworzeniem produktu, fizjologie drobnoustrojów, a także fazowości procesów mikrobiologicznych.
Do badań użyto kwasu cytrynowego wytworzonego przez szczep Aspergillus niger oraz dekstranazy powstałej w wyniku hodowli szczepu Penicillium funiculosum.
Kwas cytrynowy występuje w niewielkich ilościach w większości organizmów żywych, gdyż spełnia ważną rolę w ich metabolizmie - jest ważnym produktem przejściowym w cyklu Krebsa. W większych ilościach występuje w niektórych owocach, np. w cytrynach, w których stanowi nawet do 8% suchej masy. Kwas cytrynowy jest używany jako regulator kwasowości i przeciwutleniacz w przemyśle spożywczym. Sole kwasu cytrynowego - cytryniany - są stosowane jako leki przy niedoborze określonego metalu w organizmie.
Dekstran to polimer glukozy połączonej głównie wiązaniami α-1,6-D-glikozydowymi. Wytwarzany jest przez bakterie kwasu mlekowego. Ma wysoki ciężar cząsteczkowy i jest rozpuszczalny w wodzie. Stosuje się go jako płyn krwiozastępczy. W technologii żywności można by stosować go jako zagęstnik, dzięki któremu można uzyskać półstałą konsystencję produktów. Dekstran nie jest jednak dopuszczony przez FAO/WHO jako dodatek do żywności. Stanowi surowiec do produkcji materiałów chromatograficznych, tzw. żeli dekstranowych. Bakterie zasilające przewód pokarmowy człowieka i zwierząt są zdolne do rozkładu dekstranu, co powoduje szybki wzrost zawartości cukru we krwi oraz glikogenu w wątrobie.
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest poznanie relacji między wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem produktów na przykładzie dwóch procesów biotechnologicznych: biosyntezy kwasu cytrynowego przez Aspergillus Niger oraz dekstranazy przez Penicillium funiculosum.
WYKONANIE ĆWICZENIA
Oznaczenie suchej masy grzybni (Aspergillus Niger i Penicillium funiculosum).
25 ml wyrośniętej, wgłębnej grzybni oddzielono od podłoża na lejku Büchnera, używając do tego celu bibuły filtracyjnej. Następnie pozostałość na lejku przemyto acetonem i wysuszono w suszarce. Suchą masę grzybni zważono przy pomocy wagi analitycznej. Ilość biomasy podano w gramach na 1000 ml płynu pohodowlanego. W tym celu masę odczytaną z wagi pomnożono razy 40. Wyniki przedstawia tabela 1.
Tabela . Ilość biomasy w zależności od czasu hodowli.
Doba | Biomasa [g/l] |
---|---|
Aspergillus Niger | |
2 | 4,7 |
3 | 4,1 |
4 | 5,5 |
5 | - |
6 | 5,9 |
7 | 5,1 |
Oznaczenie kwasowości ogólnej przesączu (Aspergillus Niger)
Pobrano po 2 ml przesączu po oddzieleniu grzybni Aspergillus Niger i miareczkowano 0,1 n roztworem wodorotlenku sodu w obecności fenoloftaleiny. 1 cm3 0,1 n NaOH użytego do miareczkowania przesączu odpowiada 0,0064 g kwasu cytrynowego.
Przykładowe obliczenie dla przesączu po 2 godzinach hodowli:
gdzie:
x – masa wytworzonego kwasu cytrynowego, [g / l];
VNaOH – objętość 0,1 n NaOH użytego do miareczkowania 2 ml przesączu, [ml];
500 – przeliczenie na masę kwasu cytrynowego w 1000 ml płynu po hodowli.
Pozostałe obliczenia dla kwasu cytrynowego wykonano w analogiczny sposób. Wyniki zestawiono w tabeli 2.
Tabela . Ilość otrzymanego kwasu cytrynowego z hodowli Aspergillus niger zależnie od czasu hodowli.
Doba | Kwas cytrynowy [g / l] |
---|---|
I | |
2 | 2,2 |
3 | 8,6 |
4 | 10,9 |
5 | 18,2 |
6 | 33,0 |
7 | 35,2 |
Rysunek . Zmiany stężenia biomasy Aspergillus niger oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w ciągu 7 dni hodowli.
Rysunek . Zmiany stężenia biomasy Aspergillus niger oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w kolejnych dobach hodowli.
Oznaczenie aktywności dekstranazy (Penicillium funiculosum).
Oznaczenie aktywności dekstranazy rozpoczęto od wykonania rozcieńczeń przesączu po oddzieleniu biomasy Penicillium funiculosum.
