Amplifikacja fragmentu genu RYR1 świni.
Oczekiwana wielkość produktu PCR - 659 pz
Sekwencja starterów
RYR1-1 5’ TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA
RYR1-2 5’ ATT CAC CGG AGT GGA GTC TCT GAG
Sporządzić mix, zawierający wszystkie składniki reakcji oprócz matrycy, na badaną liczbę próbek (+ jedna kontrolna negatywna, tzw.0- bez matrycy + 1 ‘zapasowa’) – wygodniejsze, mniejszy błąd, oszczędności.
Składanie reakcji w rękawiczkach i na lodzie!!!
Skład mieszaniny reakcyjnej
| Składnik | Stężenie wyjściowe | Objętość na 1 próbkę (μl) | Objętość na 5 próbek (μl) (mix) |
|---|---|---|---|
| DNA | 150-200 ng/μl | 1 | |
| Bufor | 10x | 2 | |
| dNTP | 1,25 mM | 2 | |
| Primer F | 5 μM | 1 | |
| Primer R | 5 μM | 1 | |
| Polimeraza | 2U/ μl | 0,2 | |
| Woda | - | ||
| Objętość końcowa | 20μl |
Warunki reakcji PCR
| Etap | Temperatura (o C) | Czas (min.) |
|---|---|---|
Denaturacja wstępna Denaturacja Wiązanie starterów Synteza Synteza końcowa Przechowywanie |
94 94 60 72 72 4 |
5 0,5 0,5 1 10 do czasu dalszych analiz |
| Liczba cykli 40 |
2. Elektroforeza w 1,5% żelu agarozowym
Przygotować produkty PCR do analizy
2 μl buforu obciążającego nałożyć na płytkę i dodać 5 μl produktu PCR
Nałożyć próby do kieszonek żelu (+ 2,5 μl markera wielkości)
Włączyć zasilanie (ok. 100V) i prowadzić elektroforezę przez ok. 30 min
Wyłączyć zasilanie, wyjąć żel z aparatu i podświetlić lampą UV, obserwując uzyskane prążki DNA.
Uwaga! Bromek etydyny jest mutagenem – należy stosować rękawice lateksowe lub nitrylowe