Ćwiczenie 1

Wyznaczanie energii aktywacji i krzywych progresji

Zadanie 1: Wyznaczanie energii aktywacji dla reakcji hydrolizy (inwersji) sacharozy

Sacharoza, czyli α-D-glukopiranozydo-β-D-fruktofuranozyd jest dwucukrem, który z powodu obecności formy furanozowej fruktozy w cząsteczce bardzo łatwo hydrolizuje nawet pod wpływem rozcieńczonych kwasów. Podczas hydrolizy dochodzi do odwrócenia kąta skręcania światła spolaryzowanego. W efekcie z prawoskrętnej sacharozy powstaje mieszanina lewoskrętnej fruktozy (lewulozy) i prawoskrętnej glukozy (dekstrozy) o dominującej skręcalności w lewo. Przebieg reakcji hydrolizy sacharozy z zaznaczeniem kątów skręcania światła spolaryzowanego przedstawiono na poniższym schemacie.

C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O → C₆H₁₂O₆ + C₆H₁₂O₆

[α]²⁰_D = + 66^o [α]²⁰_D = + 52,7^o [α]²⁰_D = - 92^o

Proces hydrolizy sacharozy może zachodzić, jak już wspomniano, pod wpływem nawet rozcieńczonych kwasów, ale także może być katalizowany swoiście przez β-D-fruktofuranozydazę (EC 3.2.1.26) zwaną również inwertazą lub sacharazą lub nieswoiście przez enzym α-glukozydazę.

a) Hydroliza kwasowa

Do trzech probówek (dwie próby właściwe, jedna kontrola) rozlać po 5 ml 1% sacharozy. Jedną probówkę umieścić w łaźni wodnej w temp. 30 ^oC, drugą w łaźni w temp. 40 ^oC i dogrzewać ok. 5 min. Po dogrzaniu dodać do obu probówek po 1 ml 2,5 % kwasu solnego (stoper!), wymieszać i pozostawić w łaźni przez 20 min. Przerwać reakcję hydrolizy (inwersji) dodając po 0,45 ml mieszaniny zobojętniającej ( Na₂CO₃ + NaHCO₃ / 100 ml) mieszać do całkowitego wypienienia i ostudzić. Do trzeciej probówki - kontroli dodać najpierw mieszaniny zobojętniającej a potem kwasu (nie zachodzi reakcja hydrolizy). Roztwory z każdej probówki rozcieńczyć 15 razy wodą destylowaną, a następnie z każdego roztworu pobrać 1 ml i przenieść do nowych probówek.

Oznaczanie ilości cukrów redukujących metodą Somogyi - Nelsona

Z wzorcowego roztworu glukozy 10 mg% sporządzić wzorce o stężeniu glukozy równym:
0 (woda), 2,5 mg%, 5 mg%, 7,5 mg%, 10 mg% tzn.: do kolejnych probówek odmierzyć:

Glukoza [ml]	Woda [ml]	Stężenie [mg%]
0,00	1,00	0,0
0,25	0,75	2,5
0,50	0,50	5,0
0,75	0,25	7,5
1,00	0,00	10,0

Do każdej probówki (właściwe, kontrole i wzorce) dodać po 1 ml odczynnika miedziowego Somogyi, zamieszać i wstawić na wrzącą łaźnię wodną, gotować 10 min. Ostudzić i dodać po 1 ml odczynnika arsenomolibdenowego Nelsona. Mieszać otwarte probówki do całkowitego wypienienia i rozpuszczenia tlenku miedzi (I). Dopełnić wodą do 10 ml, zatkać korkiem i wymieszać. Zmierzyć absorbancję przy długości fali równej 500 nm. Sporządzić krzywą wzorcową i odczytać stężenie monosacharydów w badanych próbach. Przeliczyć stężenie cukrów na ich ilość w badanej próbce.

b) Hydroliza enzymatyczna

Do trzech probówek (dwie próby właściwe, jedna kontrola) odmierzyć po 0,5 ml 2 % roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 5,0. Jedną probówkę umieścić w łaźni wodnej w temp. 30 ^oC, drugą w łaźni w temp. 40 ^oC i dogrzewać ok. 2 min. Po dogrzaniu dodać do obu probówek 0,5 ml roztworu inwertazy o stężeniu 0,25 mg% (stoper!), zamieszać i pozostawić w łaźniach przez 20 min. Przerwać reakcję dodając do probówek po 1 ml odczynnika miedziowego Somogyi. Do trzeciej probówki – kontroli, pozostawionej w pokojowej temperaturze, dodać najpierw 1 ml odczynnika Somogyi a potem 0,5 ml roztworu inwertazy. Do probówek dołączyć serię wzorców glukozy i postępować dalej jak przy oznaczaniu cukrów redukujących po hydrolizie kwasowej.

Obliczenia: obliczyć energię aktywacji dla obu katalizowanych reakcji wg poniższych zasad.

Wyznaczanie energii aktywacji

Energia aktywacji G_a jest wielkością, która obok K_m i k_cat charakteryzuje właściwości katalityczne enzymu. G_a wyznacza się z szybkości początkowej reakcji oznaczonej w różnych temperaturach. Z danych doświadczalnych sporządza się wykres Arrheniusa, na którym log v₀ odkłada się jako funkcję odwrotności temperatury bezwzględnej T. Zależność log v₀ od 1/T jest prostoliniowa.

Rysunek 1. Krzywe Arrheniusa odpowiadające różnym energiom aktywacji.
a = 20,9 kJ /mol (5 kcal/mol); b = 41,8 kJ /mol (10 kcal/mol); c = 62,7 kJ /mol (15 kcal/mol).

Nachylenie krzywej Arrheniusa w stosunku do osi odciętych jest miarą energii aktywacji. Można ją obliczyć ze wzoru:

G_a= 2,3 ^. R ^.

w którym: R = stała gazowa wynoszącą 8,3170 J/(1^ox mol) tj. 1,9869 cal/(1^ox mol)

T = temperatura wyrażona w stopniach Kelwina.

Zadanie 2: Wyznaczanie krzywej progresji dla rozkładu sacharozy przez inwertazę

Krzywe progresji to krzywe przedstawiające zależność ilości przetworzonego substratu, lub częściej, utworzonego produktu, od czasu trwania reakcji. Obrazują one przebieg reakcji enzymatycznej w obecności enzymu w stałym stężeniu i wybranym stężeniu początkowym substratu. Krzywe progresji sporządza się w celu wyznaczenia szybkości początkowej reakcji enzymatycznej, która jest miarą aktywności enzymu. Szybkość reakcji jest równa tangensowi kąta nachylenia krzywej progresji, można więc ją wyliczyć ze wzoru V = tg P₁/t₁, gdzie P₁ to ilość wytworzonego produktu w czasie t₁.

Postępowanie:

Do kolbki stożkowej odmierzyć 50 ml 0,1 % roztworu sacharozy w buforze octanowym o pH 5,0. Kolbkę umieścić w łaźni wodnej w temp. 40 ^oC na ok. 10 min. W tym czasie przygotować na statywie 16 probówek do każdej rozlać po 1 ml odczynnika Somogyi + 0,8 ml wody.

Z roztworu wzorcowego glukozy 10,0 mg% sporządzić serię wzorców o stężeniach:
0 (woda), 2,5 mg%, 5,0 mg%, 7,5 mg% i 10,0 mg% jak w poprzednim doświadczeniu.

