Analiza biochemiczna
Dr Marcin Grąz, pok. 337
Ocena końcowa:
Egzamin (70%)
Wykłady + konwersatoria + praca semestralna (30%)
Organizmy modelowe w biochemii:
E. coli
S. cervisiae
B. subtilis
N. crassa
Ch. Pyrenoidosa
Projektowanie badań biochemicznych:
Identyfikacja przedmiotu badań
Krytyczna ocena stanu wiedzy, poznanie metodologii
Postawienie hipotezy badawczej
Wybór systemu badań (in vitro/in vivo)
Identyfikacja badanej zmiennej, ocean wpływu, kontrola czynników wpływających na wynik doświadczenia (temperatura, pH, inhibitory proteaz)
Zaprojektowanie eksperymentu
Przeprowadzenie eksperymentu
Dokumentacja otrzymanych wyników
Powtórzenie eksperymentu
Analiza otrzymanych wyników
Przedstawienie wniosków na podstawie wyników
Przedstawienie nowych hipotez
Wszystkie doświadczenia naukowe dają wyniki, które można przedstawić statystycznie – pozwalają one dotrzeć do zależności występujących między cząsteczkami badanych substancji.
Bazy komputerowe:
EBSCO
ELSEVIER
SPRINGER
SCOPUS
NATURE
SCIENCE AAAS
PUBMED
WE OF SCIENCE
ICM
Bazy na stronach czasopism
Wskaźniki bibliometryczne:
Bibliometria – zbiór metod służących do oceny danego zbioru czasopism, autorów, uczelni
Indeks cytowań (Science Citation Index) znajdujący się na Web of Science na platformie Web of Knowledge opisujący ilość cytowań danego autora
Miara oddziaływania (Impact Factor) – wskaźnik prestiżu czasopisma obliczany na podstawie indeksów cytowań
Lista filadelfijska (ISI Master Journal List) zawiera czasopisma spełniające odpowiednie kryteria jakości
Indeks Hirsha – wskaźnik odzwierciedla dystrybucję cytowań publikacji określonego naukowca i liczbę jego najlepszych publikacji.
Struktura pracy naukowej:
| Gatunek pracy | Zakres tematyczny (definicja gatunku) |
Szkielet | Zakres bibliografii (redakcja może zastrzec maksymalną liczbę pozycji) |
|---|---|---|---|
| Naukowo-badawcza | przebieg i wyniki określonych badań z zakresu medycznych nauk podstawowych, biomedycznych, biotechnicznych; zwykle tylko jeden typ badań, jeden wynalazek albo jedno odkrycie; każde następne opisuje się w osobnej pracy; wyniki badań lub odkryć cząstkowych (etapowych) można opisywać osobno w kolejnych pracach wraz z przyrostem materiału wynikowego; wyniki zakończonego ciągu takich badań przedstawia się zwykle w osobnej pracy poglądowej jako podsumowanie; wyniki badania pojedynczego podaje się wraz z opisem badań w tym samym tekście |
|
piśmiennictwo możliwie najszerzej reprezentujące tematykę |
| Kliniczna | obserwacje statystycznie istotnej grupy zdrowych lub chorych w zakresie określonego typu zjawisk fizjologicznych lub patologicznych, w tym stosowane metody i procedury diagnostyczne, terapeutyczne, rehabilitacyjne, profilaktyczne, pielęgnacyjne, psychologiczne |
|
piśmiennictwo możliwie najszerzej reprezentujące tematykę |
| Poglądowa | najczęściej spotykane, powszechnie przyjęte, oficjalne albo oparte na ciągu własnych badań poglądy na określony temat albo na logicznie powiązaną grupę zagadnień medycznych, w tym z zakresu nauk podstawowych i humanistyki lekarskiej; duże podobieństwo do rozdziału podręcznika, ale opis wzbogacony rozważaniami i komentarzami autorskimi lub zaproszonych specjalistów | struktura zależna od dziedziny, najczęściej:
|
rozbudowane piśmiennictwo dotyczące każdego wyrażonego poglądu i zagadnień szczegółowych, o których mowa w tekście, w tym źródła cytatów lub opisów badań, cudzych wniosków itp.; dbałość o uwzględnianie pierwszeństwa w odkryciach (o ile to możliwe) |
| Skrypt | szkic podręcznika akademickiego, podyplomowego, kursowego lub do korzystania w innym systemie edukacji; podręcznik niekompletny, ale zawierający materiał wykładany (lub potrzebny studentom do rozumienia wykładów) autora | struktura zależna od dziedziny, najczęściej:
|
piśmiennictwo zawierające tytuły najważniejszych podręczników z danej dziedziny; rzadko szczegółowe |
| Monografia | duża praca (zwykle w postaci książki lub monotematycznego serwisu internetowego), omawiająca jedno zagadnienie osiowe wraz z jego odgałęzieniami tematycznymi i ze wskazówkami interdyscyplinarnymi lub intertekstualnymi; może mieć charakter dokumentarny (zestawianie materiałów, danych, faktów), teoretyczny (twierdzenia, hipotezy), eseistyczny (omawianie, rozważania, heurystyka) albo mieszany | struktura zależna od dziedziny, najczęściej:
