STERYLIZACJA I DEZYNFEKCJA

1. Co to jest sterylizacja, dezynfekcja i podzielić metody sterylizacji

Sterylizacja - wyjaławianie, oznacza proces prowadzący do zniszczenia wszystkich drobnoustrojów: bakterii i ich przetrwalników, grzybów i ich zarodników, riketsji, mykoplazm i wirusów, znajdujących się w wyjaławianym materiale lub środowisku. Można tego dokonać mechanicznie, fizycznie lub chemicznie. Prawidłowo wysterylizowany materiał jest jałowy - nie zawiera żadnych żywych drobnoustrojów (w tym wirusów) oraz ich form przetrwalnikowych.

• Sterylizacja termiczna

• Wyżarzanie lub spalanie

• Proces UHT

• Sterylizacja suchym gorącym powietrzem

• Sterylizacja nasyconą parą wodną pod ciśnieniem

• Tyndalizacja

• Sterylizacja przez sączenie

• Sterylizacja promieniowaniem

• jonizującym

• UV

• mikrofalowym

• Sterylizacja gazami

• tlenkiem etylenu

• formaldehydem

• ozonem

• Sterylizacja roztworami środków chemicznych

• aldehydu glutarowego

• kwasu nadoctowego

• Sterylizacja plazmowa

Dezynfekcja - odkażanie, jest to proces prowadzący do zniszczenia lub usunięcia wegetatywnych form drobnoustrojów, przeważnie nie niszczący przetrwalników. Ma na celu maksymalne zmniejszenie liczby drobnoustrojów. Zabieg ten nie zapewnia wyjałowienia środowiska. Dotyczy przedmiotów i powierzchni użytkowych.

1. Warunki sterylizacji w suszarce.

Zamknięte komory z termoregulacją, stosowane temperatury 160-200^oC utrzymywane w czasie od kilkunastu minut do 2 godzin.

Wyróżniamy dwa typy sterylizatorów:
1. Z wymuszonym obiegiem powietrza; minimalny czas sterylizacji wynosi 160 ⁰  C -120 minut, 180 ⁰ C -30 minut.
2. Z naturalnym obiegiem powietrza ; minimalny czas sterylizacji wynosi 160 ⁰ – 150 minut, 180 ⁰ C- 45 minut.

- Temp ^oC 121 – Czas – 12 h

- Temp ^oC 140 – Czas – 3 h

- Temp ^oC 150 – Czas – 150 min

- Temp ^oC 160 – Czas – 120 min

- Temp ^oC 170 – Czas – 60 min.

Wentylatorki ułatwiają mieszanie się powietrza ciepłego i chłodniejszego w komorze dając wymuszony obieg powietrza.

Tą metodą można sterylizować: szkło, porcelanę, metale.

Kontrola procesu:
- fizyczna- kontrola parametrów sterylizacji- ciśnienia, temperatury, czasu. Tym samym określamy jedynie czy urządzenie działa prawidłowo, nie można jednak określić czy proces wyjaławiana jest skuteczny.
- chemiczna- użycie wskaźników chemicznych w postaci pasków, taśm, groszków, które w warunkach koniecznych do zabicia drobnoustrojów zmieniają barwę.
- biologiczna – opiera się na działaniu czynnikami sterylizującymi na żywe, wysuszone i wysoce odporne na temperaturę zarodniki niechorobotwórczych laseczek. Zabicie zarodników, oznacza, że zostały zabite wszystkie drobnoustroje zawarte w sterylizowanym materiale. Tylko tym sposobem dowiadujemy się, o osiągnięciu wyjałowienia materiału.

1. Opisać sterylizację nasycona parą wodną

Nasycona para wodna powoduje gwałtowną hydrolizę, denaturację i koagulację enzymów i struktur komórkowych. Wyjaławianie jest rezultatem zarówno wysokiej temperatury, jak i aktywności cząsteczek wody. Zwykle stosowane temperatury sięgają 112–134 °C, zaś czas wyjaławiania wynosi 5-30 minut. Aby osiągnąć taką temperaturę pary, podnosi się ciśnienie o wartość od jednej atmosfery w górę. Wzrost ciśnienia o jedną atmosferę powoduje podniesienie temperatury wrzenia wody o około 10 stopni.

Ciśnienie	Nadciśnienie	Temp.	Czas
1 atm.	0 atm.	100^OC	-
1,5 atm.	0,5 atm.	112^OC	30 min
2 atm.	1 atm.	121^OC	15 min
3 atm.	2 atm.	134^OC	5 min

Wyjaławianie parą wodną przeprowadza się w autoklawach (aparatach ciśnieniowych), wyposażonych w przyrządy do pomiaru temperatury i ciśnienia oraz odpowiednie elementy zabezpieczające (zawory).

Proces sterylizacji parą wodną składa się z następujących etapów:

• Czas nagrzewania – ciepło przenika wówczas w głąb materiału. Czas ten jest różny dla różnych obiektów, dlatego np. różne rodzaje pojemników należy wyjaławiać oddzielnie.

• Czas wyrównania temperatury – para wodna oddaje swoje ciepło utajone materiałowi aż do chwili, gdy temperatury wyrównają się i wymiana ciepła ustąpi.

• Czas wyjaławiania – właściwa sterylizacja, podczas której należy utrzymywać zadaną temperaturę przez stosowny okres. Zwykle dla bezpieczeństwa wydłuża się go o połowę.

• Czas schładzania autoklawu – czas od chwili przerwania ogrzewania do momentu, gdy manometr wskaże, że ciśnienie wewnątrz autoklawu jest równe atmosferycznemu.

Nasyconą parą wodną można wyjaławiać roztwory wodne, odzież ochronną, bieliznę operacyjną, wyroby gumowe, opatrunki, narzędzia chirurgiczne, szkło laboratoryjne. Materiały należy zabezpieczyć przed powtórnym skażeniem.