Do kolbki stożkowej z roztworem sacharozy dodać 0,75 ml lub 1 ml roztworu inwertazy o stężeniu 0,25 % (stoper!), zamknąć korkiem, wymieszać i pozostawić w łaźni. Od momentu dodania enzymu najpierw co 2 minuty (od 2 do 20 minuty), potem w 25, 30, 35, 40, 50 i 60 minucie odbierać z kolbki po 0,2 ml roztworu i przenosić do przygotowanych wcześniej probówek z odczynnikiem Somogyi.

Po wymieszaniu wszystkie probówki (16 odebranych prób i wzorce) umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować 10 minut, ostudzić, dodać po 1 ml odczynnika arsenomolibdenowego, dokładnie wymieszać i dopełnić do 10 ml. Odczytać absorbancję przy długości fali równej 500 nm. Sporządzić krzywą wzorcową i odczytać z niej stężenie wytworzonych cukrów w kolejno pobieranych próbach. Sporządzić wykres zależności stężenia cukrów od czasu trwania hydrolizy. Przeliczyć stężenie cukrów na ich ilość w badanej próbce. Wyniki przedstawić w tabelce i na rysunku.

minuty inwersji	absorbancja	stężenie glukozy	ilość glukozy	V reakcji
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
25
30
35
40
50
60

Literatura: Witwicki J, Ardelt W. Elementy enzymologii. Rozdział 3 i podrozdziały od 1.1 do 1.4.

Ćwiczenie 2

Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

Zadanie 1 i 2: Wyznaczanie stałej Michaelisa-Menten K_m dla reakcji hydrolizy skrobi (1)
i maltozy (2) przez glukoamylazę.

Przy stałym stężeniu enzymu szybkość reakcji enzymatycznej zależy w pewnych granicach od stężenia substratu. Przy bardzo niskim stężeniu substratu szybkość reakcji zależy liniowo (wprost proporcjonalnie) od tego stężenia (reakcja rzędu I). Przy bardzo wysokich - w stosunku do stężenia enzymu - stężeniach substratu szybkość reakcji osiąga wartość maksymalną i niezależną od dalszego zwiększania stężenia substratu (reakcja rzędu 0). Przy pośrednim stężeniu substratu mamy do czynienia z reakcją rzędu ułamkowego. Takie stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga wartość równą połowie szybkości maksymalnej V_max, wyrażone w mol na dm³ ewentualnie w gramach na dm³ określa się mianem stałej Michaelisa-Menten (K_m). Im mniejszego potrzeba stężenia substratu [S], aby uzyskać szybkość reakcji równą połowie V_max, tym mniejsza jest wartość K_m i tym większe powinowactwo enzymu do substratu, będące odwrotnością stałej Michaelisa (1/K_m). Wyznaczenie wartości K_m pozwala określić stopień powinowactwa różnych enzymów do różnych substratów lub jednego enzymu do kilku substratów.

Odczynniki:

- 1 % roztwór skrobi rozpuszczalnej w buforze octanowym o pH 4,5

- 1 % roztwór maltozy w buforze octanowym o pH 4,5

- wzorcowy roztwór glukozy o stężeniu 10 mg% (10 mg w 100 ml)

- bufor octanowy o pH 4,5

- reagent GOX sporządzony na krótko przed analizą (12 mg oksydazy glukozowej + 4 ml peroksydazy 20 mg% w Tris-buforze + 0,6 ml o-dianizydyny 1 % w 96 % etanolu uzupełnione do 100 ml Tris-buforem)

- H₂SO₄

- roztwór glukoamylazy (AMG NOVO rozcieńczony 1: 25000)

Przygotowanie różnych stężeń substratów:

z 1 % roztworów skrobi i maltozy sporządzić roztwory o stężeniach: 0,8 %, 0,6 %, 0,4 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,02 % i 0,01 % rozcieńczając je buforem (a nie wodą!) to znaczy do probówek odmierzyć:

0,8 % = 2,0 ml 1 % skrobi /maltozy + 0,5 ml buforu octanowego o pH 4,5

0,6 % = 1,5 ml 1 % skrobi /maltozy + 1,0 ml buforu octanowego o pH 4,5

0,4 % = 1,0 ml 1 % skrobi /maltozy + 1,5 ml buforu octanowego o pH 4,5

0,2 % = 0,5 ml 1 % skrobi /maltozy + 2,0 ml buforu octanowego o pH 4,5

0,1 % = 0,5 ml 1 % skrobi /maltozy + 4,5 ml buforu octanowego o pH 4,5 z tego roztworu dalej:

0,05 % = 1,25 ml 0,1 % skrobi /maltozy + 1,25 ml buforu octanowego o pH 4,5

0,02 % = 0,50 ml 0,1 % skrobi /maltozy + 2,00 ml buforu octanowego o pH 4,5

0,01 % = 0,25 ml 0,1 % skrobi /maltozy + 2,25 ml buforu octanowego o pH 4,5

Wzorce glukozy: 0 mg%, 2 mg%, 4 mg%, 6 mg%, 8 mg% i 10 mg%. Do probówek odmierzyć:

Glukoza [ml]	Woda [ml]	Stężenie [mg%]
0,0	0,5	0
0,1	0,4	2
0,2	0,3	4
0,3	0,2	6
0,4	0,1	8
0,5	0,0	10

Postępowanie:

Zaczynając od najniższego stężenia substratu tj. skrobi lub maltozy do dwóch probówek odmierzyć po 0,25 ml 0,01 % skrobi (maltozy), do dwóch następnych po 0,25 ml 0,02 % skrobi (maltozy) itd. Jedna probówka z każdego stężenia będzie próbą właściwą a druga kontrolną wg schematu:

próba	1	2	3	4	5	6	7	8	9
właściwa	0,01 %	0,02 %	0,05 %	0,1 %	0,2 %	0,4 %	0,6 %	0,8 %	1 %
kontrola	0,01 %	0,02 %	0,05 %	0,1 %	0,2 %	0,4 %	0,6 %	0,8 %	1 %

Wszystkie próby właściwe, kontrolne i wzorce wstawić do ultratermostatu o temp. 30 ^oC i dogrzewać ok. 5 min.

Do prób właściwych ze skrobią i maltozą dodawać kolejno, co 30 sekund, po 0,25 ml roztworu enzymu (zamieszać) i pozostawić w ultratermostacie. Dokładnie po 15 minutach przerwać reakcję dodając kolejno do każdej próby właściwej po 1,5 ml odczynnika GOX (zamieszać). Po godzinie (od momentu dodania GOX) dodać do każdej próby po 2,5 ml H₂SO₄, wyjąć z ultratermostatu zatkać korkiem i wymieszać.

Do prób kontrolnych dodać najpierw po 1,5 ml odczynnika GOX też w odstępach trzydziestosekundowych a następnie, dokładnie po 15 minutach po 0,25 ml roztworu enzymu. Po godzinie (od momentu dodania GOX) dodać do każdej próby po 2,5 ml H₂SO₄, zamieszać i wyjąć z ultratermostatu.

Do wzorców glukozy dodać co 30 s po 1,5 ml odczynnika GOX i dokładnie po godzinie, licząc od pierwszego wzorca, również co 30 sekund po 2,5 ml H₂SO_4, zamieszać i wyjąć z ultratermostatu.