|
rozbudowane piśmiennictwo dotyczące każdego wyrażonego poglądu i zagadnień szczegółowych, o których mowa w tekście, w tym źródła cytatów lub opisów badań, cudzych wniosków, w tym podlegających dyskusji; dbałość o uwzględnianie pierwszeństwa w odkryciach (o ile to możliwe) |
| Podręcznik (rozdział podręcznika) |
najczęściej spotykane, powszechnie przyjęte, oficjalne albo oparte na ciągu własnych badań poglądy medyczne i z zakresu nauk pokrewnych, w tym spychologiczne i filozoficzne, na określony temat albo na logicznie powiązaną grupę zagadnień medycznych, także z zakresu nauk podstawowych; najważniejsze problemy spotykane w praktyce i sposoby ich rozwiązywania; nawiązanie do dziedzin pokrewnych; także historia zagadnienia; pewne podobieństwo do pracy poglądowej, ale bez rozważań i rozwiniętych komentarzy odautorskich | struktura zależna od dziedziny, najczęściej:
|
piśmiennictwo podstawowe i (lub) uzupełniające albo dokumentujące fakty uznane za nowe (w następnych wydaniach takiej pozycji piśmiennictwa może już nie być); bardzo rzadko piśmiennictwo dokumentujące szczegółowe poglądy (tylko w podręcznikach o niewielkiej objętości) |
| Referat naukowy | praca przygotowana do wygłoszenia na konferencji naukowej i jednocześnie do druku w pamiętniku konferencji; zakres tematyczny dowolny |
|
piśmiennictwo odpowiednie do typu tematycznego, zwykle ograniczone do 10-15 pozycji |
| Plakat naukowy | streszczenie w postaci grafu lub listy zdań na dużym arkuszu, przedstawiane alternatywnie do referatu na konferencji naukowej; zakres tematyczny dowolny |
|
bez piśmiennictwa, rzadko do 5 pozycji |
Podstawowe procedury i wyposażenie laboratoryjne:
umożliwiają wykonywanie doświadczenia
ustalają warunki doświadczenia
umożliwiają komputerowe opracowanie danych
oczyszczają i dezynfekują sprzęty oraz sale labolaotryjne
Normy czystości odczynników chemicznych:
odczynniki techniczne
odczynniki czyste
odczynniki chemicznie czyste
odczynniki czyste do analizy
odczynniki spektralnie czyste do specjalnych zastosowań
Stopnie jakości wody laboratoryjnej:
typ 1 (ultraczysta, MiliQ) – R > 18
typ 2 (czysta) – R > 1
typ 3 – R > 0,05
Roztwory buforowe – mieszaniny roztworów słabych kwasów lub zasad i ich soli lub mieszaniny roztworów dwóch soli kwasu wielowodorowego o kilku stopniach dysocjacji.
Efektywny zakres buforowania wynosi pH = pK ± 1
Pojemność buforowa – zdolność przeciwstawiania się zmianom pH po wprowadzeniu kwasu lub zasady. Wzrasta wraz ze wzrostem stężenia buforu i maleje z rozcieńczaniem. Bufory maja największą pojemność buforową w zakresie pH zbliżonym do pK, czyli gdy stosunek stężeń składników buforu jest zbliżony do jedności. Miarą pojemności buforowej jest stosunek liczby moli kwasu lub zasady, która musi być dodana do 1 litra roztworu, aby spowodować zmianę pH o jednostkę.
Bufory lotne (mrówczan amonu, octan amonu) – umożliwiają szybkie odparowanie substancji.
Typowe bufory stosowane w biochemii:
| Efektywny zakres pH | Bufory | pK (25 C) |
|---|---|---|
| 2,5 – 7,0 | Cytrynianowe | 3,13 |
| 3,0 – 4,5 | Mrówczanowe | 3,75 |
| 3,5 – 6,5 | Bursztynianowe | 4,21 |
| 4,0 – 5,5 | Octanowe | 4,76 |
| 6,0 – 7,0 | Fosforanowe | 7,20 |
| 7,5 – 9,0 | Tris | 8,06 |
| 8,5 – 10,0 | Boranowe | 9,23 |
| 9,0 – 10,5 | Glicynowe | 9,78 |
[więcej w broszurze Biological Buffer lub Stoll, V.S., Blanchard, J.S. et al. (1990) Methods Enzymol. 182, 24-38]
Dodatki do buforów:
azydek sodu
EDTA
DTT
DTE
2-merkaptoetanol
Detergenty
Jonowe:
Kationowe (CTAB)
Anionowe (SDS)
Niejonowe (Triton X-100)
Obojniaczo-jonowe (CHAPS)
Usunięcie detergentu:
Wytrącanie białka
Dializa
Metody chromatograficzne
Rozcieńczenie próby
[więcej w broszurze EMD Biosciences „Guide for solubilization of membrane proteins and selecting tools for detergent removal”]
Rodzaje elektrod:
Elektrody I rodzaju – odwracalne względem kationu (np. wodorowa)
Elektrody II rodzaju – odwracalne względem anionu (np. kalomelowa, chlorosrebrowa)
Elektrody III rodzaju – odwracalne względem kationu (np. wapniowa)
Elektrody utleniająco-redukujące (np. ninhydrynowa)
Ogniwo elektrochemiczne – układ elektroda wskaźnikowa (reagują na zmiany potencjału na obecność jonu) – elektroda odniesienia (porównawcza, o stałym potencjale) zanurzone we wspólnym elektrolicie.