1. Sterylizacja radiacyjna

Stosuje się najczęściej promieniowane UV i jonizujące.

Promieniowanie UV - wyjaławianie polega na naświetlaniu materiału promieniowaniem ultrafioletowym. Promieniowanie to zmienia strukturę kwasów nukleinowych, dlatego najsilniej działa na formy wegetatywne drobnoustrojów. Używa się fal o długości 210–328 nm (najbardziej aktywne jest promieniowanie o długości fali 254 nm), emitowanych np. przez lampy rtęciowe albo lampy UV-FAN.

Promieniowanie ultrafioletowe nie przenika w głąb płynów i ciał stałych, jest absorbowane przez szkło i tworzywa sztuczne. Dlatego też wyjaławia się w ten sposób na ogół tylko powietrze lub powierzchnię przedmiotów. Jest to metoda pomocnicza.

Sterylizacja promieniowaniem jonizującym przebiega zarówno w sposób bezpośredni, jak i pośredni, przez produkty radiolizy wody. Źródłem tego promieniowania mogą być na przykład izotopy emitujące promieniowanie gamma – zwykle używa się izotopu kobaltu ⁶⁰Co. Sterylizacja radiacyjna (radapertyzacja) może też być prowadzona z wykorzystaniem wiązki elektronów lub promieniowania X. Jest to metoda stosowana tylko w przemyśle.

Metodę tę stosuje się do wyjaławiania materiałów termolabilnych – wyrobów medycznych jednorazowego użytku, produktów leczniczych, kosmetyków oraz materiałów transplantacyjnych.

1.  jak działa prom UV na bakterie

Sterylizacja radiacyjna promieniami UV

Silna aktywność bakteriobójcza (największa – fale o długości 250 – 260 nm)

• Najbardziej wrażliwe są formy wegetatywne bakterii, znacznie mniej przetrwalniki i wirusy, najmniej pleśnie

• Promieniowanie to zmienia strukturę kwasów nukleinowych.

1. sterylizacja tlenkiem etylenu i jej metoda kontroli

• Tlenek etylenu ma właściwości bakteriobójcze i wirusobójcze– niszczy formy wegetatywne bakterii, grzyby i przetrwalniki (w wyższych stężeniach)

• Ma działanie alkilujące

• Sterylizację przeprowadza się w specjalnych aparatach, w których uzyskuje się stężenie 400 – 1000 mg/l przy wilgotności względnej 30-60% w temp. 50 – 60^oC. czas ekspozycji w tych warunkach wynosi 2,5 – 12h.

• Gaz ten ma zdolność przenikania i wnikania w głąb tworzyw, jest gazem trującym i bezwonnym. Dlatego też po zakończeniu sterylizacji TE, materiały sterylizowane muszą być poddane procesowi degazacji, jej czas zależy od rodzaju materiału i wynosi 2 – 18 dni.

• Czas spontanicznej desorpcji wynosi od 7 do 30 dni, można go znacznie skrócić wymuszając obieg jałowego powietrza w pomieszczeniach do sterylizacji.

• Z powodu złożoności procesu sterylizacji tlenkiem etylenu norma zaleca rutynową kontrolę każdego cyklu sterylizacji wskaźnikami biologicznymi

  • Sporal A

  • Sporal S

1. Testy biologiczne do kontroli sterylizacji:

Sporal A – krążek bibuły nasycony zarodnikami Bacillus stearothermophilus, kontrola autoklawu.

Sporal S – zawiera zarodniki Bacillus subtilis, kontrola sterylizacji suchym, gorącym powietrzem.

Po zakończeniu sterylizacji testy przesyła się do pracowni mikrobiologicznej, gdzie są inkubowane na podłożach płynnych: Sporal A – 7dni w temp. 56⁰C, a Sporal S - 7dni w temp. 37⁰C

Nowszymi sposobami są testy biologiczne w postaci fiolek plastikowych, w których znajduje się skrawek bibuły, zawierający zarodniki laseczek oraz pojemniczek z cienkiego szkła, z podłożem bakteriologicznym. Po wyjęciu ze sterylizatora, silnie uciska się fiolkę do momentu uwolnienia podłoża, które zalewa skrawek bibuły. Fiolkę umieszcza się w inkubatorze i po upływie 24-48 h, poprzez zmianę zabarwienia podłoża odczytuje wynik kontroli.

1. Cechy dobrego środka dezynfekującego.

• Szeroki zakres działania:
  B - bakteriobójczy, Tbc - prątkobójczy, F - grzybobójczy, V - inaktywujący wirusy, S - sporobójczy

• Szybkie działanie, małe stężenie

• Szybka i całkowita degradacja

• Trwałość koncentratu i roztworu użytkowego

• Dobra rozpuszczalność w wodzie

• Wysoka tolerancja na twardą wodę i substancje organiczne zawarte w dezynfekowanym materiale

• Brak działania korodującego

• Brak oddziaływania na skórę i drogi oddechowe

• Niska cena

1. Trzy związki nieorganiczne dezynfekujące - zastosowanie i moc.

• Ozon – dezynfekcja wody w basenach

• Nadtlenek wodoru – odkażanie ran, zdejmowanie bandaży, płukanie gardła i jamy ustnej – 3% roztwór wodny

• Chlor – wyjaławianie wody pitnej – działa bakteriobójczo już w stężeniu 2x10^-6 mol/dm³

1. 3 gr. środków powodujących denaturację białek + przykład ???