Zmierzyć ekstynkcję wszystkich prób właściwych, kontrolnych i wzorców przy długości fali równej 530 nm.

Sporządzić krzywą wzorcową i odczytać z niej stężenie glukozy w próbach właściwych i kontrolach. Od stężenia glukozy w próbach właściwych odjąć stężenie glukozy w odpowiadających im kontrolach. Otrzymana różnica (Δ) jest miarą ilości wytworzonej glukozy, a więc miarą efektywności działania enzymu.

Sporządzić tabelkę i wykres zależności ilości wytworzonej glukozy od stężenia użytego w reakcji substratu. Z wykresu podwójnych odwrotności Lineweavera-Burka (zależność 1/V od 1/[S]) wyznaczyć wartość K_m dla obu substratów. Porównać powinowactwo glukoamylazy do każdego z substratów.

stężenie substratu [%]	glukoza w próbie właśc. [mg%]	glukoza w próbie kontr. [mg%]	Δ stężeń (W-K)	ilość wytworzonej glukozy [μmol]	V reakcji [μmol/min]
0,005
0,010
0,025
0,050 itd.
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

Literatura: Witwicki J, Ardelt W. Elementy enzymologii. Rozdział 4 i podrozdział 1.6.

Ćwiczenie 3

Sporządzanie wykresów kinetyki enzymatycznej i wyznaczanie typów inhibicji.

Inhibitory są substancjami zmniejszającymi szybkość reakcji enzymatycznej. Inhibicja reakcji enzymatycznej jest jednym ze sposobów regulacji różnych procesów życiowych w komórce. Rozróżniamy dwa typy inhibicji: nieodwracalną i odwracalną. Inhibicja nieodwracalna polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały, nieodwracalny, często poprzez wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów znajdującymi się w miejscu aktywnym enzymu lub w jego pobliżu. W przeciwieństwie do inhibicji nieodwracalnej inhibicję odwracalną charakteryzuje zdolność do dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor, a ze względu na różny sposób oddziaływania inhibitorów odwracalnych na cząsteczkę enzymu wyróżnia się następujące główne typy inhibicji odwracalnej: kompetycyjną, niekompetycyjną, akompetycyjną i mieszaną. Rodzaj inhibicji można rozpoznać wyznaczając i porównując V_max i K_m reakcji inhibitowanej i niehamowanej. W tym celu stosuje się różne przekształcenia równania Michaelisa-Menten, umożliwiające uzyskanie prostoliniowej zależności pomiędzy v_o i [S]. Najczęściej stosuje się 3 metody linearyzacji: Lineweavera-Burka, Hanesa-Woolfa i Wolfa-Augustinsson-Hofstee. Krzywe Lineweavera-Burka przedstawiają zależność 1/v = ƒ(1/[S]), krzywe Hanesa-Woolfa: [S]/v = ƒ([S]), a krzywe Wolfa-Augustinsson-Hofstee v = ƒ(v/[S]). Inhibitory enzymów należą do narkotyków, antybiotyków, środków konserwujących, różnego rodzaju trucizn i toksyn.

Odczynniki:

• bufor octanowy 0,05 M o pH 4,5

• pNPP (p-nitrofenylofosforan), czyli O₂NC₆H₄OP(O)(ONa)₂·2H₂O firmy Sigma – substrat. Przygotowywać zawsze świeży roztwór o stężeniu 20 mM (742,2 mg/100 ml) i 6 mM (222,63mg/100 ml).

• pNP (p-nitrofenol) firmy Sigma – wzorzec. Roztwór wyjściowy o stężeniu 0,08 mM (27,83 mg/50 ml wody i rozcieńczyć 50x) przygotowywać zawsze świeży.

• Fosforan (V), czyli Na₂HPO₄ – inhibitor. Przygotować roztwory o stężeniu 5, 10, 15, 20 i 30 mM w buforze fosforanowym, (30 mM = 425,88 mg/100 ml)

• Kwaśna fosfataza (EC 3.1.3.2) – enzym rozcieńczony 1 500 000 x buforem o pH 4,5. Przygotowywać zawsze świeży.

• 0,8 M NaOH

Zasada oznaczeń

Do oznaczania aktywności kwaśnej fosfatazy wybrano metodę Boseya i Lowryego. Metoda ta opiera się na zdolności kwaśnej fosfatazy do hydrolizy syntetycznego substratu, którym jest p-nitrofenylofosforan, na p-nitrofenol i fosforan (V). Aktywność enzymu oznacza się na podstawie ilości uwolnionego p-nitrofenolu, który po zalkalizowaniu środowiska przyjmuje intensywnie żółtą barwę, której natężenie mierzy się kolorymetrycznie przy długości fali λ= 400 nm.

Zadanie 1: Wyznaczanie krzywej miareczkowania enzymu inhibitorem

Przygotowanie próbek: do dwóch szeregów złożonych z 6 probówek wprowadzić po 2 ml 6 mM roztworu pNPP (substratu). Do pierwszej probówki z każdego szeregu dodać 1,9 ml buforu, do następnych po 1,9 ml roztworu inhibitora kolejno o stężeniu 5, 10, 15, 20 i 30 mM. Jeden szereg probówek, oznaczony jako próby właściwe umieścić w łaźni o temperaturze 30 ^oC celem dogrzania. Drugi, oznaczony jako próby kontrolne pozostawić w temp. pokojowej.

Próby właściwe: po około 3 minutach dogrzewania do każdej próby właściwej dodać (dokładnie ze stoperem, w odstępach 30 s) po 0,1 ml roztworu enzymu, zamieszać i inkubować. Czas inkubacji w każdej probówce powinien wynosić dokładnie 15 min. Po tym czasie do każdej probówki dodać 0,5 ml 0,8 M NaOH, zamieszać i wyjąć probówki z łaźni. Odczytać absorbancję przy 400 nm.

Próby kontrolne: do wszystkich prób kontrolnych najpierw wprowadzić po 0,5 ml 0,8 M NaOH i dokładnie wymieszać, następnie dodać po 0,1 ml enzymu. Odczytać absorbancję przy 400 nm.

Próby wzorcowe: ze standardowego roztworu pNP przygotować rozcieńczenia:

0,0 µM = 0,0 ml standardu + 4,0 ml buforu

20 µM = 1,0 ml standardu + 3,0 ml buforu

40 µM = 2,0 ml standardu + 2,0 ml buforu

60 µM = 3,0 ml standardu + 1,0 ml buforu

Do każdego wzorca dodać 0,5 ml 0,8 M NaOH i 0,5 ml i wymieszać. Odczytać absorbancję przy 400 nm.

Obliczenia: Na podstawie odczytów absorbancji dla wzorców przygotować krzywą wzorcową. Z krzywej wzorcowej odczytać stężenie produktu (pNP) w próbach właściwych i kontrolach. Wyniki otrzymane dla prób kontrolnych odjąć od odpowiednich prób właściwych (W-K). Na podstawie uzyskanych wyników wyliczyć resztkową aktywność pepsyny. Sporządzić wykres zależności aktywności resztkowej enzymu od stężenia inhibitora.