Przygotowanie próbki:
Dezintegracja komórek
W celu izolacji białek, kwasów nukleinowych lub innych związków niskocząsteczkowych
Wybór odpowiedniego materiału biologicznego i jego ochrona przed degradacją
Inhibitory proteaz
PMSF (proteazy serynowe – 1 mM)
Pepstein (proteazy aspartylowe – 0,1 mg/ml)
PCMB (proteazy cysteinowe – 1 mM)
EDTA (metaloproteazy – 5 mM)
Homogenizacja mechaniczna:
Dodatek antyspieniaczy – kontrola temperatury
Sonifikacja
Wysokie ciśnienie (prasa French’a)
Cykliczne zamrażanie i odmrażanie
Hipotoniczne bufory
Liza enzymatyczna komórek
Proces solubilizacji białek błonowych z błon komórkowych:
Detergenty
Wytrącanie białek i kwasów nukleinowych zależy od ich rozpuszczalności, którą warunkują m.in. pH, temperatura, siła jonowa, czy dodatek soli. Strącanie białek może być przeprowadzane na dwa sposoby:
Nieodwracalną agregację białek (rozfałdowanie -> denaturacja)
Odwracalna agregacja białek (strącanie białek z roztworu)
Wysalanie białek za pomocą TCA, PEG lub siarczanu amonu
Do usunięcia soli można użycz metod:
Odsalanie SEC – chromatografia sita molekularnego, w której nanosi się na kolumnę 20-30% jej objętości.
Dializa – metoda oczyszczania roztworów przy użyciu błony półprzepuszczalnej.
Ultrafiltracja – proces filtracji z użyciem sit molekularnych, membran i wszelkich materiałów porowatych, o porach, których rozmiary są zbliżone do wielkości pojedynczych cząsteczek (zwykle kilka–kilkadziesiąt nanometrów). Wielkość cząsteczek oddzielanych substancji musi znacznie przekraczać wielkość cząsteczek rozpuszczalnika. Siłą napędową procesu jest wysokie ciśnienie hydrauliczne roztworu rozdzielanego.
Liofilizacja – proces pozwalający na zagęszczenie próbki, ale zagęszcza także sole. Polega na suszeniu zamrożonych substancji przez sublimację.
Chromatografia – fizykochemiczna metoda rozdzielania, w której składniki rozdzielane ulegają podziałowi między dwie fazy: stacjonarną (nieruchomą) oraz ruchomą (poruszającą się w określonym kierunku). Oddziaływania występują zarówno pomiędzy substancją rozdzielaną, a fazami ruchomą i stacjonarną, jak też między oboma fazami. Równowaga podziału ma dynamiczny charakter zależny od właściwości rozdzielanej substancji oraz rodzajów faz ruchomej i stacjonarnej, co określa współczynnik retencji (k).
Sprawność układu chromatograficznego – zdolność kolumny do wytwarzania wąskich pików (wyrażana liczbą półek teoretycznych). Na sprawność wpływają m.in. modyfikacje substancji rozdzielanej, temperatura, prędkość przepływu fazy ruchomej, wielkość i kształt ziarem absorbentu oraz jakość upakowania. Aby zwiększyć sprawność układu stosujemy ziarna absorbentu o małej średnicy (np. 5 um) o płytkich porach oraz brak wolnych przestrzeni (tzw. dead volume) w kolumnie.
Rodzaje chromatografii [więcej w Witkiewicz Z., Klasyfikacja technik chromatograficznych]:
W zależności od rodzaju eluentu:
chromatografia cieczowa – w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników;
chromatografia gazowa – w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot);
chromatografia nadkrytyczna – w której eluentem jest substancja w stanie nadkrytycznym.
W zależności od rodzaju fazy stacjonarnej i sposobu jej przygotowania:
Chromatografia planarna
chromatografia cienkowarstwowa TLC (ang. thin layer chromatography) – w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa fazy stałej naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny;
chromatografia bibułowa – w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;
chromatografia kolumnowa – w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
chromatografia powinowactwa – w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji;
chromatografia jonowymienna – w której substancje oddziałują ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych.