Związki srebra – np. azotan srebra

IV – rzędowe związki amonowe – np. Sterinol

Alkohole – np. etanol 70^%, izopropanol 50-70%

1. Alkohole, aldehydy jako śr dezynfekujące - funkcja, zastosowanie, działanie, przykłady

a) Alkohole (etanol 70%, propanol i izopropanol)- wraz ze wzrostem długości łańcucha alkoholowego rośnie aktywność przeciwustrojowa.
Mechanizm działania: denaturacja białek drobnoustrojów. Działają szybko na wegetatywne postaci bakterii, mykobakterie, niektóre grzyby oraz wirusy z otoczka lipidową. Nie niszczą przetrwalników, słaba skuteczność przeciwko wielu grzybom i wirusom bezotoczkowym. Wchodzą w skład preparatów do higienicznej i chirurgicznej dezynfekcji rąk oraz skóry (np. przed iniekcjami).

b) Aldehydy używane są jako środki sterylizacyjne albo dezynfekcyjne wysokiego poziomu. Mechanizm działania: alkilacja terminalnych reszt sulfhydrylowych, karboksylowych i aminowych białek komórkowych.

-Formalina powstaje po rozpuszczeniu oparów formaldehydu w wodzie. Niskie stężenia działają bakteriostatycznie, a wyższe są w stanie zabić wszystkie rodzaje drobnoustrojów. Formaldehyd stosowany z etanolem jest bardziej skuteczny. Toksyczny.

-Aldehyd glutarowy jest aktywny w stosunku do form wegetatywnych bakterii, wirusów, przetrwalników i grzybów. Bardziej aktywny w pH zasadowym. Mniej toksyczny wobec żywej tkanki od formaldehydu.

1. 4 nazwy środków dezynfekujących skórę i błony śluzowe: woda utleniona, nadmanganian potasu, azotan srebra, chloramina (0,05-0,25% r-r do płukania jamy ustnej, pęcherza moczowego, 0,25-0,5%r-r do odkażania rąk)

2. 3 grupy środków powodujących uszkodzenie błon cytoplazmatycznych i po 1 przykładzie

Krótko

Biguanidy – chlorheksydyna – np. w Manusanie.

Czwartorzędowe związki amoniowe – Cetylpirydynum chlorek, Benzalkonium chlorek. Np. Sterinol

Związki chloru, działanie utleniające na białka błony cytoplazmatycznej – Chloramina (sprawdzić!)

1. Tyndalizacja.

Metoda polega na ogrzewaniu, np. pożywek w temp 80⁰C przez 2 godziny w ciągu trzech kolejnych dni. W przerwie między jednym a drugim ogrzewaniem sterylizowane pożywki przetrzymuje się w temp optymalnej dla bakterii (37⁰C). w ten sposób w czasie dwugodzinnego ogrzewania zniszczeniu ulegają formy wegetatywne. W czasie inkubacji w temp 37⁰C znajdujące się w pożywce zarodniki przechodzą w formy wegetatywne, które są niszczone podczas następnego dwugodzinnego ogrzewania w temp 80⁰C.

1. Filtracja - opisać ogólnie, przykłady, metoda kontroli

Filtracja- bakterie z płynów zawierających, substancję ulegającą rozkładowi w temp.powyżej 60⁰C usuwa się za pomocą filtrów.

W przeszłości używano filtrów:
-Berkefelda z ziemi okrzemkowej
-Chamberlanda z porcelany nieglazurowanej
-Seitza azbestowe płyty w metalowej oprawie
- szklane ze szkła spiekanego

Wszystkie te sączki mają odpowiednie oznaczenia określające wielkość zatrzymywanych bakterii. Przed użyciem filtr osadza się w kolbie próżniowej i taki zestaw sterylizuje w autoklawie.

Kontrola działania filtrów bakteryjnych polega na przesączeniu przez nie zawiesiny bakterii o małych rozmiarach Serratia marcescens (pałeczka krwawa) i wysianiu na pożywkę agarową. Brak wzrostu oznacza, że filtr działa dobrze, wzrost-wadliwość. Filtry bakteryjne nie zatrzymują wirusów.

Obecnie stosowane są filtry membranowe wykonane z nieczynnych biologicznie estrów celulozy, w odmianach o różnej wielkości por. Produkowane są filtry membranowe, które przy użyciu odpowiednich urządzeń dostosowuje się do strzykawek i filtrowany materiał może być przetłoczony przez filtr przy użyciu tłoczka strzykawki. Używane są także filtry umieszczone w metalowych oprawach. Filtry te zatrzymują wirusy.

1. Higieniczne mycie rąk – dezynfekcja rąk. Powierzchnię rąk i nadgarstków myje się pod bieżącą wodą z dodatkiem detergentu i środka odkażającego przez co najmniej 20-30 sekund, energicznie wcierając wytworzoną pianę. Następnie ręce należy spłukać pod bieżącą wodą przez 10-15s i wysuszyć za pomocą jednorazowego ręcznika papierowego. Można też tak dezynfekować ręce w rękawiczkach. Zabieg powoduje 1000-krotną redukcję liczby drobnoustrojów.
   Najbardziej skuteczne środki do tego mycia rąk: detergenty z dodatkiem poliwinylopirolidonu lub alkoholowe roztwory środków dezynfekujących z jodem lub chlorheksydyną.
        

2. Metody kontroli czystości powierzchni płaskich i rąk + normy – Z NETA????

Badanie czystości powierzchni

1. Badanie czystości powierzchni metodą szablonową

2. Badanie czystości powierzchni z zastosowaniem płytek kontaktowych (Count-Tact)

3. Badanie czystości powierzchni metodą wymazów z powierzchni nie ograniczonej

Szablonem

4.Badanie czystości powierzchni z zastosowaniem barwnych pasków testowych

HY-RISE^TM

Badanie czystości rąk

Pobranie próby do badań.