Tabela . Wartości rozcieńczeń cieczy pohodowlanej w zależności od czasu hodowli szczepu Penicillium funiculosum.
Doba | Rozcieńczenie |
---|---|
2 | 200 |
3 | 400 |
4 | 400 |
5 | 600 |
6 | 600 |
Do probówek wprowadzono po 0,5 ml roztworu dekstranu 110 oraz 0,5 ml odpowiednio rozcieńczonej cieczy pohodowlanej. Reakcję prowadzono w temperaturze 45 0C przez dokładni 10 minut. Po upływie tego czasu do mieszaniny reakcyjnej wprowadzono 1 ml odczynnika miedziowego i umieszczono całość na kolejne 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie roztwory schłodzono i dodano po 1 ml odczynnika Nelsona. Barwne mieszaniny rozcieńczono zależnie od intensywności barwy (dopełniano do 10 ml, 25 ml lub 50 ml objętości). W między czasie wykonano próbę kontrolną, analogicznie jak próby właściwe, lecz zamiast cieczy pohodowlanej w probówce umieszczono 0,5 ml wody destylowanej. Absorbancję zmierzono przy długości fali 520 nm wobec próby kontrolnej.
Na podstawie krzywej wzorcowej obliczono ilość μg izomaltozy w 1 ml badanego roztworu. Przykładowe obliczenie dla roztworu, który zawierał ciecz po 2 dobach hodowli szczepu Penicillium funiculosum:
0,1 – 325 [μg/ml]
0,01 – A [μg/ml]
A = 32,5 [μg/ml]
Dalej obliczono aktywność dekstranazy korzystając ze wzoru:
gdzie:
X – aktywność dekstranazy, [J/ml];
A – ilość μg izomaltozy w 1 ml badanego roztworu, odczytana z krzywej wzorcowej, [μg/ml];
2 – rozcieńczenie enzymu w mieszaninie reakcyjnej;
R – rozcieńczenie cieczy pohodowlanej;
342 – mikromol izomaltozy;
10 – czas trwania reakcji enzymatycznej, [min].
Za 1 jednostkę dekstranazy (1 J) przyjmuje się ilość enzymu, która z dekstranu 110 uwalnia cukry redukujące w ilości równoważnej jednemu mikromolowi izomaltozy w ciągu 1 minuty, w temperaturze 50 0C, w pH 5,4.
Przykładowo:
Pozostałe obliczenia wykonano w analogiczny sposób. Wyniki zestawiono w tabeli 4.
Tabela . Aktywność dekstranazy w zależności od czasu hodowli szczepu Penicillium funiculosum.
Doba | Aktywność dekstranazy [J/ml] |
---|---|
I | |
2 | - |
3 | - |
4 | - |
5 | - |
6 | - |
Rysunek .Zmiany stężenia biomasy Penicillium funiculosum oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w ciągu 7 dni hodowli.
Rysunek .Zmiany stężenia biomasy Penicillium funiculosum oraz zmiany stężenia kwasu cytrynowego w kolejnych dobach hodowli.
WNIOSKI
Patrząc na Rysunek 1 oraz Rysunek 3 zauważyć można, że tworzenie produktu ma miejsce zarówno podczas namnażania się komórek drobnoustrojów jak i wówczas, kiedy wzrost biomasy ustabilizuje się. Dotyczy to zarówno hodowli szczepu Aspergillus niger jak i Penicillium funiculosum. Zgodnie z tym stwierdzeniem badane procesy biosyntezy zaliczyć należy do drugiej grupy według klasyfikacji Gadena. Porównując te obserwacje z danymi literaturowymi obserwuje się błędną analizę w stosunku do produkcji dekstranazy – powszechnie zaliczana jest ona do trzeciej grupy Gadena.
W hodowli Penicillium funiculosum obserwuje się maksymalne stężenie biomasy w trzeciej dobie trwania procesu (Rysunek 3). Patrząc na dynamikę wzrostu biomasy Aspergillus niger (Rysunek 1) nie dostrzega się takiego maksimum – stężenie biomasy wzrasta w tym przypadku podczas trwania całego procesu.
Obserwując Rysunek 2 i Rysunek 4 wnioskuje się, że maksymalny przyrost biomasy Aspergillus niger oraz Penicillium funiculosum ma miejsce od początku trwania hodowli do drugiej doby, a następnie przyrost ten maleje. Produkcja kwasu cytrynowego jest najbardziej wydajna w szóstej dobie biosyntezy, a produkcja dekstranazy w trzeciej.