W zależności od parametrów procesu:
HPLC (ang. high performance/pressure liquid chromatography) wysokosprawna/wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa – odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu pod wysokim ciśnieniem;
FPLC (ang. fast protein/performance liquid chromatography) szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa – odmiana HPLC działająca na niższych ciśnieniach, stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych, służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Pharmacia;
UPLC (ang. ultra performance liquid chromatography) ultrasprawna chromatografia cieczowa – odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej. Działa na wyższych ciśnieniach i mniejszych przepływach, a kolumny mają mniejsze ziarno (1,7 – 1,8 μm). Pozwala uzyskiwać krótsze czasy retencji i wyższe rozdzielczości. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Waters;
GPC (ang. Gel Permeation Chromatography) chromatografia żelowa – odmiana kolumnowej chromatografii cieczowej. Polega na rozdziale składników mieszaniny na żelu lub sitach molekularnych w zależności od rozmiarów cząsteczek. Stosowana m.in. do określania średnich mas cząsteczkowych polimerów.
Chromatografia adsorpcyjna:
W normalnym układzie faz – faza stacjonarna jest zawsze bardziej polarna niż faza ruchoma
W odwróconym układzie faz – faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna (pokryta „szczotką” łańcuchów alkilowych C8 lub C18)
Rodzaje chromatografii:
Sita molekularnego (ang. Size Exlusion Chromatography/ Gel Filtration)
Jonowymienna (ang. Ion Exchange Chromatography)
Chromatoogniskowanie (ang. Chromatofocusing)
Oddziaływań hydrofobowych (ang. Hydrophobic Interaction Chromatography)
Odwróconej fazy (ang. Reverse Phase Chromatography)
Powinowactwa (ang. Affinity Chromatography)
Szeregi eluotropowe – uszeregowanie rozpuszczalników według wzrastającej siły elucyjnej:
Rozpuszczalnik - Wskaźnik polarności wg Snydera (J. of Chrom. 92. 233, 1974)
n-heksan - 0,0
cykloheksan - 0,0
tetrachlorek węgla - 1,7
toluen - 2,3
dichlorometan - 3,4
butan-1-ol - 3,9
octan etylu - 4,3
chloroform - 4,4
aceton - 5,4
etanol - 5,2
metanol - 6,6
woda - 9,0
Elucja izokratyczna – niezmienny skład fazy ruchomej w trakcie całego rozdziału chromatograficznego
Elucja gradientowa – skład fazy ruchomej zmienia się systematycznie w trakcie analiz
Etapy rozdziału chromatograficznego:
Równoważenie kolumny (5-10 CV)
Aplikacja badanej próby (3-5% CV) i odpłukanie złoża
Elucja (wymywanie) (10-20 CV)
Regeneracja złoża (5-10 CV)
Budowa chromatografu HPLC:
Pompa
Dozownik
Kolumna chromatograficzna + nośnik
Detektor
Rejestrator (komputer)
Sprzęt kontrolujący warunki
Faza stacjonarna wpływa na retencje, selektywność i efektywność rozdzielania mieszanin RP HPLC. Reaktywność żelu krzemionkowego pozwala na otrzymanie różnego rodzaju faz stacjonarnych z różnymi grupami funkcyjnymi. Fazy stacjonarne o charakterze monomerowym są mniej trwałe, ale zapewniają bardziej powtarzalne wyniki poprzez większą sprawność i odtwarzalność parametrów. Fazy stacjonarne o charakterze polimerowym mają mniej zdefiniowaną strukturę, ale są bardziej odporne i trwałe na wpływ eluentu. Typowymi rozpuszczalnikami RP HPLC są metanol, acetonitryl, tetrahydrofuran (związki polarne!).
Sito molekularne (SEC / GF) zwykle wykorzystuje elucję izokratyczną. Pierwsze wypływają cząsteczki większe (migrujące między ziarnami), a ostatnie najmniejsze (których droga migracji jest dłuższa, gdyż te wchodzą do ziaren żelu). Idealna matryca powinna być:
Hydrofilowym polimerem
Obojętna chemicznie
Nienaładowana
O jednolitym rozmiarze ziaren
Matryce w chromatografii SEC:
Sephadex – usieciowany przez epichlorhydrynę dekstran
G-10, -15, -20, -50 (odsalanie i izolacja peptydów)
G-75, -100, -150 (dla białek i makromolekuł)
Coarse (10 – 400 um) |
Medium (50 – 150 um) |
Fine (20 – 80 um) |
Superfine (10 – 40 um) |
|---|---|---|---|
| Rozdzielczość Szybkość |
(broszura „Properties of Sephadex” – tabela „Fractionation range”)
Sepharose – polimer agarozy
6B, 4B (45 – 165 um), 2B (60 – 200 um) (frakcjonowanie dużych cząsteczek)
Sephacryl HR – usieciowany przez bis-akrylamid dekstran
Superose – matryca agarozowa o dużej stabilności i ujednoliconych rozmiarach ziaren
Superdex – wysoce usieciowana agaroza kowalencyjnie przyłączona do dekstranu
SEC wykorzystuje się do zastosowań preparatywnych (odsalania, wymian buforu, frakcjonowania) oraz analitycznych (określania masy cząsteczkowej natywnego białka, kształtu białka o znanej masie cząsteczkowej oraz badania oddziaływań międzycząsteczkowych). Technika ta jest łatwa do zastosowania i interpretacji wyników, prosta elucja, można stosować do wszystkich rodzajów cząsteczek, a separacja jest niezależna od składu solwentu. Ograniczeniem jest objętość nanoszonej próbki oraz gorsza rozdzielczość w porównaniu z metodami adsorpcyjnymi.