• do wykonania oznaczenia potrzebne są 4 jałowe tampony, kolbka z 40cm³ jałowego płynu Ringera, pinceta

• tampon chwyta się jałową pincetą, moczy w płynie, odciska nadmiar cieczy o wewnętrzną ściankę naczynia i wyciera powierzchnię wewnętrzną dłoni, przestrzenie między palcami oraz powierzchnię paznokci

• czynność powtarza się suchym tamponem

• w ten sam sposób próby pobiera się z drugiej dłoni

• tampony wrzuca się do kolbki z płynem i wytrząsa 5 minut

• wykonuje się posiewy

Oznaczenia:

• Liczba bakterii tlenowych mezofilnych - posiew wgłębny po 1 cm³ popłuczyn do sterylnej płytki Petriego na agarze odżywczym

• Obecność gronkowców koagulazododatnich - posiew po 1 cm³ popłuczyn w 3 powtórzeniach do pożywki Giolitti-Cantoni

• Obecność pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae posiew po 1 cm3 popłuczyn w 3 powtórzeniach do zbuforowanej wody peptonowej, potem w bulionie EE

BAKTERIE

1. Podział bakterii ze względu na zapotrzebowanie na tlen

• Bezwzględne tlenowce - rosną i rozmnażają się tylko w obecności normalnego stężenia tlenu w powietrzu. Przy braku tlenu w odpowiednim stężeniu ich wzrost zostaje zahamowany. Czerpią energię drogą oddychania tlenowego.

• Bezwzględne beztlenowce - mogą rosnąć i rozmnażać się tylko w warunkach beztlenowych, na zredukowanej powierzchni pożywki agarowej. Zawartość tlenu nie może przekraczać 0,5%. Przekroczenie tej wartości powoduje natychmiastowe zahamowanie rozwoju bakterii. Bakterie te nie posiadają cytochromów, ani katalazy. Czerpią enegię drogą beztlenową.

• Względne beztlenowce - mogą rosnąć i rozmnażać się przy ciśnieniu cząsteczkowym tlenu wynoszącym 2-8% i nie tracą żywotności przez 60-90 minut działania na nie tlenu. Zawierają pojedyncze układy cytochromowe i katalazę. Czerpią energią z odddychania tlenowego i beztlenowego.

• Beztlenowce tolerancyjne (mikroaerofile) - do oddychania wymagają tlenu, ale rosną najlepiej w niższym stężeniu tlenu niż w atmosferze. Posiadają mechanizmy oksydoredukcyjne.

• Bakterie aerotolerancyjne (względne tlenowce) - są to bakterie beztlenowe, które potrafią przeżyć przy obecności tlenu atmosferycznego.

1. Wymień formy kuliste bakterii + przykłady.

• Ziarniaki (Coccidia)

• Dwoinki (Diplococcus)- streptococcus pneumoniae

• Czworaczki- Micrococcus tetragenes

• Sześcianki- Sarcina

• Paciorkowce - Streptococcus pyogenes

• Gronkowce (Staphylococcus)- Staphylococcus aureus

1.   Podział spiralnych form bakterii

Krętki (Spirochetae) - (Spirochaeta, Critispira, Treponema, Leptospira, Borrelia)

• Treponema pallidum (krętek blady, zarazek kiły)

• Borellia burgdorferi (krętek wywołujący boreliozę)

Śrubowce (Spirillum)

• Spirillum minus (śrubowiec mniejszy, wywołuje szczurzą gorączkę)

Przecinkowce (Vibrio)

• Vibrio cholerae (przecinkowiec cholery)

1. formy podłużne bakterii, + 1 przykład

• Pałeczki – coccobacillus - Escherichia coli

• Laseczki – Bacillus - Bacillus anthracis

1. Bakterie cylindryczne - wymienic (pl, łac.)
   

Formy cylindryczne bakterii (jedna z osi przestrzennych jest co najmniej dwa razy dłuższa od dwóch pozostałych):

• pałeczki – Bacterium (Gram ujemne, nie wytwarzają zarodników) – Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Proteus mirabilit, Pseudomonas aeruginosa

• laseczki – Bacillus (Gram dodatnie, wytwarzają zarodniki) – Clostridum tetani, Bacillus anthracis

• maczugowce – Corynebacterium – Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium michiganense, C. poinsettiae, C. fascians, C. mediolaneum

• prątki – Mycobacterium- Mycobacterium tuberculosis

• wrzecionowce – Fusobacterium

• formy nitkowate - Chlamydiobacteriales

1. Wymień rodzaje fimbrii.

• Zwykłe

• Płciowe

fimbrie i jakie rodzaje

Otóż fimbrie zwane również pili to nitkowate akcesoria bakterii widoczne wyłącznie w elektronowym mikroskopie. Występują głównie u bakterii Gram (-), zbudowane są z białka. Są immunogenem. Komórka może nie mieć fimbrii lub mieć je w liczbie od 1 do kilkuset. Wyróżniamy dwa typy fimbrii. Zwykłe i płciowe.

• Fimbrie zwykłe zbudowane są z białek należących do lektyn, które rozpoznają i wiążą swoiste receptory polisacharydowe w komórkach gospodarza (adhezja). Fimbrie należą do wyznaczników chorobotwórczości bakterii. Wykształcenie fimbri podlega genom znajdującym się w chromosomie.

• Fimbrie płciowe. Ich wykształcenie podlega genom z plazmidów. Umożliwiają funkcjonowanie komórki jako dawcy plazmidowego genu przekazywanego komórce biorcy w procesie koniugacji. Są wówczas wyróżniane komórki F+ (męskie) i F-. Fimbrie płciowe zawierają kanał dostatecznie szeroki by przenosić DNA bakteriofagowy, transpozonowy, plazmidowy, chromosomalny.

1. Plazmidy – są to koliste cząsteczki DNA, które w cytoplazmie ulegają autonomicznej replikacji (niezależnej od nukleotydu). Plazmidy determinują cechy, które zwiększają możliwość przeżycia komórek bakteryjnych w określonych warunkach środowiskowych.

2. Rzęski – są to długie, puste w środku filamenty, których długość jest zwykle kilka razy większa od długości komórki. Rzęski zbudowane są z białka flageliny. Mają budowę spiralną. Rzęski wychodzą z błony komórkowej i przymocowane są za pomocą haczyków. Białko rzęskowe (flagelina) jest immunogenem (antygen H).