Zadanie 2: Badanie typu inhibicji

Przygotowanie różnych stężeń substratu:

Z 20 mM roztworu pNPP sporządzić roztwory o stężeniach: 16, 10, 4 i 2 mM. Każdy z otrzymanych roztworów substratu, począwszy od stężenia 2 mM a skończywszy na stężeniu 20 mM rozlać po 2 ml do czterech probówek. Tak by powstały cztery szeregi po 5 probówek każdy. Do pierwszych dwóch szeregów probówek dodać po 1,9 ml buforu (reakcja niehamowana, próby właściwe i kontrole) a do następnych po 1,9 ml roztworu inhibitora o stężeniu 5 mM (reakcja hamowana, próby właściwe i kontrole).

Próby właściwe: Po jednym szeregu probówek z inhibitorem i bez inhibitora (razem 10 probówek) umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 30 ^oC celem dogrzania. Dalej postępować jak z próbami właściwymi w zadaniu 1.

Próby kontrolne: z pozostałymi dwoma szeregami probówek (jeden szereg z inhibitorem drugi bez) postępować analogicznie jak z próbami kontrolnymi w zadaniu 1, tzn. do wszystkich probówek dodać po 0,5 ml 0,8 M NaOH, zamieszać. Następnie dodać po 0,1 ml roztworu enzymu. Nie inkubować. Wymieszać i czytać absorbancję przy 400 nm.

Obliczenia: wykreślić prostoliniowe zależności metodą Lineweavera-Burka (1/v do 1/[S]), Hanesa-Woolfa ([S]/v od [S]) i Wolfa-Augustinsson-Hofstee (v od v/[S]), przyjmując uzyskane wartości absorbancji jako szybkość v. Ze sporządzonych wykresów dla danych otrzymanych bez inhibitora i w jego obecności obliczyć V_max i K_m. Porównać otrzymane wartości i wyciągnąć wnioski co do typu inhibicji.

Zestawienie danych niezbędnych do sporządzania wykresów:

a) bez inhibitora

Lp.	Stężenie substratu [S]	1/[S]	Szybkość reakcji vo (A)	1/vo	[S]/vo	Vo/[S]
1 2 3 4 5

b) w obecności inhibitora

Lp.	Stężenie substratu [S]	1/[S]	Szybkość reakcji vo (A)	1/vo	[S]/vo	Vo/[S]
1 2 3 4 5

Literatura: Witwicki J, Ardelt W. Elementy enzymologii. Podrozdział 4.1.4 i 6.2.4.

Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z enzymologii, rozdział 11.3.4.

Ćwiczenie 4

Wyznaczanie optymalnej temperatury działania i termostabilności enzymów

Temperatura wpływa na wszystkie stadia reakcji enzymatycznej a więc powstawanie kompleksu ES, przekształcanie go w kompleks EP i dysocjację tego ostatniego. Może też wpływać na wiązanie aktywatorów i inhibitorów. Wpływ temperatury na szybkość reakcji można określić liczbowo za pomocą współczynnika Q₁₀, który wyraża się wzorem: Q₁₀ = V_t+10 / V_t. Za pomocą współczynnika Q₁₀ można wyliczyć o ile % zmieni się szybkość reakcji przy wzroście temperatury o 10^oC. Podwyższenie temperatury powoduje z zasady przyspieszenie szybkości reakcji. Po podwyższeniu temperatury o szybkość reakcji zwiększa się przeważnie 2-3 krotnie. Dotyczy to zarówno reakcji niekatalizowanych jak i prowadzonych z udziałem katalizatorów nieorganicznych, a także reakcji enzymatycznych.

Enzymy w ogromnej większości są białkami, dlatego w podwyższonej temperaturze mogą ulegać denaturacji i tracić swoje własności biologiczne. W reakcji enzymatycznej początkowo wraz ze wzrostem temperatury zwiększa się szybkość reakcji. Jednak po osiągnięciu pewnego optimum, różnego dla różnych enzymów i przyjętego czasu reakcji, szybkość reakcji spada z powodu denaturacji cieplnej białka enzymowego i jego inaktywacji. Białka enzymowe, za wyjątkiem niektórych termostabilnych enzymów, zaczynają ulegać procesom denaturacji już powyżej temperatury 40-. W temperaturze wrzenia wody inaktywują się prawie wszystkie enzymy i jest to jeden ze sposobów odróżnienia enzymów od katalizatorów nieorganicznych. Termostabilność enzymu można określić podając najwyższą temperaturę, w której jeszcze nie dochodzi do jego termicznej inaktywacji.

Odczynniki:

- DNS (0,5 % roztwór kwasu dinitrosalicylowego w winianie potasowo-sodowym i ługu sodowym)

- 1 % roztwór skrobi w buforze octanowym o pH 4,5 (dla β-amylazy)

- 1 % roztwór skrobi w buforze Sörensena o pH 6,0 (dla α-amylazy)

- roztwór enzymu β-amylazy słodowej (rozcieńczony 1: 50 000)

- roztwór enzymu α-amylazy z Bacillus licheniformis tj. handlowego preparatu Maxamyl (rozcieńczony 1: 40 000 do zad.1 i 1 : 10 000 do zad.2)

- podstawowy roztwór maltozy o stężeniu 100 mg%

Przygotowanie wzorców maltozy:

Z podstawowego roztworu maltozy o stężeniu 100 mg% przygotować w probówkach serię wzorców o stężeniach: 0 mg% (woda), 20 mg%, 40 mg%, 60 mg%, 80 mg%, 100 mg% tzn. do probówek odmierzyć:

Maltoza [ml]	Woda [ml]	Stężenie [mg%]
0,0	1,0	0,0
0,2	0,8	20
0,4	0,6	40
0,6	0,4	60
0,8	0,2	80
1,0	0,0	100

Do tak przygotowanych wzorców maltozy dodać po 1 ml kwasu dinitrosalicylowego (DNS).

Zadanie 1: Wyznaczanie optymalnej temperatury dla działania α- i β-amylazy

Przygotować łaźnie wodne o temperaturach 30, 40, 50, 60, 70, 80 i 90 ^oC. Do 8 probówek rozlać po 0,5 ml roztworu skrobi o pH 4,5. Do następnych 8 probówek po 0,5 ml roztworu skrobi o pH 6,0. Z każdej serii probówek wstawić po jednej do łaźni wodnej o innej temperaturze (ósma probówka pozostaje jako kontrolna w temperaturze pokojowej). Po dogrzaniu przez ok. 2 min. do probówek w poszczególnych łaźniach, dodawać w odstępach minutowych, po 0,5 ml roztworu enzymu: β-amylazy do skrobi o pH 4,5 i α-amylazy do skrobi o pH 6,0. Zamieszać. Dokładnie po 15 minutach (od dodania enzymu do pierwszej probówki) również w odstępach minutowych przerywać reakcję dodając do każdej probówki po 1 ml odczynnika DNS. Ponownie zamieszać i wyjąć z łaźni. Do próby kontrolnej dodać najpierw 1 ml DNS a potem 0,5 ml odpowiedniego roztworu enzymu. Inkubacja nie jest tu konieczna.

Oznaczanie ilości cukrów redukujących w badanych próbach

Wszystkie probówki (próby właściwe z różnych temperatur, próbę kontrolną i wzorce) wstawić jednocześnie na wrzącą łaźnię wodną i gotować 5 minut. Ostudzić a następnie dodać po 8 ml wody destylowanej, zatkać korkiem i wymieszać. Odczytać ekstynkcję badanych prób przy 530 nm.