[więcej informacji o chromatografii w broszurach GE Healthcare: „ Strategies for Protein Purification”, „Size Exclusion Chromatography”, „Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing”, „Hydrophobic Interaction Chromatography”]
Elektroforeza – zjawisko elektrokinetyczne, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym. Prędkość rozdziału zależy od kształtu, ładunku, rozmiaru oraz oporów ruchu środowiska.
Wysokosprawna elektroforeza kapilarna (HPCE) dzieli się na techniki:
Elektroforezę strefową – umożliwia rozdzielenie naładowanych cząstek, na podstawie różnicy w ich ruchliwościach w wolnym roztworze. Poszczególne składniki mieszaniny ustawiają się w oddzielnych strefach.
Elektroforezę żelową – stosowaną do rozdzielania makrocząsteczek biologicznych, rozdzielenia mieszaniny dokonuje się na podstawie różnicy w ich wielkościach, na odpowiednim polimerze, pełniącym rolę sita molekularnego.
Izoelektroogniskowanie – wykorzystywana jest do rozdzielania białek i peptydów na podstawie ich punktu izoelektrycznego. Gradient pH w kapilarze powstaje dzięki wprowadzeniu do buforu amfolitów (substancji obojnakich posiadających w swojej cząsteczce zarówno ugrupowania o charakterze zasadowym i kwasowym).
Izotachoforeza – próbkę umieszcza się między dwoma buforami: wiodącym i zakańczającym. Bufory dobiera się tak, aby ich efektywne ruchliwości obejmowały efektywne ruchliwości jonów w próbce. Po przyłożeniu pola elektrycznego następuje przepływ buforu w kapilarze i dochodzi do uszeregowania jonów zgodnie z ich ruchliwościami w przylegające do siebie strefy, które migrują ze stałą szybkością.
Micelarna elektrokinetyczna chromatografia – umożliwia rozdzielanie cząstek obojętnych, dzięki wprowadzeniu do roztworu buforowego związku powierzchniowo czynnego, po przekroczeniu tzw. krytycznego stężenia micelarnego monomery surfaktanta tworzą micele. Rozdzielanie składników mieszaniny dokonuje się na podstawie różnicy w stopniu ich powinowactwa do miceli.
Elektroosmoza – przemieszczanie się całej masy elektrolitu wypełniającego kapilarę w kierunku jednej z elektrod. Redukuje to czas analizy. Do detektora poruszają się więc wszystkie obecne w roztworze jony. Podziałem tym rządzą siły wędrówki elektroforetycznej i przepływu elektroosmotycznego.
Właściwości otoczki hydratacyjnej zależą od ładunku substancji, jej rozmiaru, a także warunków (pH, temperatura, ciśnienie). W punkcie izoelektrycznym (pI) cząsteczka białka posiada wypadkowy ładunek elektryczny równy zero. W związku z elektrolizą (powstanie jonów wodorowych na katodzie i hydroksylowych na anodzie) stosuje się buforowany elektrolit. Nośniki elektryczne stabilizują elektrolit, „zatrzymują” białko do momentu wybarwienia, warunkują lepszą separację makrocząsteczek (sito molekularne).
Żele agarozowe używane w elektroforezie poziomej służą do separacji białek > 500 kDa i immunoelektorforezy.
Żele poliakrylamidowe pełnią rolę sita molekularnego. Poprzez stężenie akryl amidu i proporcji akrylamid:bisakrylamid można zmieniać wielkość porów. W detekcji można stosować światło o długości fali >250 nm. W reakcji polimeryzacja może być inicjowana chemicznie (nadsiarczanem amonu + TEMED) lub fotochemicznie (ryboflawina + TEMED).
Żele gradientowe charakteryzują się wraz z dystansem migracji wzrostem gęstości usieciowania, co zwiększa dokładność żelu.
System separacji polipepytów opiera się na użyciu buforu rycynowego (a nie glicynowego).
Polimeryzacja żelu hamowana jest w pH > 6 i przez tlen cząsteczkowy.
W systemie ciągłym ten sam bufor o stałym pH znajduje się w żelu, próbie i przy elektrodach. W systemie nieciągłym jest różnica w składzie jonów w żelu i roztworach elektrodowych, pozwala na „zagęszczenie” próbek w początkowej fazie rozdziału. Bufor warunkuje przepływ prądu, stabilizuje pH i odprowadza ciepło Joule’a.