Rzęski odpowiedzialne są za ruchliwość wykazywaną przez niektóre gatunki bakterii. Lokalizacja rzęsek jest cechą charakterystyczną dla rodzaju bakterii. Wyróżniamy bakterie:

• wokołorzęsne – mają rzęski na całej powierzchni komórki

• jednorzęsne – mają tylko jedną rzęskę

• czuborzęsne – rzęski skupione na jednym z dwóch biegunów

• dwurzęsne – mają dwie rzęski, po jednej na każdym biegunie komórki

1. zakres temp dla bakterii, chodzi o mezofile, termofile itd...

Bakterie psychrofilne- najlepiej rosną w temp. 0-10⁰C
Bakterie mezofile- najlepiej rosną w temp. 20-40⁰C
Termofilne- najlepiej rosną w temp. 50-60⁰C

1.   budowa peptydoglikanu

Cząsteczka peptydoglikanu jest duża, zbudowana z długich łańcuchów polisacharydowych, które są połączone w sieci za pomocą mostków peptydowych. Każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z disacharydów: N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomuraminowego. Każda cząsteczka kwasu N-acetylomuraminowego jest zazwyczaj połączona z tetra peptydem, który wiąże kwas N-acetylomuraminowy jednego łańcucha glikanu z tetra peptydem kwasu N-acetylomuraminowego leżącego obok łańcucha. Dzięki temu powstaje sztywna struktura otaczająca protoplast. Peptydy wiążą się zawsze za pośrednictwem tego samego aminokwasu, którym jest albo glicyna albo L-alanina. L-alanina łączy się wiązaniem peptydowym z grupą karboksylową kwasu N-acetylomuraminowego. Drugim aminokwasem jest często kwas D-glutaminowy. Trzecim aminokwasem u bakterii G-(+) jest najczęściej lizyna, a u bakterii G-(-) – kwas dwuaminopimelinowy, u kilku gatunków bakterii trzecim aminokwasem jest ornityna. Jako czwarty aminokwas występuje zawsze D-alanina. Mostki peptydowe łączą wolne grupy karboksylowe D-alaniny jednego łańcucha glikanu z wolnymi grupami aminowymi trzeciego aminokwasu leżącego obok.

1. budowa sciany kom bakterii G-(-)

• Ściana komórkowa bakterii G-(-) składa się z trójwarstwowej pokrywy, która otacza cienką warstwę peptydoglikanu, oddzieloną od błony cytoplazmatycznej przestrzenią periplazmatyczną. Jest gruba (20-80nm).

Wyróżnia się 4 główne składniki ściany komórkowej:

• Peptydoglikan – w obrębie błony zewnętrznej (60%-100% ściany kom)

• Fosfolipidy

• Białka

• Glikolipid – zwany lipopolisacharydem (LPS)

u większości bakterii Gram-dodatnich występują kwasy tejchojowe: rybitolowy i glicerolowy, których rola nie jest znana.

1. Opis ściany komórkowej u G –

Wykazuje bardziej złożoną budowę chemiczną:
- warstwa mureiny jest cienka- stanowi ok.5-10% masy całej ściany komórkowej
- peptydoglikan tworzy sieć dwuwymiarową
- nie zawiera kwasów tejchojowych
- posiada charakterystyczną, dodatkową strukturę, zwaną błoną zewnętrzną, która leży nad warstwą peptydoglikanu i składa się z:
1) fosfolipidów, które podobnie jak w błonie cytoplazmatycznej, tworzą dwie warstwy
2) białek,
3) lipopolisacharydu= LPS = endotoksyny, zbudowanej z trzech regionów:
- lipidu A
- oligocukru rdzeniowego
- wielocukru o swoistości antygenowej O
Błona zewnętrzna wiąże się z peptydoglikanem przez lipoproteinę mureinową, która pełni rolę strukturalną, polegającą na utrzymaniu na miejscu innych białek błony zewnętrznej.

1. Otoczki i ich funkcje

Otoczki to substancje o charakterze polimerów, które przylegają do zewnętrznej powierzchni ściany komórkowej i tworzą grubą, wyraźną warstwę. Najczęściej zbudowane są z polisacharydów, czasami z poliaminokwasów. Otoczka chroni bakterię przed wysychaniem, fagocytozą, infekcją przez bakteriofagi, niekorzystnymi warunkami środowiska, zwiększa jej chorobotwórczość (jest antygenem), może być nieprzepuszczalna dla niektórych antybiotyków.

1. Endotoksyny - co to i rola w zakażeniach człowieka

Lipopolisacharyd ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych może być odpowiedzialny za wiele objawów chorobowych wywołanych przez te bakterie, obserwowanych w czasie zakażeń u ludzi. Do najpoważniejszych z nich należy wstrząs endotoksyczny (wstrząs septyczny).
Toksyny lipo polisacharydowe odznaczają się podobną strukturą i podobnym mechanizmem działania, bez swoistego zróżnicowania w zależności od szczepów bakterii Gram-ujemnych skąd pochodzą.
Efekty biologiczne działania endotoksyn mogą być wielokierunkowe w zależności od dawki.
Do efektów biologicznych działania endotoksyn bakterii Gram-ujemnych należą:

• - wstrząs endotoksyczny

• - miejscowe reakcje skórne

• - gorączka (pirogenność)

• -leukocytoza

• - obniżenie ciśnienia krwi

• - agregacja płytek krwi

Nawet znikome, tj. nanogramowe ilości endotoksyny, które mogą być w wyjałowionych roztworach przygotowanych do wlewów dożylnych, mogą wywołać u pacjentów po ich podaniu efekt pirogenny. W związku z tym płyny infuzyjne powinny być badane na obecność endotoksyny.

