Ćwiczenie nr 57

Temat : Pomiar widm absorpcji i stężenia ryboflawiny w roztworach wodnych za pomocą spektrofotometru.

Beata Bajorek

Leszek Kruszczyński

Grupa 3

Zespół 4

1) Wprowadzenie teoretyczne

1. Pojęcia:

–Absorpcja – to proces polegający na wnikaniu cząsteczek, atomów lub jonów do wnętrza innej substancji tworzącej dowolną fazę ciągłą - (gazu, cieczy, ciała stałego itp.) Mechanizm absorpcji polega na podziale absorbowanego składnika pomiędzy dwie fazy (ośrodki) objętościowe. W wyniku absorpcji światła przechodzącego przez substancje (np. gaz) z widma światła padającego zostają usunięte częstotliwości, które zostały pochłonięte. Na tej podstawie można stwierdzić, przez jakie substancje przechodziło światło. W procesie absorpcji (także emisji) światło zachowuje się jak cząstka elementarna i może być pochłaniane tylko w porcjach zależnych od częstotliwości światła.

–Widmo absorpcyjne – graficzny zapis zmian wartości absorpcji w zależności od długości fali (liczb falowych). Powstaje podczas przechodzenia promieniowania elektromagnetycznego przez ośrodek absorbujący promieniowanie. Widmo absorpcyjne związane jest ze zmianami energii elektronowej, oscylacyjnej i rotacyjnej.

–Fale elektromagnetyczne – rozchodzące się w przestrzeni zaburzenie pola elektromagnetycznego. Zaburzenie to ma charakter fali poprzecznej, w której składowa elektryczna i magnetyczna są prostopadłe do siebie, a obie są prostopadłe do kierunku rozchodzenia się promieniowania.

–Transmitancja – wskazuje, jaka część promieniowania padającego została przepuszczona przez roztwór. Wyraża się wzorem:

Gdzie:

– natężenie światła padającego

– natężenie światła po przejściu przez absorbujący ośrodek

–Absorbancja – jest miarą absorpcji promieniowania, jest proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej, jeśli wiązka promieniowania monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący, czyli jest proporcjonalna do stężenia substancji barwnej i grubości warstwy. Opisuje się wzorem:

–Spektrofotometria jest to technika spektroskopowa polegająca na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji lub odbicia światła. Od zwykłej fotometrii różni się tym, że umożliwia pomiar światła w zależności od długości światła. W technikach spektrofotometrycznych mierzy się i porównuje intensywność poszczególnych sygnałów w kolejnych widmach spektroskopowych, natomiast w technikach spektroskopowych nie zaliczanych do spektrofotometrii pomiar wartości intensywności światła ma drugorzędne znaczenie, a ważne jest raczej występowanie i kształt sygnałów w widmach.

b) Prawa związane z tematem:

Wiązka promieniowania monochromatycznego przechodząca przez warstwę roztworu jest osłabiona w stosunku do padającego. Promieniowanie o natężeniu ulega częściowo odbiciu lub rozproszeniu, częściowo pochłonięciu, a tylko część przechodzi przez roztwór (rys 1). Powyższą obserwację można przedstawić w postaci równania (1):

gdzie:

- natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego

- natężenie promieniowania rozproszonego i obitego

- natężenie promieniowania pochłoniętego

- natężenie promieniowania przechodzącego przez roztwór

W przypadku roztworów, w których nie ma zawiesin, wartość można praktycznie pominąć:

Rys.1. Schemat ilustrujący zjawisko absorpcji promieniowania.

I Prawo absorpcji (prawo Lamberta)

Wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez jednorodny ośrodek absorbujący o grubości b ulega osłabieniu wg równania:

gdzie:

- natężenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek absorbujący

– natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący

– grubość warstwy absorbującej

– współczynnik absorpcji

– podstawę logarytmów naturalnych.

I prawo absorpcji można zatem sformułować w sposób następujący:

Absorpcja jest proporcjonalna do grubości warstwy absorpcyjnej, jeśli wiązka promieniowania monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.

II Prawo absorpcji (prawo Lamberta – Beera)

Prawo to dotyczy absorpcji promieniowania przez roztwór i można je sformułować w następujący sposób: jeśli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to wiązka promieniowania monochromatycznego, po przejściu przez jednorodny roztwór substancji absorbującej o stężeniu c, ulega osłabieniu według równania:

Prawo to można sformułować w sposób następujący:

Jeżeli współczynnik absorpcji rozpuszczalnika jest równy zeru, to absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego przechodzącej przez jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalny do stężenia roztworu c i do grubości warstwy absorbującej b.

III Prawo absorpcji (prawo addytywności absorpcji)

Absorpcja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:

Gdzie:

,, są to absorbancje poszczególnych składników.

W równaniu:

- właściwy współczynnik absorpcji, gdy stężenie wyrażamy w kg ∙ dm -3 lub g ∙ cm -3.