Rodzaje systemów elektroforetycznych:
System Laemmeli – 5% (v/v) 2-merkaptoetanol + 2% (v/v) SDS
System Weber & Osborn’s – system ciągły z buforem fosforanowm
System Neville’a – system buforu Tris-siarczan/Tris-boran
System Ornstein-Davisa – przykład systemu nieciągłego
Bufor McLellana – do elektroforezy natywnej, pH 3,8 - 10,2 wykorzystywany do systemu ciągłego
Barwienie żelu:
Naturalne barwniki (błękit kumazyny, srebro, czerń amidowa)
Barwienie fluorochromami (bromek etydyny, barwniki fluorescencyjne)
Barwienie radioizotopowe
Barwienie enzymatyczne (substratowe)
Immunobarwienie
[więcej w broszuszach BioRad „Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis Systems” oraz „A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection”]
Elektroforeza 2D – separacja białek w dwóch różnych kierunkach według punktu izoelektrycznego oraz masy cząsteczkowej.
Genomika (DNA) -> Transkryptomika (mRNA) -> Proteomika (białka) –> Metabolomika
Fundamentalnym krokiem do poznania struktury białka jest enzymatyczna lub chemiczna degradacja białkowej makromolekuły do mniejszych fragmentów, które mogą być dokładnie scharakteryzowane w kontekście ich składu aminokwasowego i sekwencji. Obydwa sposoby fragmentacji białek muszą spełniać kryteria stosunkowo wysokiej selektywności, powtarzalności i wydajności.
Zrealizowanie projektu dotyczącego poznania ludzkiego genomu umożliwiło naukowcom zsekwencjonowanie wszystkich genów występujących w DNA. Zamierzeniem tych badań było zrozumienie funkcjonowania organizmu ludzkiego. Poznanie genomu umożliwiło zdobycie wiedzy o białkach kodowanych przez DNA, jednak nadal nie zostały wyjaśnione mechanizmy działania komórek, organów oraz całego organizmu. Ocenia się, że w genomie ludzkim jest zapisanych około 35 tysięcy genów kodujących 200-300 tysięcy białek. Poznano strukturę oraz funkcje jedynie nieznacznej ich części.
Przed rozdziałem na podstawie techniki ogniskowania izoelektrycznego potrzebne jest oddysocjowanie od agregatów powstałych z pasków amfolitów i denaturowanie białek.
Analiza preparatyki:
| Związek niskocząsteczkowy | Sposób usunięcia |
|---|---|
| Sole, jony | Dializa, ultrafiltracja, wytrącanie, GF |
| Jonowe detergenty | Wytrącanie acetonem |
| Kwasy nukleinowe | DNAzy, RNAzy |
| Lipidy | Detergenty, wytrącanie acetonem |
| Polisacharydy | TCA, siarczan amonu |
| Związki fenolowe | DTT, 2-merkaptoetanol |
Amfolit – związek amfoteryczny ułożony w gradientowym układzie umożliwiającym rozdział białek na podstawie punktu izoelektrycznego. Obecnie stosuje się im mobilizowany gradient pH na paskach (IPG strips) dostępny w różnych długościach i różnym zakresie pH.
W badaniach proteomicznych łączy się metody biochemiczne, fizykochemiczne i bioinformatyczne. W badaniach tym możliwe jest jednoczesne analizowanie tysięcy białek z danego typu komórek lub tkanek. Do lat 70-tych XX w. masy białek określano za pomocą takich metod jak elektroforeza, ultrawirowanie czy chromatografia. Metody te były jednak niedokładne, błąd wynosił 10-100%. Dopiero wprowadzenie w latach 90-tych techniki spektrometrii mas (ang. Mass Spectrometry MS) przyczyniło się do szybkiego postępu w tej dziedzinie, dzięki wdrożeniu nowych technik jonizacji. MS jest zdecydowanie konkurencyjna w stosunku do innych metod na ogół stosowanych w proteomice, przede wszystkim z uwagi na możliwość analizy białek będących w bardzo małych stężeniach, a także w skomplikowanych mieszaninach. Spektrometria masowa jest techniką analityczną pozwalającą na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego jonu, gdzie przy znanym ładunku jonu daje możliwość obliczenia masy z dokładnością do pojedynczych atomów. Typowy spektrometr masowy składa się z komory jonizacyjnej, analizatora różnicującego jony pod względem stosunku ich masy do ładunku i detektora zliczającego liczbę jonów, które są sprzężone z komputerowym systemem rejestracji i analizy danych.
Spektrometria masowa znalazła zastosowanie w badaniach budowy strukturalnej cząsteczek, składu chemicznego, czystości danej substancji oraz identyfikacji zanieczyszczeń. Głównymi zaletami spektrometrii masowej są dokładność wyznaczenia masy, rozdzielczość do kilku jednostek masy atomowej oraz szeroki zakres stosowania, od peptydów do dużych białek (>200 kDa). Ponadto MS umożliwia detekcję strukturalnych wariantów białek (białka zmodyfikowane posttranslacyjnie, mutanty). Znaczenie spektrometrii mas polega na rozdzielaniu w polu elektromagnetycznym ze względu na wartość stosunku masy m do ładunku z (m/z) zjonizowanych cząstek, jakie znajdują się w analizatorze w wysokiej próżni. Zależnie od rodzaju analizowanych substancji, używa się różnych technik jonizacji i rozdziału jonów. W MS do analiz białek wykorzystywane są niskorozdzielcze analizatory (kwadrupolowe, pułapki jonowe), bądź wysokorozdzielcze (mierzące czas przelotu jonów, cyklotronowy rezonans jądrowy z transformacją Furiera). Najbardziej rozpowszechnionymi metodami jonizacji są desorpcja laserem w stałej matrycy MALDI (ang. matrix-assisted laser-desorption ionization) oraz elektrorozpylanie (ESI, ang. Electrospray).