1. Polimorfizm –jest to zdolność bakterii do zmiany tożsamości strukturalnej. Polimorfizm oznacza występowanie różnic w DNA populacji. Polimorfizm genowy oznacza występowanie różnorodnych odmian danego genu, co w konsekwencji może prowadzić do różnic w budowie i działaniu białka kodowanego przez ten gen. Polimorfizm funkcjonalny - zjawisko występowania w obrębie populacji organizmów określonego gatunku (pomiędzy którymi zachodzi swobodny przepływ genów) odmiennych form różniących się funkcjonalnie lub strukturalnie. Polega na tworzeniu się hierarchii i podziału funkcji w obrębie populacji. [internet]

Co to są kolonie polimorficzne i opisać atypowe. Jak powstają?

Polimorfizm, pleomorfizm, wielopostaciowość - zjawisko występowania w obrębie populacji organizmów określonego gatunku odmiennych form różniących się funkcjonalnie lub strukturalnie. Pleomorficzna kolonia bakterii składa się z komórek o różnych kształtach.

Pleomorfia jest najczęściej spowodowana czynnikami fizycznymi lub chemicznymi, działającymi na namnażającą się populację bakterii. Może to być temp. niższa lub wyższa od optymalnej. Pleomorfizm bakterii czy grzybów jest odpowiedzią adaptacyjną na warunki środowiska w którym żyją.
Jeśli odchylenia w kształtach leżą jeszcze w granicach fizjologicznych, wówczas mówi się o atypowych kształtach bakterii.

1. Pleomorfizm (różnokształtność) – populacja bakterii składających się z komórek o różnych kształtach. Pleomorfia bakterii może być spowodowana czynnikami fizycznymi lub chemicznymi działającymi na namnażającą się populację bakterii. Czynnikiem takim może być np. temp niższa lub wyższa od optymalnej.

Jeśli odchylenia w kształtach leżą jeszcze w granicach fizjologicznych wtedy mówi się o atypowych kształtach bakterii. Gdy kształty znacznie odbiegają od norm fizjologicznych mówimy o inwolucji lub degeneracyjnych kształtach bakterii. Formy te powstają, gdy wyczerpią produkty odżywcze lub działają na nie silne środki przeciwbakteryjne.

1. Bakterie mezofilne – najlepiej rosną w temp. 20-40⁰C. Temp. minimalna 10⁰C, maksymalna 45⁰C, optymalna 30-37⁰C. W tej grupie znajdują się bakterie chorobotwórcze dla człowieka.

2. Utrwalanie – ma na celu zabicie bakterii, przyklejenie ich do szkła i przygotowanie do barwienia (denaturacja białek). Najczęściej utrwala się preparaty w płomieniu palnika przez trzykrotna krótkie wprowadzenie go w gorący stożek palnika. Preparaty po ostudzeniu można zabarwić jedną z metod.

3. Szczep – w mikrobiologii, populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku lub odmiany, wyróżniająca się określonymi cechami.

4. Hodowla bakterii – rodzaj hodowli komórkowej, polegający na utrzymywaniu kultur wybranych bakterii.

5. rodzaje preparatów mikrobiologicznych

Rozmaz, preparat świeży, utrwalony barwiony i niebarwiony, kropla wiszaca.

1. Metody hodowli beztlenowców.
   Pod parafiną, hodowlę w eksykatorze, z którego usunięto tlen, hodowlę w eksykatorze, z którego usunięto tlen, Hodowla w an aerostacie, możesz użyć też genbagi

2. Metoda posiewu płytek "tartych".
   metoda wysiewu powierzchniowego(płytek tartych)- niewielką ilość rozcieńczonego materiału pipetą nanosi się na zestaloną pożywkę w płytce i rozprowadza szklaną głaszczką po całej powierzchni pożywki.

BARWIENIE

1. Wymień 2 metody barwienia złożonego.

• Metoda Grama

• Metoda Ziehla- Neelsena

1. Metody barwienia- wymienić i opisać barwienie za pomocą którego można zobaczyć otoczki

• Barwienie negatywne (z tuszem czarnym)

• Barwienie pozytywno – negatywne (z tuszem i fuksyną karbolową)

• Barwienie pozytywne

  • Proste (Lofflera)

  • Złożone (Grama, Ziehla-Neelsena, Neissera, Metodą Giemsy)

Barwienie pozytywno – negatywne – za pomocą tego barwienia można wykazać obecność otoczek u bakterii. W 1 ml soli fizjologicznej zawiesza się ok. 10⁹ bakterii, dodaje się kroplę fuksyny karbolowej. Zawiesinę ogrzewa się do 70^oC przez 1 – 2 min (faza pozytywna). Następnie kroplę zawiesiny kładzie się na szkiełko i dodaje drugą kroplę barwnika grubo dyspersyjnego, np. nigrozynę. Szkiełkiem o szlifowanych brzegach robi się rozmaz, preparat suszy się w temp pokojowej (faza negatywna). W mikroskopie widoczne są czerwono zabarwione komórki na ciemnym tle. Jeśli bakterie mają otoczki, to dookoła czerwono zabarwionej komórki są dobrze widoczne bezbarwne otoczki na ciemnym tle.

1. Barwienie metodą Grama – na utrwalony preparat nalewa się fiolet krystaliczny, barwnik spłukuje się wodą i dodaje się płyn Lugola, spłukuje się wodą. Następnie odbarwia się etanolem i spłukuje się wodą. Preparat podbarwia się rozcieńczoną fuksyną, spłukuje się wodą i suszy w temp. pokojowej.
   Bakterie Gram dodatnie zabarwione są na niebiesko (ciemnofioletowo), natomiast bakterie Gram ujemne zabarwione na czerwono.