Zastosowana metoda oznaczania cukrów redukujących polega na utlenianiu kwasem
3,5-dinitrosalicylowym grup redukujących uwolnionych podczas hydrolizy skrobi przez amylazy. Zredukowany podczas tej reakcji DNS zmienia barwę z żółtej na pomarańczową. Natężenie powstałego produktu barwnego jest wprost proporcjonalne do ilości grup redukujących obecnych w roztworze.

Obliczenia

Na podstawie odczytanej ekstynkcji sporządzić krzywą wzorcową i odczytać z niej stężenie maltozy w próbach właściwych i kontrolnej. Od stężenia maltozy w próbach właściwych odjąć stężenie maltozy w próbie kontrolnej (Δ- stężenie maltozy wytworzonej przez enzym). Sporządzić tabelkę i wykres zależności ilości uwolnionej przez enzym maltozy od temperatury, w której przebiegała reakcja.

Zadanie 2: Badanie termostabilności α- i β-amylazy

Preinkubacja

Do 10 probówek rozlać po 0,5 ml roztworu β-amylazy lub α-amylazy. Przygotować dwie łaźnie wodne - jedną o temperaturze 60 ^oC a drugą o temperaturze 90 ^oC. Cztery probówki wstawić do łaźni na 60 ^oC, inne cztery do łaźni o temp. 90 ^oC. Dwie pozostałe probówki trzymać w pokojowej temperaturze. Dokładnie po 2,5 minutach od momentu wstawienia do łaźni wyjąć pierwszą probówkę i umieścić ją w wodzie z lodem, po 5 minutach wyjąć drugą probówkę, po 10 minutach trzecią i po 15 minutach czwartą. Tak samo postępować dla obu temperatur.

Reakcja właściwa

Ostudzone probówki (4 z łaźni o temp. 60 ^oC i 4 z łaźni o temp. 90 ^oC) umieścić w łaźni o temp. 30 ^oC, dodać jedną z probówek nie poddanych działaniu temperatury (opisaną jako kontrola dodatnia) i dogrzewać ok. 2 min. Następnie do wszystkich próbek kolejno, co 0,5 min. dodać po 0,5 ml roztworu skrobi o pH 4,5 lub 6,0. Dokładnie po 15 minutach przerwać reakcję dodając po 1 ml odczynnika DNS i wyjąć probówki z ultratermostatu. Do pozostawionej w temperaturze pokojowej dziesiątej probówki (kontrola ujemna) dodać najpierw 1 ml DNS a potem 0,5 ml roztworu skrobi o odpowiednim pH.

Oznaczanie ilości cukrów redukujących w badanych próbach

Wszystkie probówki wstawić na wrzącą łaźnię wodną i gotować 5 minut, ostudzić, dodać po 8 ml wody destylowanej, zatkać korkiem, wymieszać i odczytać ekstynkcję przy 530 nm.

Obliczenia

Jak w poprzednim doświadczeniu z krzywej wzorcowej wyliczyć stężenia maltozy wytworzonej w poszczególnych próbach. Stężenie maltozy w kontroli dodatniej przyjąć za 100 %. Wyliczyć procentowy spadek aktywności obu enzymów (aktywność resztkową) w zależności od czasu (2,5; 5, 10 i 15 minut) preinkubacji w poszczególnych temperaturach (60 i 90 ^oC). Sporządzić wykres zależności ilości uwalnianej przez enzym maltozy (przyrostu produktu) od czasu preinkubacji enzymów w obu temperaturach (krzywe progresji).

Literatura: Witwicki J, Ardelt W. Elementy enzymologii. Rozdział 2 i podrozdział 1.5.

Ćwiczenie 5

Otrzymywanie inwertazy (β-D- fruktofuranozydazy) z drożdży

Działanie enzymów bada się najczęściej stosując homogenny układ: enzym w roztworze (koloidowym) - substrat w roztworze. W przypadku enzymów zewnątrzkomórkowych (np. wydzielanych przez drobnoustroje do środowiska, enzymów trawiennych, surowicy krwi, różnych soków roślinnych) nie ma na ogół większych problemów z bezpośrednim użyciem materiału do analizy. Inaczej jest w przypadku enzymów znajdujących się wewnątrz komórek, wtedy pierwszą i podstawową czynnością jest kompletne a więc ilościowe przeprowadzenie białka enzymowego do roztworu. Enzymy wewnątrzkomórkowe mogą być zlokalizowane w cytoplazmie, lizosomach względnie w wakuolach, wewnątrz organelli komórkowych, mogą być związane z błonami lub ścianami komórkowymi. W zależności od tego stosuje się różne sposoby (mechaniczne, fizyczne i chemiczne) wydobywania ich z komórek i przeprowadzania w postać roztworu. Taka „ekstrakcja” powinna być zachowawcza tj. bezpieczna dla enzymu i kompletna.

Inwertaza drożdży jest enzymem cytoplazmatycznym. Wygodnym, ale nie jedynym sposobem jej uzyskania jest mechaniczne zniszczenie komórek drożdży i przeprowadzenie rozpuszczalnych składników cytoplazmy do roztworu. Gdy zamierzamy uzyskać częściowo oczyszczoną i stabilną postać tego enzymu kolejną czynnością jest zwykle zachowawcze wytrącenie białka enzymowego z roztworu. Taki strąt (osad) białkowy można uzyskać poprzez wysolenie (określone, duże stężenia np. siarczanu amonu) lub działanie alkoholem (etylowy, propylowy) o odpowiednim stężeniu.

Te czynności preparatywne mogą zarazem służyć frakcjonowaniu białek enzymowych. Otrzymany osad białka można stopniowo odwadniać (alkohol bezwodny, aceton - temp. < ) a dalej susząc odwodniony osad w pokojowej (lub niższej) temperaturze uzyskać łatwo rozpuszczalny proszek zazwyczaj stabilny w + przez kilka miesięcy a nawet lat.

Zadanie 1: Izolacja i oczyszczanie inwertazy drożdżowej

Materiał i odczynniki:

- handlowe drożdże piekarskie, sprasowane o zawartości suchej masy równej 27%

- 0,1% NaCl

- 96% etanol

- piasek, oczyszczony i wyprażony

Wykonanie:

Odważyć drożdży, przenieść do moździerza, który umieścić w łaźni lodowej, dodać piasku i 1 cm³ oziębionego 0,1% NaCl. Ucierać przez 15 min. dodając stopniowo (w ciągu 5 min.), porcjami 24 cm³ 0,1% NaCl. Zawiesinę przenieść ilościowo do probówki wirówkowej i odwirować (15 min., 4000 obrotów). Supernatant (płyn znad osadu) zlać do cylindra i zmierzyć objętość. Następnie do czterech probówek wirówkowych odmierzyć:

1. 2,5 ml supernatantu i 2,75 ml 96% etanolu – wytracanie białka w 50% etanolu

2. 2,5 ml supernatantu i 4,15 ml 96% etanolu - wytracanie białka w 60% etanolu

3. 2,5 ml supernatantu i 6,75 ml 96% etanolu - wytracanie białka w 70% etanolu

4. 1,6 ml supernatantu i 8,00 ml 96% etanolu - wytracanie białka w 80% etanolu

Zawartość probówek wirówkowych wymieszać, wstawić do lodówki na 15–20 minut w celu lepszego wytrącenia białek. Pozostały supernatant rozcieńczyć wodą 4, 5 i 6 razy w celu oznaczenia ilości białka, oraz 500 i 700 razy w celu oznaczenia aktywności inwertazy. Podpisać i do czasu wykonania oznaczeń przechowywać w lodówce.