Technika ESI polega na rozpylaniu cieczy, która zawiera badaną substancję, w polu elektrycznym o wysokim napięciu (około 1-5 kV). Na ogół metoda ta nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek. Podczas wykorzystania tej techniki wzbudzania, powstające jony często mają ładunek wielokrotny, natomiast liczba przyłączonych protonów zależna jest od liczby zasadowych aminokwasów jakie występują w badanych cząsteczkach. Cząsteczka białka ma możliwość przyłączenia kilkunastu, a nawet kilkudziesięciu protonów dlatego można analizować białka o wysokich masach cząsteczkowych, które mogą wynosić kilkaset tysięcy daltonów (Da). Głównymi zaletami tej metody są: wysoka czułość oznaczeń, możliwość analizy dużych cząsteczek do około 80 000 Da, minimalna fragmentacja próbki w czasie jonizacji, a także kompatybilność z technikami chromatograficznymi i elektroforetycznymi. Dzięki sprzężeniu ESI, a w późniejszym czasie także MALDI, z chromatografią cieczową uzyskano dalsze zwiększenie czułości analiz w MS. Inną metodą jonizacji stosowaną w spektrometrach służących do analizy peptydów i białek jest desorbcja laserowa w stałej matrycy - MALDI. W technice tej stosuje się jonizację wiązką laserową o odpowiednio dobranej energii, by nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek, a tylko do ich „wybijania” z właściwie przygotowanej matrycy. Matryca pochłania energię lasera, która z kolei przekazywana jest do analizowanych cząsteczek. Spektrometry MALDI stosowane są do analizy białek o masach od ~1000 Da do nawet kilkuset tysięcy Da. Technika MALDI polega na kokrystalizacji cząstek substancji badanej z cząsteczkami matrycy absorbującej światło, zwykle kwasów aromatycznych. Zazwyczaj jako matryce wykorzystuje się pochodne kwasu cynamonowego (np. kwas synapinowy, kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy). Cząsteczki białka w matrycy wzbudza się za pomocą światła lasera. W wyniku tego z kryształów desorbowane są uprotonowane cząsteczki próbki, a powstałe kationy, mające na ogół pojedynczy ładunek ([M + H]+), które nazywane są jonami molekularnymi. W normalnych warunkach nie obserwuje się ich fragmentacji. W podobny sposób działają spektrometry typu SELDI (ang. surface-enhanced laser desorption ionization). Wykorzystują one desorbcję zjonizowanych światłem laserowym cząsteczek białek następujących z odmiennego typu powierzchni swoiście wiążących białka. Takie powierzchnie są pokryte substancjami będącymi odpowiednikami złóż chromatograficznych. SELDI stosowane są przede wszystkim w proteomice klinicznej w badaniach przesiewowych. Powszechne zastosowanie proteomiczne mają typy analizatorów m/z - czasu przelotu jonów – ToF (ang. time of flight), które rejestrują czas przelotu zjonizowanych cząsteczek (zazwyczaj 0,01-1 ms) i są odwrotnie proporcjonalne do wartości m/z analizowanych jonów. Z widma masowego można odczytać jaka liczba jonów o precyzyjnie określonej masie została zliczona przez detektor. Spektrometria mas wykorzystywana jest także do badań strukturalnych białek, a szczególnie do ich identyfikacji. W tym celu oczyszczone białko początkowo poddaje się trawieniu na mniejsze fragmenty przy pomocy enzymu (zastosowanie znajdują tu proteazy, jak: chymotrypsyna, trypsyna oraz kolagenoza). Uzyskane peptydy wymywa się z żelu, a następnie poddaje analizie. Na spektrometrze MALDI-TOF otrzymuje się widmo, które ukazuje masy poszczególnych peptydów. Jest to mapa peptydowa, typowa dla każdego białka, co jest skutkiem specyfiki substratowej enzymu. Jako przykład można podać trypsynę, która zrywa wiązania w białku zawsze po resztach aminokwasowych lizyny i argininy, natomiast masy uzyskanych fragmentów zależne są od pozycji tych dwóch aminokwasów w sekwencji białkowej. W wyniku trawienia otrzymane masy peptydów są porównywane z masami peptydów wynikającymi z trawienia in silico sekwencji aminokwasowych, które są obecne w białkowych bazach danych. Metoda ta umożliwia jedynie identyfikację poznanych wcześniej białek. |
|---|
[więcej o MS w Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 1996]
Proteom – zbiór wszystkich białek kodowanych przez genom i produkowanych przez pojedynczą komórkę, tkankę lub organ. Analizą proteomu zajmuje się proteomika – nauka gromadząca informacje dotyczące identyfikacji struktur białkowych oraz zajmująca się rozpoznawaniem sekwencji białek oraz ich funkcji.