PODŁOŻA

1. Podział podłoży ze względu na jakość i opisać transportowe + przykłady

• proste (podstawowe) - dla bakterii mniej wybrednych

• agar zwykły

• bulion zwykły

• woda peptonowa

• wzbogacone - dla bakterii wymagających

• bulion wzbogacony / z krwią

• agar wzbogacony / z krwią

• wybiórczo-namnażające - rosną na niej selektywnie wybrane bakterie

• bulion z żółcią

• pożywka SF wg Leifsona

• pożywka z żółcią i zielenią brylantową

• wybiórczo-różnicujące - rosną na niej wybrane bakterie, jednocześnie pozwalają na wykrywanie cech fizjologicznych i biochemicznych

• pożywka Levine'a

• pożywka Chapmana

• podłoże MacConkeya

• różnicujące - pozwalają na wykrywanie cech fizjologicznych i biochemicznych

• pożywka Kliglera

• woda peptonowa z dodatkiem cukru, wskaźnika i rurki Durchama

• pożywka Christensena

• specjalne - dla bardzo wymagających bakterii i mykoplazm

• pożywka Tarozziego-Wrzoska

• pożywka Löwensteina-Jensena

• pożywka Löfflera

• pożywka Sabourauda

• transportowe - do przechowywania i przewozu pobieranych materiałów chorobowych

Podłoża transportowe służą do bezpiecznego przenoszenia materiału pobranego od pacjenta (np. do laboratorium, w celu przeprowadzenia badań). Są to wyjałowione zestawy, wewnątrz których znajduje się pożywka o specjalnym składzie, która pozwala na rozwój bakterii (także wymagających) i zabezpiecza ich żywotność do kilku dni.

Przykładowy zestaw składa się z patyczka, na który pobiera się materiał przeznaczony do badania oraz z fiolki, na dnie której znajduje się pożywka, w której zostanie zanurzony materiał znajdujący się na patyczku.

  

1. podział podłoży ze względu na skład

• Podłoża proste (bulion zwykły, woda peptonowa, agar zwykły, żelatyna)

• Podłoża wzbogacone (bulion cukrowy, agar z krwią)

• Podłoża wybiórczo – namnażające (bulion z żółcią, pożywka SF wg Leifsona)

• Podłoża wybiórczo – różnicujące (podłoże Chapmana, podłoże Mc Conkeya, podłoże SS)

• Podłoża specjalne (podłoże Löwensteina – Jansena, podłoże Löfflera)

• Podłoża transportowe

1. podział podłoży ze względu na funkcje i po 1 przykładzie

• Podłoża proste – bulion mięsny (wyciąg mięsny +1% peptonu +05% NaCl)

• Podłoże wzbogacone – Agar krwisty

• Podłoża specjalne – Podłoże Kliglera

• Podłoża wybiórczo - różnicujące – podłoże Lowsteina Jensena – do hodowli prątków gruźlicy.

• Transportowe – Podłoże Stuart z węglem lub bez węgla

1. Podział podłóż ze względu na konsystencję + co to podłoża specjalne - opisać + przykłady

Podłoża ze względu na konsystencję:
1. płynne
2. półpłynne
3. stałe

Podłoża specjalne to podłoża z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych substratów. Służą np. do określania cech biochemicznych. Umożliwiają one detekcję organizmów, które mogą mieć szczególnie wysokie wymagania hodowlane lub mogą być obecne w próbkach klinicznych w wielogatunkowej mieszance drobnoustrojów. W ich skład wchodzą substancje odżywcze: surowice, żółtka jaj, witaminy, specjalne związki organiczne.

Przykłady:
1. podłoże Lowensteina- Jansena do hodowli prątków gruźlicy
2. Podłoże Lofflera- do hodowli maczugowca błonicy

1. Pojecie kolonia i cechy, które opisują kolonie na agarze krwawym.
   Kolonią nazywamy zespół komórek danego drobnoustroju, które wyrosły na agarze stałym w wyniku rozmnożenia się jednej komórki bakteryjnej.
   Przy opisie kolonii bakteryjnej bierze się pod uwagę: kształt, wielkość, wzniesienie, brzegi, powierzchnia, struktura, kolor, konsystencja, zapach, typ hemolizy.

2. Opisz podłoże Kliglera
   Podłoże Kliglera – stałe w barwie bursztynowej, lane w postaci skosu, służy do stwierdzenia zdolności drobnoustrojów do:

• -rozkł. Tlenowego glukozy i laktozy (zdolne do rozkładu obydwu cukrów zarówno cześć słupkowa jak i skośna są zółte, przy rozkładzie tylko laktozy – część słupkowa żółta a skośna – czerwona)

• - rozkładu gazowego w/w cukrów( możliwe rozerwanie podłoża)

• - wytwarzania siarkowodoru (czarny pierścień)

1. Do czego służy metoda sedymentacji Kocha?

Metoda sedymentacji Kocha – polega na wyeksponowaniu płytki Petriego z pożywką w środowisku, które chcemy zbadać. Drobnoustroje ze środowiska będą opadały na płytkę, a po odstawieniu do inkubacji wytworzą się kolonie. Minimalny czas ekspozycji to 10 min, maksymalny – 60 min. Czas ekspozycji zależy od zanieczyszczenia i intensywności ruchu powietrza

1. podłoże Chapmana z czego się składa i do czego służy
   Zawiera 7,5% NaCl (czynnik wybiórczy), mannitol (substrat) i czerwień fenolową (wskaźnik). Podłoże jest wybiórcze dla gronkowców, ponieważ są one halofitami i mogą rosnąć przy 7,5% zawartości naCl w środowisku, wzrost innych bakterii jest zahamowany. Gronkowce, które fermentują mannitol, powodują zakwaszenie środowiska i barwa podłoża zmienia się z amarantowej na żółtą (kolonie koloru żółtego). Gronkowce nie fermentujące mannitolu rosną w postaci białych kolonii i nie zmieniają barwy podłoża.

2. Podłoże Mc Conkeya – podłoże wybiórczo-różnicujące dla pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae. Jest to podłoże stałe, koloru cielistego (przejrzyste, beżowe).
   Zawiera dezoksycholan sodu, fiolet krystaliczny, czerwień obojętną i laktozę jako substrat. Dezoksycholan sodu hamuje wzrost innych drobnoustrojów, pałeczki jednak mogą rosnąć w jego obecności (cecha wybiórcza).
   Pałeczki, które farmentują laktozę rosną w postaci różowych kolonii, natomiast nie fermentujące laktozy – w postaci beżowych lub szarych kolonii.