Natomiast, gdy stężenie c wyrażamy w mol ∙ dm -3, równanie to przybiera postać:

Gdzie ε jest to molowy współczynnik absorpcji, a jego wymiar podawany jest dwojako:
[dm3 ∙ mol -1].

c) Instrumenty wykorzystane w doświadczeniu

–spektofometr Spekol

BUDOWA WEW.

DZIAŁANIE

Źródłem (1) emitowanego światła jest lampa wolframowa (zakres 420-750 nm) lub

lampa rtęciowa HQE (365-750 nm). Światło przechodząc przez kondensor (2) ulega odbiciu od zwierciadła (3) następnie przechodzi przez szczelinę wejściową (4) do kolimatora, gdzie 5po przejściu przez układ achromatyczny (5) pada na monochromator (6), którym jest siatka dyfrakcyjna. Przy pomocy układu dźwigni, poruszanych bębnem (14), możliwe jest obracanie siatką dyfrakcyjną i dzięki temu w szczelinie wyjściowej monochromatora uzyskuje się wiązkę o żądanej długości fali. Szerokość spektralna przepuszczonych przez szczelinę wiązek monochromatycznych wynosi 12 nm. Wiązka o wybranej długość, po przejściu przez soczewkę achromatyczną (7), trafia na szczelinę wyjściową (8) i po przejściu przez kuwetę z roztworem badanym (9) i filtr barwny służący do pochłaniania promieniowania cieplnego (10) pada na detektor (11). Najczęściej detektorem jest fotoogniwo selenowe. Powstały w fotoogniwie fotoprąd ulega wzmocnieniu we wzmacniaczu (12) a następnie dostaje się do urządzenia pomiarowego (13)

BUDOWA ZEW.

d) Wzory robocze

• Część pierwsza

• Częśc druga

Gdzie:

-objętość roztworu wyjściowego, którą uzupełnia się wodą do objętości

, żeby uzyskać stężenie

- objętość roztworu o stężeniu

-stężenie roztworu, które należy otrzymać

-stężenie roztworu wyjściowego

e) Wykonanie pomiaru

Część pierwsza:

1. Włączyć spektrofotometr do sieci

2. Przesłonę zamknąć, ustawiając pokrętło w pozycji 0

3. Wskazówkę miernika sprowadzić do pozycji 0% za pomocą potencjometru. Odczekać około 2 min i ponownie wykonać „zerowanie” miernika

4. Nastawić długość fali na wybraną wartość. Pomiary wykonujemy olejno dla długości fal w przedziale widma absorpcji badanej substancji (przedział podaje prowadzący) co 5 lub 10nm

5. Ustawić koszyczek tak, by kuwetę z odnośnikiem wprowadzić w bieg wiązki świetlnej

6. Otworzyć przesłonę (pozycja 1)

7. Za pomocą potencjometru ustawić wskazówkę miernika na wartość 100%

8. Roztwór ryboflawiny o stężeniu c₀ = 10^-5 M/I wprowadzić w bieg promieni i odczytać wskazania ekstynkcji i transmisji

9. Potencjometr „100” cofnąć o kila obrotów w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara

10. Dla każdej długości fali powtarzać czynności od punktu 5

11. Wyniki zestawić w tabelce

12. Wykreślić zależność E = f(λ) i T = f(λ)

Lp.	λ(nm)	E(A)	T

Część druga:

1. Przygotować roztwory wzorcowe. Z roztworu o podanym stężeniu, np. 10^-3 g/ml, przygotować metodą rozcieńczenia, co najmniej 5 roztworów o stężeniach niższych. Zakres stężeń podaje prowadzący. W ćwiczeniu będą to z reguły roztwory wodne.

2. Zmierzyć widmo absorpcji badanej substancji, czyli zależność absorbancji A od długości fali, w roztworze wzorcowym o największym stężeniu. Przy pomiarach roztworów wodnych jako odnośnik należy stosować wodę destylowaną. Na podstawie otrzymanych wyników pomiarów trzeba określić długość fali, przy której absorbancja osiąga wartość maksymalną

3. Ustawić długość fali światła padającego na kuwetę w spektrofotometrze na wartość wyznaczoną w punkcie 3. Przy tej długości fali zmierzyć absorbancję A wszystkich roztworów wzorcowych. Wyniki zestawić w tabelce. Wykreślić krzywą wzorcową, czyli zależność absorbancji od stężenia roztworów wzorcowych A = f(C)

4. Zmierzyć absorbancję roztworów badanych o nieznanym stężeniu przy tej samej długości fali. Z krzywej wzorcowej odczytać wartość stężenia badanej substancji, wyniki zestawić w tabelce.

Roztwory o stężeniach $(\frac{g}{\text{ml}})$	Absorbancja A	Przepuszczalność T
C0 = C1 = C2 = C3 = C4 = C5 = Cx1 = Cx2 =