Aktywność gwiezdna

Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje nukleotydów w cząsteczkach DNA. Jednakże, ich specyficzne rozpoznawanie sekwencji może być zmienione/zmniejszone (tutaj uzyte w kontekście reduced) in vitro. Kiedy zostaną zapewnione specjalne warunki, enzymy mogą rozpoznawać i rozszczepiać sekwencje nukleotydowe które są różne od strony kanonicznej (canonical-kanoniczny, chodzi o to, że enzymy zwykle tną w ściśle określonych miejscach natomiast kiedy zmieni się ich aktywność mogą ciąć w innych miejscach). Przy niskim stężeniu jonów enzym BamHI (który zwykle rozpoznaje sekwencję GGATCC) jest w stanie rozszczepić następujące sekwencje: NGATCC,

GPuATCC i GGNTCC. To zjawisko nazywane jest „zrelaksowaną” bądź „gwiezdną” aktywnością. Aktywnośc gwiezdna nie jest pożądana podczas używania enzymów. Badania wykazały, że to zjawisko jest wynikiem: przedłużonej inkubacji (przetrawienie), wysoką koncentracją enzymów w mieszaninie, wysoką zawartością glicerolu w mieszaninie, obecnością organicznych rozpuszczalników (np. etanol), małym stężeniem jonów w buforze reakcyjnym, zbyt niską wartością pH buforu reakcyjnego, zastąpienie jonów magnezu Mg2+ innymi dwuwartościowymi jonami np. Mn2+ i Co2+. W niektórych przypadkach terminatory (nie jestem pewna czy termini rzeczywiście oznacza sekwencje terminatorowe:/) powstałe w wyniku cięcia enzymami restrykcyjnymi w miejscach ich specyficznego cięcia (tutaj chodzi o te miejsca „kanoniczne”, czyli te, w których enzymy normalnie tną) mogą stymulować aktywność gwiezdną enzymu. Zarówno aktywność gwiezdna jak i niekompletne strawienie DNA wykazują podczas elektroforezy nietypowe prążki, które mogą być odróżnione od siebie dzięki wnikliwej obserwacji żelu. Tendencja enzymów restrykcyjnych do wykazywania aktywności gwiezdnej jest wykazywana zarówno w opisie produktu jak i w Certyfikacie Analizy (Certificate of Analysis).

Jak odróżnić aktywność gwiezdną od niekompletnego strawienia DNA?

-aktywność gwiezdna w żelu wykazuje dodatkowe prążki poniżej prążków, których oczekujemy w wypadku normalnego trawienia DNA , natomiast nie ma dodatkowych prążków powyżej fragmentu, który jest uznawany za największy. Te dodatkowe prazki sa bardziej intensywne w momencie gdy prążki oczekiwane są mniej intensywne, kiedy zarówno czas inkubacji lub ilość enzymu jest podwyższona.

-Niekompletne strawienie DNA wykazuje dodatkowe prazki powyżej oczekiwanych prążków DNA w żelu. Dodatkowe prązki znikają gdy czas inkubacji lub ilość enzymu wzrasta. Nie obserwujemy żadnych dodatkowych prążków poniżej najmniejszego fragmentu DNA.

NOTE (notka):

Konkretne enzymy restrykcyjne pozostają złączone z substratem DNA po cięciu co wywołuje zmiany w mobilności tego substratu podczas elektroforezy. Otrzymany w taki sposób prażek nie jest wynikiem aktywności gwiezdnej. W takim przypadku należy użyć barwnika z SDS, podgrzać próbkę przez 10 min w 65 stopniach i schłodzić w lodzie zanim nałoży się próbkę na żel. (no i dalej w ang tekście sa podane przykłady enzymów , dla których ten efekt jest charakterystyczny:P)