3. opisać podłoże christensena- (woda peptonowa z mocznikiem) płynne żółtawe podłoże do badania zdolności rozkładu mocznika (na obecność ureazy) próba dodatnia – zmiana zabarwienia podłoża na kolor amarantowy.

MIKROSKOPY

1. Zdolność rozdzielcza - definicja, wzór, co na nią wpływa

Zdolność rozdzielcza mikroskopu – to wielkość, która charakteryzuje mikroskop pod względem rozróżniania drobnych szczegółów badanego przedmiotu. Określamy ją jako odwrotność najmniejszej odległości d pomiędzy punktami, które jeszcze rozróżniamy jako oddzielne.

$$\frac{1}{d} = \ \frac{n\ \bullet \sin\alpha}{\lambda}$$

Im większa jest zdolność rozdzielcza, tym bliższe sobie punkty są obserwowane jako odrębne, a nie jako pojedyncza plama.

Zdolność rozdzielcza zależy od apertury numerycznej obiektywu (najlepszy zakres to 1,3 - 1,5) i od długości fali zastosowanego światła. Na zdolność rozdzielczą wpływa także współczynnik załamania światła przez środowisko znajdujące się między aparatem i obiektywem. Aby zwiększyć kąt skrajnych promieni, używa się olejku immersyjnego (np. cedrowego) w celu zapełnienia przestrzeni między preparatem i obiektywem.

1. Co to jest imersja, jak to działa

Imersja, immersja - metoda stosowana w mikroskopii w celu zwiększenia zdolności rozdzielczej mikroskopu optycznego poprzez wypełnienie przestrzeni pomiędzy preparatem a obiektywem przeźroczystą cieczą (cieczą imersyjną) o współczynniku załamania zbliżonym do współczynnika załamania szkła soczewki (często jest to olejek cedrowy). Zapobiega to załamaniu się światła po przejściu ze środowiska optycznie gęstszego (szkła) do środowiska optycznie rzadszego (powietrza) i zaciemnieniu pola widzenia (zwiększana jest apertura liczbowa obiektywu mikroskopu).
Obiektyw z cieczą imersyjną potocznie nazywany jest soczewką imersyjną.

1. Elementy optyczne mikroskopu:
   Do części optycznej zalicza się:
   - lusterko płaskie i wklęsłe (w nowszych konstrukcjach żarówki oświetlające)
   - aparat Abbego- zbiór soczewek zbierających i oświetlających preparat od dołu
   - obiektywy- 5x, 10x, 40x i 100x, umieszczone w przyrządzie rewolwerowym
   - okulary- 5x, 10x i 15x umieszczone w górnym otworze tubusa.

2. Elementy optyczne mikroskopu wymienić zaczynając od dołu + największe powiększenie dla mikroskopu świetlnego:
   Do badań bakteriologicznych używa się układów powiększających od 1000do 1500 razy,tj. obiektyw 10x lub 15x.
   Najsilniejsze obecnie stosowane soczewki jako obiektywy mają zdolność powiększenia do 100x, zaś okulary do 25x.
   Mikroskop świetlny:

• - źródło światła(oświetla preparat na stoliku-lusterko płaskie i wklęsłe lub zarówka),

• - kondensator(skupia światło na preparacie),

• - dwie soczewki (obiektywu i okularu, używane do powiększenia obrazu).

Soczewki obiektywu umieszczone w przyrządzie rewolwerowym są małej mocy 10×, dużej mocy40×, bardzo dużej mocy 100×(z immersją olejową).
Soczewki okularu umieszczone w górnym otworze tubusa, mogą dalej powiększać obraz 10-15razy.

1. Co zastosowano w ultramikroskopie (zjawisko Tyndalla), zastosowanie.

ULTRAMIKROSKOP- „CIEMNE POLE WIDZENIA”- jest to odmiana mikroskopu zwykłego, w którym wykorzystuje się zjawisko Tyndala, tj. odbijanie się promieni cząsteczek stałych (faza rozproszona) zawieszonych w powietrzu lub płynie (faza rozpraszająca).

Przykład: obserwacja cząsteczek kurzu unoszących się w pokoju, a oświetlonych promieniami słońca wpadającymi przez okno, przez obserwatora siedzącego z boku. Jeśli obserwator popatrzy w kierunku źródła światła, cząsteczek kurzu nie zobaczy.

W mikroskopie tym zmodyfikowany jest aparat Abbego przez zaklejenie środkowej części soczewki czarnym krążkiem, tzw. blendą. Promienie przechodzące przez skrajną część soczewki omijają obiektyw, a trafiają do niego wówczas, gdy zostaną odbite przez jakiś obiekt. Takim obiektem mogą być bakterie umieszczone w odpowiednim miejscu mikroskopu na szkiełku podstawowym. Na ciemnym tle widoczne są jasne kształty bakterii, często żywo poruszających się.

Zastosowanie: do oglądania kształtu i ruchu żywych drobnoustrojów.

1. Mikroskop elektronowy

Jest to mikroskop wykorzystujący do obrazowania wiązkę elektronów, która przechodząc przez pole magnetyczne, zachowuje się podobnie jak wiązka promieni świetlnych przechodzących przez soczewki. Obrazy oglądane są na ekranie fluoryzującym lub rejestrowane na kliszy fotograficznej. Obserwowany obraz jest jakby cieniem oglądane przedmiotu. Mikroskop elektronowy pozwala badać strukturę materii na poziomie atomowym. Umożliwia powiększenie obrazu do miliona razy.

Ogólnie mikroskopy elektronowe można podzielić na zwykłe oraz skaningowe mikroskopy elektronowe.