Po upływie 15-20 minutach probówki wirówkowe wyjąć z lodówki i odwirować (15 min., 4000 obrotów/min.). Alkohol znad osadu (strątu) delikatnie zlać a strąty w probówkach wysuszyć w pokojowej temp. Następnie każdy z nich rozpuścić w wyjściowej objętości tj. 2,5 ml lub 1,6 ml oziębionego 0,1% NaCl. Uzyskane roztwory rozcieńczyć 3, 4 i 5 razy w celu oznaczenia ilości białka oraz 500 i 700 razy w celu oznaczenia aktywności inwertazy.

Zadanie 2: Oznaczanie aktywności inwertazy drożdżowej

Odczynniki:

- substrat: roztwór sacharozy 2% w buforze octanowym o pH 5,0

- wzorcowy roztwór glukozy o stężeniu 10 mg%

- odczynnik miedziowy Somogy

- odczynnik arsenomolibdenowy Nelsona

Wykonanie:

Roztwory z obu etapów izolacji inwertazy rozcieńczone 500 i 700 razy rozlać po 0,5 cm³, każdy do dwóch probówek opisanych jako próba właściwa i kontrola (razem 20 probówek). Dokładnie opisane probówki dla prób właściwych (10) umieścić w łaźni o temp. i dogrzewać ok. 2 min. Następnie do każdej probówki w odstępach półminutowych dodać po 0,5 cm³ sacharozy, wymieszać i dokładnie po 10 minutach w tych samych odstępach czasowych przerwać reakcję dodając do każdej probówki po 1 cm³ odczynnika miedziowego. Probówki wyjąć z łaźni.

Do próbek kontrolnych (10 probówek), pozostawionych w temperaturze pokojowej, dodać najpierw po 1 cm³ odczynnika miedziowego a następnie po 0,5 cm³ sacharozy (nie zachodzi reakcja inwersji).

Z podstawowego roztworu glukozy o stężeniu 10 mg% sporządzić serię wzorców o stężeniach: 0 mg%, 2,5 mg%, 5 mg%, 7,5 mg%, 10 mg% tzn. do probówek odmierzyć:

0,0 mg% = - 1,00 cm³ wody

2,5 mg% = 0,25 cm³ glukozy (0,05 mg) + 0,75 cm³ wody

5,0 mg% = 0,50 cm³ glukozy (0,10 mg) + 0,50 cm³ wody

7,5 mg% = 0,75 cm³ glukozy (0,15 mg) + 0,25 cm³ wody

10,0 mg% = 1,00 cm³ glukozy (0,20 mg) -

Do każdego wzorca dodać 1 cm³ odczynnika miedziowego Somogyi.

Wszystkie próbki (właściwe, kontrole i wzorce) z dodanym odczynnikiem miedziowym wymieszać i wstawić na wrzącą łaźnię wodną, gotować 10 min. Ostudzić i dodać 1 cm³ odczynnika arsenomolibdenowego Nelsona. Mieszać otwarte probówki do całkowitego rozpuszczenia tlenku miedzi (I). Dodać 8 cm³ wody destylowanej, zatkać korkiem i wymieszać. Odczytać ekstynkcję przy 500 nm w ciągu 15-45 minut od rozcieńczenia próbek wodą. Sporządzić krzywą wzorcową i odczytać z niej stężenie cukrów prostych w badanych próbach właściwych i kontrolach. Wyniki uzyskane dla prób kontrolnych odjąć od odpowiednich prób właściwych. Ilość wytworzonych cukrów redukujących jest miarą aktywności inwertazy.

Zadanie 2: Oznaczanie białka metodą Lowry’ego

Stosowana metoda oznaczania zawartości białka w roztworze opiera się na dwóch reakcjach. W pierwszej następuje przyłączenie jonów miedzi do wiązań peptydowych (reakcja biuretowa), w drugiej natomiast redukcja kwasu fosforowolframowego i fosforomolibdenowego (odczynnik Folina-Ciocalteu) do odpowiednich tlenków przez tyrozynę i tryptofan obecne w cząsteczkach białka enzymowego.

Odczynniki:

- roztwór Lowry I = 2% roztwór Na₂CO₃ w NaOH

- roztwór Lowry II = 0,5% roztwór CuSO₄ w 1% cytrynianie sodu

- odczynnik fenolowy Folina i Ciocalteu

- wzorcowy roztwór albuminy o stężeniu 10 mg%

Wykonanie:

Sporządzić na krótko przed analizą odczynnik Lowry'ego mieszając w cylindrze ze szlifem 75 cm³ roztworu Lowry I i 1,5 cm³ roztworu Lowry II.

Ze standardowego roztworu albuminy sporządzić szereg wzorców o stężeniach 0, 2, 4, 6, 8, 10 mg%. W tym celu do 6 probówek odmierzyć:

albumina 10 mg%	woda	stężenie
0,0 ml	1,0 ml	0 mg%
0,2 ml	0,8 ml	2 mg%
0,4 ml	0,6 ml	4 mg %
0,6 ml	0,4 ml	6 mg%
0,8 ml	0,2 ml	8 mg%
1,0 ml	0,0 ml	10 mg%

Roztwory z pierwszego etapu izolacji inwertazy rozcieńczone 4, 5 i 6 razy oraz roztwory z drugiego etapu izolacji enzymu rozcieńczone 3, 4 i 5 razy rozlać po 1 cm³ do nowych probówek. Do każdej probówki (wzorce i próbki właściwe) dodawać kolejno po 5 cm³ odczynnika Lowry'ego, dobrze wymieszać i pozostawić na 15 minut (stoper). Następnie dodawać kolejno po 0,5 cm³ odczynnika Folina-Ciocalteu, szybko wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37^oC na 40 minut. Po tym czasie probówki wyjąć z łaźni, ostudzić i odczytać ekstynkcję (w ciągu 30 min.) przy długości fali 650 nm.

Z odczytów ekstynkcji dla wzorców wykreślić krzywą wzorcową i na jej podstawie wyznaczyć zawartość białka w badanych próbkach.

Na podstawie uzyskanych w zadaniach 1 i 2 wyników obliczyć:

1. Aktywność właściwą enzymu dla obu etapów izolacji tj. stosunek oznaczonej aktywności enzymu do ilości białka [U/mg].

2. Wskaźnik oczyszczenia preparatu, tzn. stosunek aktywności właściwej preparatu uzyskanej po drugim etapie izolacji do aktywności właściwej w wyjściowym ekstrakcie.

3. Wydajność ogólną procesu izolacji, czyli stosunek aktywności enzymu po drugim etapie izolacji do wyjściowej aktywności enzymu razy 100%.

Literatura: Witwicki J, Ardelt W. Elementy enzymologii. Rozdział 7.

Kłyszejko-Stefanowicz L. Ćwiczenia z biochemii, rozdział 11.2.

Ćwiczenie 6

Wyznaczanie optymalnego pH działania enzymu i jego pH-stabilności

Wpływ pH na białko enzymowe jest dwojakiego rodzaju. W środowisku silnie kwasowym czy zasadowym białko ulega denaturacji i nieodwracalnie traci swoje własności biologiczne.