Genom jest modelem statystycznym (niezmiennym w pewnym obszarze czasu), zaś proteom ukazuje co dzieje się obecnie w komórce (a więc jest modelem dynamicznym). W badaniach genomiki, transkryptomiki i proteomiki niezbędne jest korzystanie z bioinformatycznego opracowania danych. Rozpatrywanie funkcji białka w oderwaniu od jego otoczenia może prowadzić do błędnych wniosków.
Mieszaniny białek poddawane są trawieniu proteazą (trypsyną), a następnie mogą być analizowane w spektrometrze (metoda bottom up) lub po rozdziale MS niestrawionych proteolitycznie białek lub peptydów o masie nieprzekraczającej 50 kDa (metoda top down).
Strategie analizy proteomu:
Zebranie i przechowywanie materiału
Rozdział białek w próbce
Analiza MS
Bioinformatyka
Badanie funkcji lub struktur wyższych
HPLC/MS gwarantuje wysoką czułość oraz wysoką rozdzielczość rozdziału, zapewnia ilość danych wystarczającą do pełnej identyfikacji, jednak zastosowanie takiej techniki powoduje utratę wprowadzonej próbki, wrażliwość na wybrane zanieczyszczenia oraz trudności w jonizacji niektórych substancji.
Analiza mapy peptydów z udziałem systemu LC/MS:
Białko trawione proteazą o określonych właściwościach
Otrzymujemy fingerprint białka
Trypsyna hydrolizuje wiązanie peptydowe po C-końcowej stronie L-argininy i L-lizyny (z wyjątkiem sytuacji, gdy kolejnym aminokwasem jest prolina)
Chemiczna fragmentacja (bromocyjanian, chlorowodór)
Sekwencjonowanie z udziałem tandemowej spektrometrii mas:
Kontrolowane rozerwanie wiązań kowalencyjnych analizowanej cząsteczki i uzyskaniu informacji o jej strukturze na podstawie otrzymanego widma fragmentacyjnego
Otrzymanie etykiet peptydowych (peptide tags)
Uninterpreted MS serach
Bazy bioinformatyczne:
Mascot
Protein Prospector
Peptide Search
Seaquest
Protein Data Bank
KEGG
Brenda Enzyme
Działy proteomiki:
Proteomika strukturalna – poznanie struktury przestrzennej białek. Pozwala na zlokalizowanie miejsca łączenia się leku z białkiem.
Proteomika ilościowa – charakterystyka ekspresji białek. Pozwala na weryfikowanie markerów chorobowych (zrozumienie mechanizmów).
Proteomika funkcjonalna – ocena stanu aktywacji i wzajemnych oddziaływań między białkami. Pozwala na nowych opracowanie technik białkowych.
Badanie funkcji białka polega na:
Identyfikacji białka
Szczegółowej charakterystyce
Próbie modyfikacji aktywności
Analizie rozmieszczenia w tkankach
Oddziaływaniu z innymi białkami
Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej (DPL / GLP) dostępne w handbook’u Good Laboratory Practice prezentowanym przez WHO.
Walidacja metody analitycznej – proces ustalania charakterystyki technicznej (parametrów metody) odpowiedniego celu analitycznego. Celem walidacji jest zapewnienie, że niepewność wyniku jest możliwa do zaakceptowania przez odbiorcę, oszacowanie wpływu różnych czynników na niepewność wyniku. Brak jest dokładnej metodyki przeprowadzania walidacji.
Walidowane parametry:
Specyficzność – zdolność jednoznacznego określenia substancji analizowanej w obecności składników, które mogą być zawarte w próbce
Zakres – przedział między minimalną i maksymalną zawartością/stężeniem substancji aktywnej w badanej próbie, w którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość, dokładność i precyzję [%]
Granice wykrywalności (DL) – najmniejsze stężenie (ilość) badanej substancji w próbce, które może być wykryte, lecz niekoniecznie oznaczone z odpowiednią dokładnością
Granice oznaczalności (QL) – najmniejsze stężenie (ilość) badanej substancji w próbce, jaka może być ilościowo oznaczona z odpowiednią dokładnością i precyzją
Dokładność – zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością, stężeniem) a wartością będącą wynikiem analizy [błąd systematyczny]
Zakres liniowości – zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego wprost proporcjonalnych do stężenia substancji w oznaczanej próbce, w określonym zakresie
[y = ax + b]
Precyzja – stopień zgodności między pojedynczymi wynikami analizy (rozrzut wyników), gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezależnych oznaczeń jednorodnej próbki [odchylenie standardowe]
Powtarzalność - wyraża precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie czasu, przez tego samego analityka i w tych samych warunkach [współczynnik zmienności]
Czułość
Selektywność
Odzysk
[więcej informacji w projekcie rozporządzenia Ministra Zdrowia w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania z 8 lutego 2015 r.]