Dla każdego enzymu można wyznaczyć optymalną wartość pH, przy której katalizowana reakcja przebiega najszybciej. Nawet niewielkie odchylenia od tej wartości wpływają na zmniejszenie szybkości reakcji. Tłumaczy się to wpływem stężenia jonów wodorowych na stopień dysocjacji grup aminowych i karboksylowych występujących w rodnikach łańcucha peptydowego. Powoduje to wytworzenie innego układu ładunków w trzeciorzędowej strukturze białka enzymowego. Ponieważ aktywność enzymu związana jest ściśle z układem przestrzennym łańcucha, a zwłaszcza centrum aktywnego, nawet niewielkie zmiany pH mogą poważnie zmniejszyć aktywność enzymu.

Odczynniki:

1) Substrat ( glukozy rozpuszczonej w około 9 cm³ wody + 2,5 mg POD + 1,8 cm³ 1% o-dianizydyny w 96% etanolu, w 100 cm³)

2) Bufory Mc Ilvaina o pH 2.6, 3.2, 3.8, 4.4, 5.0, 5.6, 6.2, 6.8, 7.4 i 8.0

3) Roztwory oksydazy glukozowej o stężeniach: a) 0,2 mg% i b) 4 mg%

4) Wzorce H₂O₂ o stężeniach: 0,08 µmol/cm³, 0,2 µmol/cm³, 0,4 µmol/cm³, 1,2 µmol/cm³

5) H₂SO₄

6) Mieszanina substrat [1] z buforem [2] o pH 5,6 (1 część substratu + 2 części buforu).

Zadanie 1. Wyznaczanie optimum pH dla oksydazy glukozowej

Do 10 probówek odmierzyć po 1 cm³ substratu [1]. Do pierwszej probówki dodać 2 cm³ buforu o pH 2,6, do drugiej 2 cm³ buforu o pH 3,2, do trzeciej 2 cm³ buforu o pH 3,8 itd. do dziesiątej buforu o pH 8,0.

Do tak zbuforowanych roztworów substratu o różnym pH dodawać kolejno co 1 minutę po 1 cm³ roztworu oksydazy glukozowej [3a] o stężeniu 0,2 mg%, zamieszać. Inkubację prowadzić w temperaturze pokojowej. Dokładnie po 15 minutach (od momentu dodania enzymu) przerwać reakcję dodając kolejno do probówek również, co 1 minutę po 5 cm³ H₂SO₄ zatkać korkiem i wymieszać. Barwa roztworu w tej reakcji jest trwała przez dłuższy czas, dlatego nie trzeba jej natychmiast odczytywać.

Wzorce: przygotować serię wzorców H₂O₂ tzn. do 5 probówek odmierzyć po 3 cm³ mieszaniny substrat + bufor [6]. Do pierwszej probówki dodać (ze stoperem) 1 cm³ wody, do drugiej 1 cm³ H₂O₂ o stężeniu 0,08 µmol/cm³, do trzeciej 1 cm³ H₂O₂ o stężeniu 0,2 µmol/cm³, do czwartej 1 cm³ H₂O₂ o stężeniu 0,4 µmol/cm³ i do piątej 1 cm³ H₂O₂ o stężeniu 1,2 µmol/cm³. Po 15 minutach dodać do każdego wzorca po 5 cm³ H₂SO₄, zatkać korkiem i wymieszać.

Ekstynkcję wzorców i prób badanych zmierzyć na spekolu przy 530nm. Sporządzić krzywą wzorcową i odczytać z niej ilość wytworzonego H₂O₂ w próbach. Sporządzić wykres zależności wytworzonego H₂O₂ od pH, w którym działała oksydaza glukozowa.

Zadanie 2. Badanie pH stabilności oksydazy glukozowej

Preinkubacja: 10 wartości pH, , czas 40 minut.

Do 10 probówek odmierzyć po 2 cm³ buforu [2]: kolejno do pierwszej probówki o pH 2,6 do drugiej o pH 3,2 itd. do dziesiątej o pH 8,0. Probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze i dogrzewać ok. 10 minut. Do każdej probówki dodać kolejno, co minutę (stoper) po 2 cm³ oksydazy glukozowej [3b] o stężeniu 4 mg%. Inkubować enzym z buforem w tej temperaturze dokładnie 40 minut.

Przerywanie preinkubacji i rozcieńczanie

Przygotować 10 probówek z 9 cm³ oziębionego buforu [2 poz.6] o pH 5,6. Do tych probówek odmierzać kolejno po 1 cm³ z każdego preinkubowanego (przez 40 minut) roztworu enzymu i dobrze zamieszać.

Oznaczanie aktywności enzymu po preinkubacji

Przygotować następną serię 10 probówek z 3 cm³ mieszaniny substrat + bufor [6]. Do każdej z nich odmierzyć kolejno (ze stoperem) po 1 cm³ roztworu enzymu z etapu 2, wymieszać. Inkubację prowadzić w temperaturze pokojowej. Dokładnie po 15 minutach przerwać reakcję dodając po 5 cm³ H₂SO₄ zatkać korkiem i wymieszać. Dołączyć serię wzorców H₂O₂. Odczytać ekstynkcję przy 530 nm. Można ilość wytworzonego H₂O₂ dla preinkubacji enzymu z buforem o pH 5,6 przyjąć za 100% a pozostałe wyrazić w % od tej wartości.

Zadanie II:

Do trzech probówek (a, b, c) odmierzyć po 5 cm³ buforu: do pierwszej o pH 2.6, do drugiej o pH 5.6 i do trzeciej o pH 8,0. Probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 35^oC i dogrzewać ok. 10 minut. W tym czasie przygotować 3 x po 5 (dla a, b i c) probówek z 9 cm³ oziębionego buforu o pH 5,6.

Etap 1 - Preinkubacja: 3 wartości pH, 35^oC, czas 5, 10, 15, 20 i 30 minut

Do buforów w łaźni dodać (ze stoperem) po 5 cm³ roztworu oksydazy glukozowej [3b] o stężeniu 4 mg%. Do pierwszej probówki (a) w czasie 0, do drugiej (b) w 1 minucie i do trzeciej (c) w 2 minucie, dobrze wymieszać. Następnie odbierać z nich i przenosić do probówek zawierających bufor o pH 5,6 po 1 cm³ roztworu w czasie (a) 5, 10, 15, minut, z drugiej probówki (b) w 6, 11, 16, minucie i z trzeciej probówki (c) w 7, 12, 17, minucie.

Etap 2 - Oznaczanie aktywności enzymu po preinkubacji i rozcieńczeniu

Przygotować 3 (a, b, c) x 5 probówek z 3 cm³ mieszaniny substrat + bufor [6]. Do pierwszych pięciu probówek dodawać kolejno, co 1 minutę (stoper) po 1 cm³ roztworów z serii (a). Inkubację prowadzić w temperaturze pokojowej. Dokładnie po 15 minutach przerwać reakcję dodając kolejno do każdej probówki po 5 cm³ H₂SO₄. Tak samo postępować z serią (b) i (c). Zmierzyć ekstynkcję.

Sporządzić wykres aktywności enzymu dla różnych czasów preinkubacji w pH 2,6 i 8,0 w stosunku do pH 5,6 (przyjętego jako 100%).

Fotometria absorpcyjna – wprowadzenie do metod

Fotometria absorpcyjna jest jedną z metod, która wykorzystuje wykazywane przez różne substancje zjawisko absorpcji promieniowania elektromagnetycznego. Wielkość absorpcji promieniowania o określonej długości fali, może być miarą ilości substancji absorbującej. Jest to podstawa fotometrycznej analizy ilościowej. Metodami spektrofotometrycznymi można oznaczać zarówno stężenie substancji posiadających własną barwę jak i substancji bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich metod przeprowadza się w związki barwne. W tym drugim przypadku reakcja barwna musi przebiegać szybko i do końca a powstałe związki barwne winny być dostatecznie trwałe, niewrażliwe na działanie światła i mało zależne od zmian pH, temperatury i nadmiaru odczynnika. Jednym z najważniejszych warunków jest aby odczynnik reagował jedynie z substancją badaną i nie dawał barwy z żadną inną substancją w roztworze tj. aby reakcja barwna była specyficzna. Metody fotometrii absorpcyjnej należą do najszybszych i najłatwiejszych technik analitycznych. Odznaczają się one ponadto uniwersalnością, dokładnością i czułością, przewyższając pod tym względem inne metody. Niektóre substancje można bowiem oznaczyć nawet w ilości 0,05 mg/ml roztworu. Metody fotometrii absorpcyjnej charakteryzują się łatwością ich zastosowania, możliwością automatyzacji oznaczeń, przydatnością do analizy dużej ilości próbek ; a także łatwością opracowania wyników poprzez komputeryzacje obliczeń. Z uwagi na stosowany rodzaj światła fotometrię absorpcyjną można podzielić na: fotometrię w pełnym zakresie światła widzialnego, fotometrię gdzie stosuje się filtry barwne o określonej charakterystyce tj. kolorymetrię; fotometrię gdzie używa się światła monochromatycznego tzw. Spektrofotometrię w zakresie światła widzialnego i fotometrię absorpcyjną w zakresie światła niewidzialnego a więc promieni UV a także promieni podczerwonych IR. Powszechnie stosowana jest fotometria absorpcyjna w zakresie światła widzialnego gdzie w specjalnych przyrządach, spektrofotometrach uzyskuje się dzięki siatkom dyfrakcyjnym bądź pryzmatom światło monochromatyczne wysoce selektywne w pochłanianiu barwy określonych składników.

Natężenie wiązki promieniowania magnetycznego ulega po przejściu przez materię zmniejszeniu głownie w wyniku pochłonięcia czyli absorpcji. Ilościowe zmiany energii promieniowania w procesie absorpcji przez cząsteczki substancji opisują prawa absorpcji. Mówią one, że natężenie światła maleje wykładniczo w stosunku do grubości warstwy barwnego roztworu (prawo Lamberta) oraz maleje wykładniczo w stosunku do stężenia barwnego związku w roztworze ( prawo Beeera). Z połączenia tych praw ( prawo Lamberta-Beeera) wynika zależność:

= e^-kcl

gdzie:

I- natężenie światła przepuszczonego

e- podstawa logarytmów naturalnych

c - stężenie barwnej substancji

l - grubość warstwy roztworu barwnej substancji

k - współczynnik zależny od natury barwnej substancji i długości fali światła.

Po przeliczeniu na logarytmy dziesiętne współczynnik k przyjmuje symbol ε = 0,4343 k, a równanie postać:

log = ε ^. c ^. l

W teorii fotometrii absorpcyjnej wyróżnia się następujące wielkości:

1. transmisja (ułamek promieniowania przechodzącego) T

   T = lub % T

2. absorpcja A – ułamek promieniowania zaabsorbowanego

   A= lub % A

3. logarytm z transmisji (transmitancja)

   log T = log

4. logarytm z odwrotności transmisji ( logarytm ujemny z transmisji ) log jest to tzw. absorbancja inaczej ekstynkcja E lub gęstość optyczna OD.

To właśnie absorbancja jest proporcjonalna d stężenia barwnej substancji roztworze i grubości warstwy.

E = A = OD = ε ^. c ^. l

Wartość ε jest molowym współczynnikiem ekstynkcji jeśli absorbancja roztworu o stężeniu 1 mol/dcm³ mierzona jest w warstwie grubości . O współczynniku ekstynkcji właściwej mówimy jeśli absorbancja substancji o stężeniu 1 g/dcm³ mierzona jest w warstwie o grubości 1cm . Stężenie substancji barwnej można podawać także w innych wielkościach np. w %, mg% (mg/100cm³). W tych przypadkach współczynnik ekstynkcji będzie liczbowo przyjmował inne wartości. W analizie spektrofotometrycznej wartością poszukiwaną jest stężenie (c) zaś wielkością mierzoną absorbancja (A).

Uwagi praktyczne

W każdej metodzie spektrofotometrycznej podaje się w jakim przedziale stężeń badanej substancji może być stosowana. Pomiar absorbancji badanych próbek wymaga zawsze porównania z roztworami wzorcowymi o znanym stężeniu. Sporządzenie serii roztworów wzorcowych badanej substancji i zmierzenie ich absorbancji jest niezbędne przy każdej z serii pomiarów. Absorbancja próby odczynnikowej nosi nazwę próby ślepej lub kontroli. Mierzenie absorbancji prób badanych jak i roztworów wzorcowych powinno odbywać się w tych samych warunkach analitycznych oraz w tych samych naczyńkach. Chodzi o to aby grubość warstwy była ta sama a warunki pomiarów jednakowe.

W automatycznych, skomputeryzowanych spektrofotometrach przyrząd samoczynnie wykonuje obliczenia współczynnika absorbancji. W oparciu o odczytane wzorce i w oparciu o ten współczynnik wylicza stężenie badanej substancji w próbkach. W przyrządach nieautomatycznych badacz musi te wyliczenia wykonać sam. Zazwyczaj sporządza się wykres gdzie na osi rzędnych zaznacza się mierzoną absorbancję a na osi odciętych zaznacza się stężenie substancji barwnej. Wykres sporządza się w oparciu o mierzoną absorbancję prób wzorcowych uzyskując krzywą wzorcową. Jest to linia obrazująca wzrost absorbancji roztworów wzorcowych w miarę zwiększania ich stężenia.

Stężenie substancji w próbach badanych można odczytywać graficznie bezpośrednio z krzywej bądź też w przypadku dużej ilości próbek i dobrej prostoliniowości krzywej wzorcowej można wyliczyć współczynnik absorbancji (ε) dla danej substancji w określonych warunkach pomiaru. Dzieląc przez ten wspólczynnik absorbancje badanych próbek można wyliczyć stężenie substancji w tych próbkach. Pierwsza metoda jest mniej dokładna i można się nią posługiwać przy małej ilości próbek bądź gdy krzywa wzorcowa nie jest prosta. Możliwość wyliczenia ilości substancji w badanych próbkach za pomocą obliczonego wcześniej współczynnika absorbancji (ε) jest metodą nadającą się do obliczeń w przypadku większej ilości próbek. W jednym i drugim przypadku uzyskujemy wynik, którym jest stężenie substancji wyrażone np. w mol/ml czy g/100 ml w danych próbkach. Warto nadmienić, że często na osi odciętych obok wartości określających stężenie substancji podaje się ilość substancji w konkretnej objętości próbki. Oba sposoby-stężeniowy albo ilościowy-są dobre. Nie mniej nie należy tych sposobów mylić.

Całkowitą ilość badanej substancji w próbie wylicza się mając na względzie rozcieńczenia jakich trzeba było dokonać przed analizą spektrofotometryczną.